陰新強(qiáng),敬媛媛

(1.川北醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分析中心，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000)

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側(cè)腦室注射apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的影響及機(jī)制研究

陰新強(qiáng)1,敬媛媛2Δ

(1.川北醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分析中心，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000)

目的 探討側(cè)腦室apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)活動(dòng)的影響及其作用機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，生理鹽水為對(duì)照組(i.c.v.，2 μL)、apelin-13組(0.1、0.3、1、3、10 nmol，i.c.v.，2 μL)，通過排珠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各個(gè)劑量的apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)活動(dòng)的影響；對(duì)照組(3組)分別為大鼠腹腔1次性注射2 mL的M型膽堿能受體的阻斷劑阿托品(atropine，ATR)(20 mg/kg)組、腎上腺素受體阻斷劑酚妥拉明(phentolamine，PHE)(1 mg/kg)和 普洛奈爾(propranolol，PRO)(1 mg/kg)組、N型膽堿能受體的阻斷劑六烴季銨(hexamethonium，HEX)(1 mg/kg)組； 20 min后在對(duì)照組基礎(chǔ)上，各組分別側(cè)腦室注射2 μL 1 nmol apelin-13，考察apelin-13在結(jié)腸推進(jìn)作用上的可能機(jī)制。結(jié)果 與對(duì)照組相比，apelin-13以劑量依賴的方式延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的排珠時(shí)間(P<0.01)，即抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的推進(jìn)活動(dòng)；N型膽堿能受體的阻斷劑HEX能完全消除apelin-13對(duì)結(jié)腸推進(jìn)的抑制作用；而M型膽堿能受體的阻斷劑ATR以及腎上腺素受體阻斷劑PHE和PRO都不能影響apelin-13在結(jié)腸推進(jìn)上的作用。結(jié)論 中樞apelin-13能劑量依賴的抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的推進(jìn)，它的這種作用可能是通過N型膽堿能受體實(shí)現(xiàn)的。

apelin-13；遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)；作用機(jī)制

Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體-血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ)的內(nèi)源性配體，是一種由77個(gè)氨基酸組成肽，在生物體內(nèi)存在包括apelin-36和apelin-13等在內(nèi)的多種活性片段[1]。Apelin及其受體在生物體內(nèi)分布廣泛，這就預(yù)示著其在體內(nèi)廣泛參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)apelin參與體溫的調(diào)節(jié)[2]，心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[3-4]，免疫調(diào)節(jié)[5]，以及鎮(zhèn)痛[6]和飲水進(jìn)食[7-8]等。其中，在大鼠和人的下丘腦的視上核和室旁核發(fā)現(xiàn)了有apelin的大量表達(dá)[9-10]，而該區(qū)域?qū)M(jìn)食行為有很重要的調(diào)節(jié)作用。另外，在消化系統(tǒng)的胃和腸中也發(fā)現(xiàn)有apelin的表達(dá)，這可能提示著apelin對(duì)消化系統(tǒng)的調(diào)控在外周和中樞水平均有很重要的作用，而攝食與腸運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，目前，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道過apelin對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的影響，因此本實(shí)驗(yàn)研究了apelin系列片段中作用效果最強(qiáng)的apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的影響，并用M型和N型膽堿能受體阻斷劑以及腎上腺能受體阻斷劑研究apelin-13可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 96只普通級(jí)SD系雄性大鼠，體質(zhì)量(180～250 g)，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(甘)2009-0004；本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 藥品與試劑 Apelin-13由蘭州大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所采用人工固相合成法合成，純度符合實(shí)驗(yàn)室研究要求(其序列為Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe)；阿托品(atropine，ATR)、六烴季銨(hexamethonium，HEX)、酚妥拉明(phentolamine，PHE)、普洛萘爾(propranolol，PRO)購(gòu)自西格瑪公司；0.9%生理鹽水、乙醚購(gòu)自成都科隆化工。

1.3 儀器 手動(dòng)固相多肽合成儀(100 mL)由研究所在蘭州大學(xué)化學(xué)室玻璃儀器室訂做；立體定位儀(68001)購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥：Apelin-13對(duì)結(jié)腸推進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)：將SD大鼠分為6組，每組8只：對(duì)照組(i.c.v.，2 μL)、apelin-13組(0.1 nmol、0.3 nmol、1 nmol、3 nmol和10 nmol，i.c.v.，2 μL)；Apelin-13作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)：將大鼠分為6組，每組8只：atropine(i.p., 2 mL)+生理鹽水(i.c.v.，2 μL)組, PHE+ PRO(i.p., 2 mL)+生理鹽水(i.c.v.，2 μL)組，HEX(i.p., 2 mL)+生理鹽水(i.c.v.，2 μL)組，ATR(i.p., 2 mL)+apelin-13(i.c.v.，2 μL)組； PHE+ PRO(i.p., 2 mL)+apelin-13(i.c.v.，2 μL)組，HEX(i.p., 2 mL)+apelin-13(i.c.v.，2 μL)組。各組均為1次性給藥。

