胡一迪,胡孝渠,李權(quán),喻明霞

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 臨床系，浙江 溫州，325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430072)

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Survivin，caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達(dá)程度分析

胡一迪1,胡孝渠2,李權(quán)2,喻明霞3

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 臨床系，浙江 溫州，325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430072)

目的 探討survivin、caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達(dá)程度及其意義，為乳腺相關(guān)疾病的診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。方法 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)切除病理標(biāo)本人乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌病例蠟塊標(biāo)本，用免疫組化法(SP)檢測survivin和caspase-8在各病理類型組織中表達(dá)的情況。結(jié)果 在乳腺增生乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin表達(dá)的陽性率分別為(89.00±1.38)%、(89.85±1.55)%和(85.72±1.10)%)，3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；caspase-8在乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌表達(dá)的陽性率分別為(75.03±1.32)%、(73.59±1.08)%和(72.80±1.17)%，3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Survivin在3種乳腺相關(guān)疾病中的表達(dá)程度由高到低依次為乳腺癌癌前病變> 乳腺增生>乳腺癌；caspase-8在3種乳腺相關(guān)疾病中的表達(dá)程度由高到低依次為乳腺增生>乳腺癌癌前病變>乳腺癌。Survivin和caspase-8的聯(lián)合檢測有助于對3種疾病的診斷提供參考依據(jù)。

乳腺增生；乳腺癌癌前病變；乳腺癌； survivin；caspase-8

Survivin為凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins，IAP)，能夠抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂，可在常見的多種惡性腫瘤中表達(dá)，且表達(dá)與病程進(jìn)展相關(guān)，比如，宮頸癌、黑色素瘤、III～I(xiàn)V期神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及淋巴瘤等[1-3]，但是不在成人正常組織和癌旁正常組織中表達(dá)[4]。在生理的狀態(tài)下，只在成人分泌期子宮內(nèi)膜、胚胎、胎盤和睪丸之中表達(dá)。

Caspase蛋白激酶為凋亡的執(zhí)行、調(diào)控蛋白。與正常的細(xì)胞相比較，caspase-8在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)處于缺失或者抑制狀態(tài)，但是此類缺失為細(xì)胞無法啟動和最終凋亡的一個重要原因[5]。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中的caspase-8并不是完全缺失，而且臨床預(yù)后同表達(dá)的高低有非常密切的關(guān)系[6-7]。

最新的研究表明，并非全部caspase-8高表達(dá)的細(xì)胞自身都會發(fā)生凋亡，也非所有癌細(xì)胞內(nèi)的caspase-8都有缺失。本研究對survivin和caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達(dá)程度進(jìn)行了分析，以期為survivin和caspase-8對腫瘤細(xì)胞具體作用機(jī)理的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 本課題實(shí)驗(yàn)所選取的臨床病例及標(biāo)本均已取得了患者及其家人的知情同意,并簽署知情同意書，且通過本醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。收集2010年9月～2013年9月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的乳腺手術(shù)標(biāo)本。蠟塊存檔共90例，均是女性患者。取乳腺腫塊，病理診斷為乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌，術(shù)前均未經(jīng)放化療及免疫治療的標(biāo)本蠟塊。乳腺增生、乳腺癌和乳腺癌癌前病變均為30例。采用切片機(jī)對標(biāo)本蠟塊連續(xù)橫斷面的切片處理。每一個蠟塊切取2張切片，片厚為4 μm，總共180張。

1.2 主要試劑 Caspase-8抗體、兔抗人survivin抗體(北京中山生物工程公司)；原位凋亡檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 玻片的處理與切片 硫酸清潔液浸泡玻片5 h，用流水沖洗20 h。鉻礬明膠作防脫片處理洗凈烤干后的玻片。玻片經(jīng)蒸餾水清洗后，于95%的乙醇中浸泡過夜。撈出95%乙醇中的玻片，置于片架上，再放入45 ℃烤箱內(nèi)，烤1 h左右至干。在70 ℃的100 mL去離子水中溶解0.59 g優(yōu)質(zhì)明膠，冷卻至室溫。明膠的溶液中加入50 mg KCrSO4·12H2O，配成鉻礬明膠。冰浴至4 ℃后再使用鉻礬明膠。

