汪玉馨,金衛(wèi)紅,宗衛(wèi)峰,黃青,陸益紅,史清水

(江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210008)

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縮宮素注射劑高分子量物質(zhì)及過(guò)敏反應(yīng)研究

汪玉馨,金衛(wèi)紅,宗衛(wèi)峰,黃青,陸益紅,史清水

(江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210008)

目的 針對(duì)縮宮素注射劑在臨床上可引起過(guò)敏性休克，水潴留等過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，考察縮宮素注射劑中的高分子量物質(zhì)與其過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)性。方法 采用凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)其原料及其制劑中的高分子量物質(zhì)進(jìn)行研究，截留高分子物質(zhì)，并進(jìn)行豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏(active systemic anaphylaxis， ASA)試驗(yàn)及皮膚被動(dòng)過(guò)敏(passive cutaneous anaphylaxis， PCA)試驗(yàn)。結(jié)果 提取制備的縮宮素原料及注射用縮宮素中均檢出分子量大于5000的高分子物質(zhì)，注射用縮宮素及其截留高分子物質(zhì)(MW>5000)的溶液ASA試驗(yàn)為陰性，但PCA試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。178批合成縮宮素注射液均未檢出分子量大于1500的高分子物質(zhì)，過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。結(jié)論 提取工藝生產(chǎn)的注射用縮宮素或有可能造成過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，與該品種中檢出的高分子物質(zhì)存在有一定的關(guān)聯(lián)性，有必要在生產(chǎn)工藝中控制高分子量物質(zhì)的產(chǎn)生。

縮宮素注射劑；凝膠過(guò)濾色譜法；全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)；皮膚被動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)

縮宮素為含二硫鍵的9個(gè)氨基酸組成的肽。其6個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與3個(gè)氨基酸構(gòu)成的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，為其發(fā)揮特異性興奮子宮作用所必要。其結(jié)構(gòu)與人體垂體后葉產(chǎn)生的天然催產(chǎn)素相同。目前臨床上常用的縮宮素是從豬的垂體后葉中提取或化學(xué)合成的。它具有選擇性興奮子宮平滑肌的作用，主要用于催產(chǎn)、引產(chǎn)和產(chǎn)后止血等[1]。除偶有惡心、嘔吐、心率增快或心律失常，臨床上還可能引起皮疹，藥熱，面部潮紅或蒼白，氣喘，心悸，胸悶，腹痛，過(guò)敏性休克，水潴留等過(guò)敏反應(yīng)[2-5]。針對(duì)這些不良反應(yīng)，雖ChP 2010年版已在標(biāo)準(zhǔn)中增訂了過(guò)敏反應(yīng)試驗(yàn)，但未對(duì)樣品中的高分子量物質(zhì)進(jìn)行必要的研究，故本研究利用凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)縮宮素原料及其制劑中的高分子量物質(zhì)進(jìn)行研究，并進(jìn)行豚鼠全身主動(dòng)[6-7]及皮膚被動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)[7]，考察縮宮素中的高分子量物質(zhì)是否與其過(guò)敏反應(yīng)具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 島津LC-20 A型高效液相色譜儀：SPD-20A檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，二元泵；Agilent 1100型高效液相色譜儀：二極管陣列檢測(cè)器，ALS自動(dòng)進(jìn)樣器，二元泵；縮宮素原料5批，其中提取制備的縮宮素原料1批(批號(hào)：10007)；液相合成制備的縮宮素原料2批(批號(hào)：100912，100701)；固相合成制備的縮宮素原料2批(批號(hào)：OT-PP-20100707(95%)，100606)。縮宮素制劑共181批，全部來(lái)自全國(guó)評(píng)價(jià)性抽樣，共涉及8個(gè)生產(chǎn)單位，其中縮宮素注射液178批，均由液相合成原料而來(lái)；注射用縮宮素共3批樣品，由提取原料生產(chǎn)而成。健康合格白色豚鼠，雌雄各半，購(gòu)自無(wú)錫巿惠山江南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2009-0005。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：參照《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))》第十六冊(cè)胸腺肽溶液高分子量物質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)[8]，用凝膠色譜柱(TSK GEL 2000SWxl 7.8 mm×300 mm，5 μm)，以三氟醋酸-乙腈-水(0.05:10:90)為流動(dòng)相；柱溫30 ℃；流速為0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。理論板數(shù)按核糖核酸酶A計(jì)算應(yīng)大于5000，分離度按相鄰峰高與峰谷之比計(jì)算大于3.0(見(jiàn)圖1)。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig.1 The chromatogram of system suitability test