1.4.2 排珠實(shí)驗(yàn)：① 將大鼠按體質(zhì)量分為6組；②在大鼠的側(cè)腦室注射2 μL生理鹽水或者2 μL apelin-13；③注射后5 min，用一個(gè)玻璃棒(直徑約5 mm)將一個(gè)直徑為5～6 mm的玻璃珠從肛門塞入大鼠的遠(yuǎn)端結(jié)腸3 cm處；在鼠籠中放入一張白紙，將大鼠放回鼠籠，觀察大鼠排出玻璃珠的潛伏期。與對(duì)照組相比，若延長(zhǎng)排出玻璃珠的時(shí)間則說明藥物能夠抑制遠(yuǎn)端結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)，反之則說明藥物能夠加快遠(yuǎn)端結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)。

1.4.3 Apelin-13作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)：①將大鼠按體質(zhì)量分為6組；②對(duì)照組(3組)大鼠腹腔分別注射2 mL的ATR、PHE﹢PRO、HEX 20 min后，在側(cè)腦室注射生理鹽水2 μL，5 min后，塞進(jìn)玻璃珠(操作同“1.4.2”項(xiàng)下)，記錄排珠潛伏期；③對(duì)另外3組大鼠腹腔分別注射2 mL的ATR、PHE﹢PRO、HEX 20 min后，在側(cè)腦室注射2 μL 1 nmol apelin-13，5 min后塞進(jìn)玻璃珠(操作“1.4.2”項(xiàng)下)，記錄排珠潛伏期，然后分別與對(duì)照組排珠潛伏期比較。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)腦室注射不同劑量的apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)活動(dòng)的影響 側(cè)腦室注射不同劑量的apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)活動(dòng)的影響見圖1。結(jié)果表明，側(cè)腦室apelin-13(0.1～10 nmol)能劑量依賴地延長(zhǎng)大鼠排出玻璃珠的時(shí)間。進(jìn)一步Post hoc分析表明，與對(duì)照組相比，1、3和10 nmol的apelin-13都能顯著延長(zhǎng)大鼠排珠時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)。

2.2 腹腔注射ATR、PHE+PRO、HEX對(duì)apelin-13抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)作用的影響 腹腔注射ATR(1 mg/kg)、PHE(1 mg/kg)+PRO(1 mg/kg) 、HEX(20 mg/kg)對(duì)apelin-13(1 nmol)抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)作用的影響見圖2。結(jié)果表明腹腔注射N型膽堿能受體阻斷劑HEX能完全拮抗apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的抑制作用，但M型膽堿能受體阻斷劑ATR以及腎上腺能受體阻斷劑PHE和PRO都不影響apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的作用。

圖2 腹腔注射ATR、PHE﹢PRO、HEX對(duì)apelin-13抑制大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)作用的影響(n=8)***P<0.001，與生理鹽水組比較Fig.2 Effect of intraperitoneal injection of ATR, PHE﹢PRO, HEX on apelin-13 inhibitory distal colonic transit in rats (n=8)***P<0.001，compared with saline group

3 討論

Apelin-13是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體—apelin在體內(nèi)存在的一種活性片段。Apelin及其受體系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布極為廣泛，如大鼠、小鼠和人的下丘腦的視上核和室旁核，這些區(qū)域參與調(diào)節(jié)進(jìn)食，在消化系統(tǒng)如胃和腸中apelin及其受體也有分布[9-11]。胃腸運(yùn)動(dòng)和攝食緊密相關(guān)，胃腸消化道可以被神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)以及與此相關(guān)的各種神經(jīng)遞質(zhì)共同組成的神經(jīng)和內(nèi)分泌的相互作用的網(wǎng)絡(luò)狀系統(tǒng)調(diào)節(jié)而產(chǎn)生對(duì)攝食和消化道運(yùn)動(dòng)的相應(yīng)的調(diào)節(jié)。胃腸道通過運(yùn)動(dòng)，可以影響機(jī)體吸收營(yíng)養(yǎng)的速度，胃腸道是各體液和神經(jīng)相互協(xié)調(diào)共同作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以對(duì)食欲進(jìn)行調(diào)控[12-13]。腸道包括遠(yuǎn)端結(jié)腸伸縮活動(dòng)也影響到食欲：其伸縮活性增強(qiáng)時(shí)勢(shì)必加速胃排空從而產(chǎn)生食欲；反之就會(huì)導(dǎo)致厭食。