鉻礬明膠中浸泡清潔后的玻片1 min。取出玻片，置于玻片架上。放置在45 ℃的恒溫箱中，過夜，玻片備用。標(biāo)本都要經(jīng)過連續(xù)的切片，厚度為4 μm，放于備用玻片上。為使組織緊貼于玻片，玻片放于60 ℃的烤箱中烤1 h。

1.4 SP法檢測caspase-8和survivin蛋白的表達(dá) 采用SP法，按照試劑盒的說明要求進(jìn)行操作?？筩aspase-8抗體稀釋度為1:50，兔抗人survivin抗體稀釋度為1:20。DAB染色后蘇木素復(fù)染，在顯微鏡下觀察判斷結(jié)果。

1.5 免疫組化結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn) 以背景清晰，排除非特異染色為前提。陽性結(jié)果即組織細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯棕黃色染色，陰性結(jié)果即無棕黃色染色。陽性的表達(dá)在高倍光鏡下觀察。選擇40倍物鏡，在高倍鏡下選取5個視野。陽性表達(dá)率的計(jì)算方法如下(為避免隨意性，每張切片的代表性區(qū)域選取不同視野的平均值)：陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin的陽性表達(dá)率 Survivin在不同組織中表達(dá)不同，表達(dá)程度由高到低依次為乳腺癌癌前>乳腺增生>乳腺癌，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin的陽性表達(dá)率±s)

△P<0.05，與乳腺增生比較，compared with breast hyperplasia；#P<0.05，與乳腺癌癌前病變比較，compared with breast precancerous lesion

圖1 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin的表達(dá)Fig.1 Expression of survivin in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer

2.2 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中caspase-8的表達(dá) Caspase-8在不同組織中表達(dá)不同，表達(dá)程度由高到低依次為乳腺增生>乳腺癌癌前>乳腺癌，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中caspase-8的陽性表達(dá)率±s)

△P<0.05，與乳腺增生比較，compared with breast hyperplasia；#P<0.05，與乳腺癌癌前病變比較，compared with breast precancerous lesion

圖2 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中caspase-8的表達(dá)Fig.2 Expression of caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法對人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的survivin、caspase-8的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3者中survivin、caspase-8的陽性表達(dá)率兩兩之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Survivin在乳腺癌中的表達(dá)程度最低，在乳腺癌癌前病變表達(dá)程度最高，在乳腺增生中表達(dá)程度較低；caspase-8在乳腺增生中的表達(dá)程度最高，在乳腺癌癌前病變中表達(dá)較低，在乳腺癌中表達(dá)程度最低。

細(xì)胞凋亡機(jī)制的紊亂和乳腺增生病、乳腺癌以及乳腺癌癌前病變3者的發(fā)生有密切的關(guān)系。細(xì)胞的凋亡受基因的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞存活期來發(fā)揮生物效應(yīng)是其主要的作用機(jī)制。其中，正常組織細(xì)胞調(diào)節(jié)的重要機(jī)制即細(xì)胞凋亡。Survivin是抑凋亡基因，而caspase-8是促凋亡基因，2者是當(dāng)今研究的較為重要的細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因。有研究表明，survivin能夠抑制由caspase-8誘導(dǎo)caspase的活化，以及阻止caspase-3同caspase-7自發(fā)活化的作用[8]。

多種凋亡基因表達(dá)產(chǎn)物能夠影響腫瘤細(xì)胞的凋亡。積極治療乳腺增生可延緩、阻斷和逆轉(zhuǎn)癌前狀態(tài)，對于治療此病本身也有利。因此，重視乳腺增生病的診斷和治療，有著非常重要的意義。Survivin表達(dá)增高可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而促進(jìn)其增殖，腫瘤病程的進(jìn)展同survivin的表達(dá)密切相關(guān)[9]。從而，survivin可以成為檢測惡性腫瘤的指標(biāo)，以及作為一種腫瘤標(biāo)志物。

