陳肖,王棟棟,魏彤,何素梅,宋一帆,魏群利,2Δ

(1.徐州醫(yī)學(xué)院 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院 臨床藥理教研室，江蘇 徐州 221004)

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黃芪總皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及iNOS/NO表達(dá)的影響

陳肖1,王棟棟1,魏彤1,何素梅1,宋一帆1,魏群利1,2Δ

(1.徐州醫(yī)學(xué)院 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院 臨床藥理教研室，江蘇 徐州 221004)

目的 探討黃芪總皂苷(astragalosides，AST)對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(MCs)增殖、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)及一氧化氮(NO)含量的影響。方法 將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為正常組、甘露醇組、高糖組及高糖+ AST(50、100、200 μg/mL)組。MTT法觀察細(xì)胞增殖情況；Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞iNOS表達(dá)；Griess比色法檢測(cè)各組培養(yǎng)上清中NO水平。結(jié)果 與正常組比較，高糖組培養(yǎng)24、48 h MCs增殖顯著，胞內(nèi)iNOS表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)、NO含量增加(P<0.01)；與高糖組比較，各濃度AST干預(yù)組均能抑制MCs的增殖，并顯著抑制 iNOS表達(dá)、減少NO的含量。結(jié)論 AST能抑制高糖誘導(dǎo)下MCs的過度增殖；下調(diào)iNOS表達(dá)、降低NO含量，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病腎臟的保護(hù)作用。

黃芪總皂苷；腎小球系膜細(xì)胞；細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；一氧化氮

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1]，其基本病理改變?yōu)槟I小球系膜細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的異常積聚[2]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與遺傳因素[3]、血流動(dòng)力學(xué)、糖代謝紊亂[4]、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[5-11]等有關(guān)。近年來研究表明，iNOS表達(dá)上調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致一氧化氮(intrarenal nitric oxide，NO)釋放的增加是早期DN發(fā)病機(jī)制的主要因素之一[12-13]。因此，抑制系膜細(xì)胞過度增殖[14]、下調(diào)iNOS表達(dá)從而減少NO的產(chǎn)生可在早期獲得較好的防治糖尿病腎病的效果。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，主要成份是黃芪總皂苷，有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)保護(hù)作用[15-17]，并已應(yīng)用于臨床治療糖尿病腎病[18-20]，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究AST對(duì)高糖誘導(dǎo)的MCs過度增殖、iNOS表達(dá)及NO生成的影響，進(jìn)而探討其對(duì)DN防治作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HBZT-1大鼠腎小球系膜細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；黃芪總皂苷購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)ZA0424LA13，UV≥98%；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；4-甲基偶氮唑藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔多克隆抗iNOS抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔多克隆抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔、總一氧化氮試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；甘露醇購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制：黃芪總皂苷用DMEM高糖培養(yǎng)基配成20 mg/ mL貯液，-20 ℃保存。臨用前，用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成50、100、200 μg/mL。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：HBZT-1大鼠腎小球系膜細(xì)胞接種于含10%新生牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、33.7 mg/L NaHCO3的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：MCs以適當(dāng)密度接種，同步化4 h后，分為6組：正常組(NG組，5.56 mmol/L葡萄糖)、甘露醇組(MA組，5.56 mmol/L葡萄糖 + 24.44 mmol/L甘露醇)、高糖組(HG組，30 mmol/L葡萄糖)和高糖+AST(50、100、200 μg/mL)。

1.2.4 MTT測(cè)定細(xì)胞的增殖：用DMEM培養(yǎng)基制成5×104/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄上清加入無血清正常DMEM培養(yǎng)基，同步化4 h后，在培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間段后(24、48 h)，每孔加入MTT溶液20 μL(濃度為5 mg/mL)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min。利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)：MCs按各處理因素處理24、48 h后，冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取80 μg蛋白上樣量，經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；膜在5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔多克隆抗iNOS抗體(1:200)，4 ℃封閉過夜；TBST充分洗滌后，加堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1:1000)，室溫孵育2 h。滴加BCIP/NBT顯色液，避光顯色15 min。

1.2.6 Griess法檢測(cè)培養(yǎng)上清中NO水平：MCs培養(yǎng)24、48 h，收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，操作步驟按試劑盒說明書完成。酶標(biāo)儀550 nm處測(cè)吸光度值，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，取均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔作出亞硝酸鉀濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣品孔吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得各樣孔濃度，記作上清中NO水平。

2 結(jié)果

2.1 AST對(duì)MCs的增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示：高糖組培養(yǎng)24 h、48 h MCs增殖顯著高于NG組(P<0.01)，而各AST干預(yù)組均能抑制MCs的增殖，并在24 h、48 h均具有劑量依賴性，見圖1。

圖1 黃芪總皂苷對(duì)MCs增殖的抑制作用**P< 0.01，與NG組比較；# P<0.05，##P<0.01，與HG組比較；△P<0.05，△△P<0.01，與前一個(gè)組比較Fig.1 Effects of AST on the MC proliferation**P< 0.01,compared with NG group; # P<0.05,##P<0.01, compared with HG group; △P<0.05，△△P<0.01,compared with former group

2.2 AST對(duì)MCs中iNOS蛋白表達(dá)的影響 與NG組比較，HG組在 24、48h時(shí)，iNOS蛋白水平明顯增高(P<0.01)；與HG組相比，24 h AST的中劑量組與高劑量組iNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖2；而48 h AST各劑量組iNOS蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。