1.2.2 線性：分取核糖核酸酶A(分子量137000)、胰島素(分子量5808)、胸腺肽α1(分子量3108)、生長(zhǎng)抑素(分子量1638)標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相制成每1 mL中各含1 mg的溶液，另取縮宮素(分子量1007)標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相制成每1 mL中含10 IU的溶液，各取前述4種溶液各50 μL，縮宮素溶液150 μL，5種溶液混合制成分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液。取分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 μL注入液相色譜儀記錄色譜圖進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察。并以各峰的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)為0.90(見(jiàn)表1，圖2)。

表1 分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液的各項(xiàng)參數(shù)

圖2 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Molecular weight standard curve

1.3 縮宮素樣品測(cè)定 取5批縮宮素原料用水稀釋配制成濃度約80 IU/mL的溶液。取上述溶液20 μL注入液相色譜儀記錄色譜圖進(jìn)行考察。

取3批注射用縮宮素樣品用水稀釋配制成10 IU/mL的供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。取178批縮宮素注射液樣品直接測(cè)定。分取上述溶液50 μL注入液相色譜儀記錄色譜圖進(jìn)行考察。

1.4 豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn) 取本品用氯化鈉注射液稀釋制成0.2 U/mL的溶液。取豚鼠6只，2天1次，給予每只動(dòng)物0.5 mL各組相應(yīng)的供試藥液，連續(xù)3次，然后分別于末次給藥后的14 d和21 d，給予每只動(dòng)物前肢靜脈注射各組1.0 mL相應(yīng)的供試藥液激發(fā)注射。觀察各組動(dòng)物在激發(fā)注射后30 min內(nèi)是否出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。

1.5 豚鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn) 設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照組、受試物組。陰性對(duì)照組用氯化鈉注射液，陽(yáng)性對(duì)照組用新生牛血清10倍稀釋液，受試物組用氯化鈉注射液稀釋制成0.2 U/mL的溶液。致敏每組6只，激發(fā)每組4只，均為雌雄各半。按無(wú)菌操作方法，隔日腹腔注射0.5 mL致敏，共計(jì)注射5次，然后于最后1次致敏注射后第10天，股動(dòng)脈采血，分離血清，將各組6只豚鼠的血清分別混合，-20 ℃保存，2周內(nèi)備用。然后取豚鼠兩側(cè)背部預(yù)先剪毛，于剪毛處皮內(nèi)注射抗血清各0.1 mL。經(jīng)48 h后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的1%伊文思藍(lán)染料溶液，1 mL/只。30 min后麻醉處死各組動(dòng)物，剪取背部皮膚，測(cè)量皮膚內(nèi)層的斑點(diǎn)大小，直徑大于5 mm者判定為陽(yáng)性。本研究對(duì)8個(gè)廠家各1批縮宮素注射液(合成工藝)、3批注射用縮宮素(提取工藝)及從其中提取截留的高分子物質(zhì)(MW>5000)，用氯化鈉注射液稀釋制成每1 mL中含有0.2單位的溶液，致敏并攻擊豚鼠，考察豚鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 縮宮素樣品測(cè)定 通過(guò)對(duì)5批縮宮素原料(提取制備、固相合成制備和液相合成制備)和181批縮宮素注射劑劑(注射用縮宮素和縮宮素注射液)進(jìn)行考察比較，發(fā)現(xiàn)提取制備的縮宮素原料(圖3，圖8)及其制劑(注射縮宮素，圖4)在保留時(shí)間9.1 min左右有1較大的高分子量雜質(zhì)峰，由系統(tǒng)性適用性試驗(yàn)推測(cè)該雜質(zhì)保留時(shí)間在胰島素前，其分子量可能大于5000，故采用超濾管截留分子量大于5000的雜質(zhì)(圖5)，進(jìn)行主動(dòng)及被動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)，考察過(guò)敏反應(yīng)與該雜質(zhì)是否具有相關(guān)性。