目前，仍然沒有證據(jù)表明IAP直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，然而，其在腫瘤發(fā)病機(jī)制過程中發(fā)揮著重要作用。與其它IAP分子不同的是，survivin蛋白只有1個N-末端的重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat，BIR)結(jié)構(gòu)，卻無羧基環(huán)指的結(jié)構(gòu)[- 11]。在終末分化的成人組織中檢測不到survivin，其廣泛表達(dá)于人類多種腫瘤組織，在人胚胎組織中高度表達(dá)并參與胚胎發(fā)育過程中的組織分化以及器官的形成。Survivin作為一種新的抗凋亡基因，具有成為檢測惡性腫瘤指標(biāo)的巨大潛力，survivin可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自發(fā)性凋亡，引起細(xì)胞有絲分裂失敗，抑制腫瘤形成和生長[12-13]，survivin在腫瘤周圍正常的組織中沒有表達(dá)[14]，而在腫瘤組織中有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明，survivin的表達(dá)的細(xì)胞胞漿中主要為陽性染色，呈黃色到深棕黃色的顆粒狀。在正常乳腺組織和一般性增生的乳腺組織中，其沒有著色或者僅有輕度的著色；在乳腺癌組織和不典型的增生中，可以看見大部分的癌細(xì)胞以及增生細(xì)胞中，有不同程度著色。

某些惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素是survivin的表達(dá)，可以促進(jìn)細(xì)胞表型惡性轉(zhuǎn)化[15-16]。乳腺增生病、乳腺癌癌前病變和乳腺癌的caspase-8表達(dá)有明顯差異，表現(xiàn)為逐漸降低。細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、惡變后survivin顯著增加表達(dá)。乳腺癌癌前病變survivin的表達(dá)最高，在乳腺增生病、乳腺癌中分別降低。Survivin可直接作用于caspase，抑制其活性[17]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或者惡變時survivin表達(dá)顯著增加，在乳腺癌組織中同樣有高表達(dá)[18]，因此在乳腺病變中有重要影響。caspase-8 表達(dá)降低或基因突變與多種腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[19-20 ]。

綜上所述，caspase-8和survivin的表達(dá)程度與人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對于survivin和caspase-8的聯(lián)合檢測可能有助于對乳腺癌惡性程度的判斷和侵襲能力進(jìn)行評估，進(jìn)而為乳腺癌的預(yù)后判斷以及合理的治療提供參考。

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(編校：王儼儼，吳茜)

Analysis of survivin and caspase-8 expression in human breast hyperplasia,breast precancerous lesion and breast cancer

HU Yi-di1,HU Xiao-qu2,LI Quan2,YU Ming-xia3

(1.Department of Clinic, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Surgical Oncology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China; 3.Department of Basic Medicine, Wuhan University, Wuhan 430072, China)

ObjectiveTo analyze the expression degree of survivin and caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer.MethodsThe wax block specimens of human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer cases from the first affiliated hospital of Wenzhou medical university were selected.The expression of survivin and caspase-8 in various pathological types in the organization were detected by the immunohistochemical method(SP).ResultsThe positive expression rates of survivin in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer were (89.00±1.38)%, (89.85±1.55)% and (85.72±1.10)%, respectively, the differences between every two groups were all significant (P<0.05); the positive expression rates of caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer were (75.03±1.32)%, (73.59±1.08)% and (72.80±1.17)%, respectively, the differences between every two groups were all significant(P<0.05). ConclusionThe expression degree of survivin in three breast-related disease from high to low was breast precancerous lesion>breast hyperplasia >breast cancer; the expression degree of caspase-8 three breast-related disease from high to low was breast hyperplasia >breast precancerous lesion>breast cancer.The combination detection of survivin and caspase - 8 expression in tumor cells provides foundation for diagnose breast-related disease.

breast hyperplasia; breast precancerous lesion; breast cancer; survivin; caspase-8

2009博士點(diǎn)基金(20090141120025)

胡一迪，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：乳腺腫瘤，E-mail：hyd13957741890@163.com。

R36

A

1005-1678(2015)01-0100-03