圖2 24 h時(shí)各組iNOS的表達(dá)量**P< 0.01，與NG組比較；##P<0.01，與HG組比較；△P<0.05，與前一個(gè)組比較Fig.2 Relative quantity of iNOS at 24 h**P< 0.01,compared with NG group;##P<0.01, compared with HG group;△P<0.05,compared with former group

2.3 AST對(duì)MCs中NO生成的影響 在高糖的刺激下，24 h、48 h MCs釋放NO的量增加，與NG組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明高糖能明顯誘導(dǎo)MCs釋放NO，而各AST組對(duì)高糖誘導(dǎo)MCs過度釋放NO均有抑制作用，并在48 h時(shí)呈良好的劑量依賴性，見表1。

表1 各組培養(yǎng)液上清中NO含量±s)

**P< 0.01，與NG組比較，compared with NG group；#P<0.05，##P<0.01，與HG組比較，compared with HG group；△P<0.05，△△P<0.01，與前一個(gè)組比較，compared with former group

3 討論

DN的病理進(jìn)程是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中腎小球系膜細(xì)胞增殖、NO生成的增加在DN的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[21]。

腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的固有細(xì)胞，正常情況下，由于抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖因子的存在，其生長(zhǎng)和分裂速率很慢[22]。病理?xiàng)l件下，腎小球系膜細(xì)胞增殖活躍、系膜細(xì)胞肥大，繼而引發(fā)腎小球纖維化，最終導(dǎo)致腎小球硬化[14,23-24]。在本實(shí)驗(yàn)中MTT結(jié)果顯示AST對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用并具有劑量依賴性，與孫晉芳等[25]的研究結(jié)果一致。

NO是一個(gè)具有廣泛生理活性的小分子，可由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成。由于NO對(duì)腎臟入球小動(dòng)脈的擴(kuò)張作用遠(yuǎn)大于出球小動(dòng)脈，直接參與了糖尿病早期腎小球高灌注和高濾過的形成[26]，進(jìn)而產(chǎn)生蛋白尿，最終導(dǎo)致腎小球硬化，引起終末期腎衰。NOS可分為兩大類，一類是構(gòu)成型一氧化氮合酶(constitutive NOS，cNOS)，包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases，eNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)，是許多正常組織中基本存在的一種酶；另一類是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)，只在細(xì)胞受到刺激如微生物內(nèi)外毒素、炎癥介質(zhì)(腫瘤壞死因子、白介素)等的傷害后才表達(dá)[27]。研究表明正常生理?xiàng)l件下，人或動(dòng)物只有出、入球小動(dòng)脈和腎小球的內(nèi)皮、上皮細(xì)胞中檢測(cè)到eNOS，是正常腎臟產(chǎn)生NO的主要來源。iNOS在正常腎小球中少有檢測(cè)到，在各種炎癥病理?xiàng)l件下iNOS誘導(dǎo)表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)下大鼠MCs的iNOS表達(dá)增強(qiáng)，NO合成增加，與汪建云等[30]研究一致。AST和高糖共同培養(yǎng)MCs，發(fā)現(xiàn)24、48h時(shí)，AST各濃度組均能下調(diào)MCs的iNOS表達(dá)、降低NO的含量，并在48 h時(shí)對(duì)NO的抑制具有劑量依賴性。

綜上所述，AST可顯著降低高糖誘導(dǎo)的MCs過度增殖；同時(shí)下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)、降低NO含量，這可能是黃芪總皂苷防治糖尿病腎病的機(jī)制之一。

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(編校：吳茜)

Effect of astragalosides on proliferation and expression of iNOS/NO in rat mesangial cells cultured with high glucose

CHEN Xiao1,WANG Dong-dong1,WEI Tong1,HE Su-mei1,SONG Yi-fan1,WEI Qun-li1,2Δ

(1.Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China;2.Department of Clinical Pharmacology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

ObjectiveTo investigate the effect of astragalosides (AST)on proliferation and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS)and nitric oxide (NO)in rat mesangial cells (MCs)cultured with high glucose.MethodsRat mesangial cells were divided into normal group, mannitol group, high glucose group and high glucose + (50, 100, 200 μg/mL)AST group.The proliferation of mesangial cells was observed by MTT assay.The expression of iNOS protein was detected by Western blot and the NO level in the supernatant was determined by Griess method.ResultsCompared with normal group, MCs proliferation and the expression of iNOS and NO increased significantly in high glucose group at 24 h and 48 h (P<0.01).The proliferation of MCs and the expression of iNOS and NO were suppressed in high glucose + AST groups compared with HG group. ConclusionAST can suppress the proliferation of MCs cultured in high glucose and decrease the expression of iNOS and NO, which implies AST may protect the diabetic kidney.

astragalosides; mesangial cells; cellular proliferation; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide

陳肖，女，碩士，研究方向： 內(nèi)分泌藥理學(xué)及臨床藥學(xué)，E-mail：chenxiao112733@163.com；魏群利，通訊作者，男，博士，教授、碩士生導(dǎo)師、主任醫(yī)師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)及臨床藥學(xué)，E-mail：weiqunli@126.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)01-0049-03