Apelin-13作為一種新的胃腸肽，其在胃腸道的生理作用值得去研究，而目前還沒有文獻(xiàn)對(duì)其在大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)中的作用的報(bào)道，所以本研究采用在體動(dòng)物排珠實(shí)驗(yàn)研究了apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的影響。為了減少急性注射對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害大且注射位置容易偏差的弊端，對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究都預(yù)先用立體定位儀對(duì)側(cè)腦室定位埋管后，讓手術(shù)動(dòng)物恢復(fù)一周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射apelin-13在0.3 nmol劑量時(shí)就延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的排珠時(shí)間，即強(qiáng)烈抑制了大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的推進(jìn)活動(dòng)，在1 nmol時(shí)其抑制作用已經(jīng)達(dá)到非常顯著的效果(P<0.01)，在10 nmol時(shí)達(dá)到最強(qiáng)抑制作用；1～10 nmol的apelin-13以劑量依賴方式延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的排珠時(shí)間，即中樞apelin-13能劑量依賴地抑制小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的推進(jìn)。之前有研究證明[14]，側(cè)腦室apelin-13能劑量依賴地抑制小鼠的胃腸通過，在高劑量時(shí)能夠抑制小鼠的胃排空，這與本研究結(jié)果是一致的。

為了研究apelin-13劑量依賴地抑制遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的可能的作用機(jī)制，本研究用M型膽堿受體阻斷劑ATR、N型膽堿能受體阻斷劑HEX以及腎上腺能受體阻斷劑PHE和PRO進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，最后發(fā)現(xiàn)腹腔注射ATR、PHE和PRO本身對(duì)結(jié)腸的推進(jìn)沒有影響，它們對(duì)中樞apelin-13(1 nmol)對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸的作用沒有影響，而HEX則完全拮抗了中樞apelin-13對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的影響。本研究推測(cè)apelin-13可能是通過N型膽堿能受體通道發(fā)揮了抑制遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的作用。但另有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，中樞apelin-13能夠刺激CCK的分泌，而CCK能夠抑制腸的運(yùn)動(dòng)，所以apelin-13也可能是通過多種途徑綜合發(fā)揮了抑制遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的作用?；赼pelin及其受體系統(tǒng)在中樞分布的廣泛和胃腸道系統(tǒng)調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，apelin與其受體結(jié)合后通過N型膽堿能受體通道抑制遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(編校：王冬梅)

Effect of intracerebroventricular administration of apelin-13 on the distal colonic transit in rats and its mechanism

YIN Xin-qiang1,JING Yuan-yuan2Δ

(1.Analysis Center, School of Basic Medicine of North Sichuan Medical University, Nanchong 637000, China; 2.Department of Protective Medicine, North Sichuan Medical University, Nanchong 637000,China)

ObjectiveTo discuss the effect and mechanism of intracerebroventricular(i.c.v.)administration of apelin-13 on the distal colonic transit in rats.MethodsSD rats were randomly divided into 6 groups,8 rats for each group.Saline group as control group(i.c.v.，2 μL);apelin-13 group(0.1,0.3,1,3，10 nmol，i.c.v.，2 μL),the effects of intracerebroventricular administration of apelin-13 (0.1-10 nmol)once time on the distal colonic transit in rats detected by the bead expulsion experiments;the control group (3 group)was respectively intraperitoneal injection of N-cholinergic receptor antagonist Hexamethonium(Hex)group,M-cholinergic receptor antagonist Atropine(ATR)group,the adrenergic receptor antagonist Phentolamine(PHE)and Propranolol(PRO)group,20 min later,on the basis of control group,rats in each group were intracerebroventricular injected 2 μL 1 nmol apelin-13,studied the possible mechanism of apelin-13 on the distal colonic transit in rats.ResultsCompared with the control group,apelin-13 dose dependently prolonged bead expulsion time(P<0.01)and N-cholinergic receptor antagonist HEX could completely eliminate the inhibitory effect of apelin-13 on colonic propulsion;M-cholinergic receptor blocker ATR and adrenergic receptor antagonists PHE and PRO could not affect the effects of apelin-13 on the colonic transit in rats. ConclusionApelin-13 can dose dependently inhibit rat distal colonic transit,which may be through the N-cholinergic receptor pathway.

apelin-13;distal colonic transit;activation mechanism

國(guó)家醫(yī)學(xué)教育發(fā)展中心課題(2011-28-08-081)

陰新強(qiáng)，男，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：多肽生物化學(xué)，E-mail:yinxq06@163.com；敬媛媛，通訊作者，女，碩士研究生，副教授，研究方向：循證醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)，E-mail:stoooone@126.com。

Q514+.3

A

1005-1678(2015)01-0040-03