圖3 提取制備縮宮素原料的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of oxytocin raw material from extract preparation

圖4 注射用縮宮素的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of oxytocin for injection

圖5 截留注射用縮宮素中分子量大于5000的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of oxytocin for injection after intercepting high molecular weight substances (MW>5000)

固相合成制備的原料(圖6)與液相合成制備的原料(圖7)比較，高分子量雜質(zhì)更少，其中主要雜質(zhì)為保留時(shí)間約11.1 min(雜質(zhì)1)，其位于縮宮素峰前，推測(cè)分子量在1000～1500；保留時(shí)間約16.8 min(雜質(zhì)2)，其位于縮宮素峰后，推測(cè)分子量小于1000。在對(duì)不同生產(chǎn)工藝所得原料進(jìn)行研究(圖8)，通過(guò)歸一化法計(jì)算縮宮素及各雜質(zhì)峰面積比例發(fā)現(xiàn)，固相合成工藝所生產(chǎn)的原料雜質(zhì)較少，未檢出雜質(zhì)2。而通過(guò)液相合成所得原料縮宮素溶液中均有較明顯的雜質(zhì)2存在。

圖6 固相合成制備縮宮素原料的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of oxytocin raw material from solid-phase synthesis

圖7 液相合成制備縮宮素原料的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of oxytocin raw material from liquid-phase synthesis

圖8 不同生產(chǎn)工藝縮宮素原料中高分子物質(zhì)比較Fig.8 Comparison of high molecular weight substances in oxytocin raw material by different manufacturing technique

由于本次抽樣的178批縮宮素注射液樣品均由液相合成原料制備生產(chǎn)，在對(duì)其高分子量物質(zhì)檢查中發(fā)現(xiàn)，主要高分子量物質(zhì)均為雜質(zhì)1和雜質(zhì)2(見(jiàn)圖9)，且8個(gè)生產(chǎn)單位的注射液中均未出現(xiàn)注射用縮宮素中存在的分子量大于5000的高分子量雜質(zhì)，高分子量物質(zhì)研究結(jié)果與液相合成原料的研究結(jié)果一致。通過(guò)歸一化法計(jì)算縮宮素及各高分子物質(zhì)峰面積比例發(fā)現(xiàn)，各生產(chǎn)單位雜質(zhì)1比例均相似，而對(duì)于雜質(zhì)2有明顯區(qū)別，采用同一原料的廠家E及廠家F生產(chǎn)的注射液中比例較高(見(jiàn)圖10)。

圖9 縮宮素注射液的HPLC色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of oxytocin injection

圖10 不同生產(chǎn)單位縮宮素注射液中高分子物質(zhì)比較Fig.10 Comparison of high molecular weight substances in oxytocin raw material from different manufactures

2.2 豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果 各組動(dòng)物在激發(fā)注射后30 min內(nèi)，181批樣品結(jié)果均未見(jiàn)明顯過(guò)敏反應(yīng)。

2.3 豚鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果縮宮素注射液均未發(fā)生豚鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)。而提取工藝的注射用縮宮素有2批及從注射用縮宮素提取截留的高分子物質(zhì)(MW>5000)，有1批發(fā)生明顯的被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)(見(jiàn)圖11)。

圖11 被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果A.陽(yáng)性照；B.提取工藝的注射用縮宮素;C.注射用縮宮素提取截留的高分子物質(zhì)(MW>5000)Fig.11 Results of PCA testA.positive sample B.oxytocin for imjection of extraction processC.high molecular weight substances(MW>5000)obtained from oxytocin injection

3 討論

注射用縮宮素由于原料取自提取的豬腦垂體，雜蛋白和核酸均未加控制，因此存在分子量大于5000的高分子物質(zhì)，將分子量大于5000的雜質(zhì)截留，截留前后的樣品均產(chǎn)生明顯的皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)，提示注射用縮宮素可能存在產(chǎn)生臨床不良反應(yīng)(過(guò)敏反應(yīng))的風(fēng)險(xiǎn)，因此在現(xiàn)行的注射用縮宮素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，應(yīng)對(duì)其高分子量物質(zhì)(MW>5000)進(jìn)行進(jìn)一步的控制。根據(jù)國(guó)家局對(duì)《多組分生化藥注射劑技術(shù)審評(píng)基本要求》要求，直接從動(dòng)物原材料進(jìn)行分離提取的制劑，還應(yīng)嚴(yán)格按照要求，從源頭開(kāi)始進(jìn)行全程的嚴(yán)格控制，以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于提取工藝的縮宮素可以通過(guò)超濾截留的方法去除高分子物質(zhì)，因此研究認(rèn)為有必要在生產(chǎn)工藝中控制或去除產(chǎn)生的高分子量物質(zhì)，從而降低臨床可能出現(xiàn)的過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

從對(duì)制劑生產(chǎn)原料的質(zhì)量研究情況看縮宮素注射液的原料均為液相合成工藝，九肽經(jīng)還原后不再進(jìn)行純化，因此其高分子量含量較高。而目前采用固相合成工藝可以提高縮宮素的純度達(dá)99%。一些企業(yè)已經(jīng)把使用固相合成的縮宮素做成制劑，生產(chǎn)更高質(zhì)量的縮宮素及其制劑。

過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果比較可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于注射用縮宮素的致敏性，豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)檢測(cè)并不敏感，對(duì)潛在的致敏原不能有效預(yù)測(cè)和監(jiān)控，與之相比，被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)(PCA試驗(yàn))結(jié)果更為靈敏，對(duì)潛在的致敏原有更好的預(yù)測(cè)效果。針對(duì)目前很多制劑安全性評(píng)價(jià)時(shí)只進(jìn)行ASA試驗(yàn)，而未進(jìn)行PCA試驗(yàn)，提示應(yīng)同時(shí)進(jìn)行這2種致敏試驗(yàn)的研究，才能更全面的評(píng)價(jià)藥物的致敏性，從而為臨床應(yīng)用提供更安全可靠的保障。

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[3] 統(tǒng)一藥品說(shuō)明書(shū)及批準(zhǔn)文號(hào)專項(xiàng)工作小組.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥說(shuō)明書(shū)內(nèi)容匯編7[Z].2002：755-756.

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(編校：譚玲，王儼儼)

Studies on high molecular weight substances and allergic response of oxytocin injection

WANG Yu-xin,JIN Wei-hong,ZONG Wei-feng, HUANG Qing,LU Yi-hong,SHI Qing-shui

(Jianysu Province Food and Drug Supervision and Inspection Institute, Nanjing 210008, China)

ObjectiveTo investigate the high molecular weight substances in oxytocin injection and their relationships with the occurrence of allergic response including anaphylacticshock,water retention induced by oxytocin injection.MethodsGel-filtration chromatography was used to investigate high molecular weight substances in raw material and injections.Active systemic anaphylaxis (ASA ) test and passive cutaneous anaphylaxis (PCA) test were conducted on guinea pigs before and after the interception of high molecular weight substances.ResultsHigh molecular weight substances (MW>5000) were detected in raw material and injections from the extract preparation, which showed positive results in PCA tests before and after the interception, while ASA tests were all negative.However, no high molecular weight substances (MW>1500) were found in 178 batch injections from synthesis.ASA test and their PCA test were both negative. ConclusionAllergic response may occur while using injections from the extract preparation, which has a certain correlation with the high molecular weight substances (MW>5000).Therefore, the control of high molecular weight substances (MW>5000) in preparation is necessary.

oxytocin injection; gel-filtration chromatography; active systemic anaphylaxis test; passive cutaneous anaphylaxis test

汪玉馨，女，碩士，主管藥師，研究方向：藥檢藥理毒理，E-mail：wyx_carrie@163.com。

R967

A

1005-1678(2015)01-0085-04