劉歡,江靜怡,王麗靈,劉志輝

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210036)

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阿霉素殼寡糖納米粒的制備及體外抗腫瘤研究

劉歡1,江靜怡1,王麗靈1,劉志輝2Δ

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210036)

目的 制備負(fù)載阿霉素的殼寡糖納米粒，并研究其理化性質(zhì)和體外抗腫瘤細(xì)胞毒性。方法 采用離子凝膠法制備負(fù)載阿霉素的殼寡糖納米粒；透射電鏡觀察納米粒形態(tài)，激光粒度儀測(cè)定粒徑和表面電位，紫外分光光度法測(cè)量包封率、載藥量，考察載藥納米粒的體外釋藥特性；采用MTT法對(duì)載藥殼寡糖納米粒在體外乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的細(xì)胞毒作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 制得的阿霉素殼寡糖納米粒呈球形或類球形，形態(tài)較為完整，平均粒徑為(136.77±1.21)nm，表面電位為(20.53±0.31)mV，包封率為(56.99±1.40)%，載藥量為(15.49±0.38)%，168 h的累積釋放率為72.15%；阿霉素和載藥納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用存在明顯的濃度和時(shí)間依賴性，且載藥納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間增加而逐漸強(qiáng)于游離阿霉素。 結(jié)論 此方法制備的阿霉素殼寡糖納米粒粒徑較小，藥物釋放具有明顯的緩釋作用，并具有較好的抗腫瘤作用。

殼寡糖納米粒；阿霉素；抗腫瘤作用

殼聚糖(chitosan，CS)由于具有良好的生物相容性、生物降解性而被廣泛用作抗腫瘤藥物載體[1]，但殼聚糖分子量大，只能溶解于酸性水溶液[2]；此外，消化道內(nèi)殼聚糖酶的缺乏也導(dǎo)致CS在消化道吸收的困難。這些性質(zhì)已成為了殼聚糖作為納米藥物載體應(yīng)用的限制性因素。然而，殼寡糖(chitosan oligosaccharide，CSO)即殼聚糖的降解產(chǎn)物卻可以克服這些局限性。CSO分子量低、粘度低，既保留了殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，又在一定程度上提高了其在生理?xiàng)l件中的溶解度[3-4]，且由殼寡糖分子組成的納米粒其細(xì)胞攝取作用明顯高于等濃度的殼寡糖分子，并存在明顯的濃度和時(shí)間依賴性，揭示殼寡糖納米粒作為生物大分子藥物載體有著潛在功能[5]。本文以阿霉素(doxorubicin，DOX)為模型藥物，通過研究負(fù)載阿霉素的殼寡糖納米粒的制備、表征、體外釋放規(guī)律及對(duì)人乳腺癌腫瘤MCF-7細(xì)胞株的體外生長抑制效果，探討殼寡糖納米粒作為抗腫瘤藥物載體的潛在價(jià)值，為進(jìn)一步深入研究其體外細(xì)胞靶向和體內(nèi)分布奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 殼寡糖(20131207,肇慶長龍生物科技有限公司，Mw=2000Da，脫乙酰度>90%)、三聚磷酸鈉(TPP,20130809,成都市科龍化工試劑廠)、鹽酸阿霉素(M131023,浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、四甲基偶氮噻唑鹽(MTT，Biosharp公司)、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)、MEM培養(yǎng)基(Wisent公司)、胎牛血清(1133067,Gibco公司)、0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA(3250430010,Wisent公司)、透析袋(MWCO=1000Da，美國3M公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器(江蘇城西曉陽電子儀器廠)、Zetasizer Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)、BP-211D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)、5430R高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德股份公司)、ZQTY-70振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)、Cary50紫外分光光度儀(美國Varian有限公司)、JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)、LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)、Epoch全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)、HF90/HF240CO2培養(yǎng)箱(上海力新公司)。

1.2 納米粒的制備

1.2.1 空白殼寡糖納米粒的制備：取2 mL的殼寡糖溶液(濃度為14 mg/mL)，用醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5，室溫下磁力攪拌，將3.89 mL的TPP水溶液(濃度為0.4 mg/mL)以1秒/滴的速度逐滴滴入攪拌中的殼寡糖溶液中，反應(yīng)10 min，即得殼寡糖納米粒(CSO-NPs)混懸液。

1.2.2 阿霉素殼寡糖納米粒的制備：精密稱取0.5 mg的阿霉素使之溶解于TPP溶液中，混勻，置于50 ℃恒溫水浴中保溫5 min，阿霉素即與TPP能形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物。

將2 mL的殼寡糖溶液的pH值調(diào)為5，在磁力攪拌下，將上述形成的阿霉素-TPP復(fù)合物以1秒/滴的速度逐滴滴入殼寡糖溶液中，室溫下反應(yīng)10 min，即得負(fù)載阿霉素的殼寡糖納米粒(DOX-CSO-NPs)混懸液。由于阿霉素易發(fā)生光解反應(yīng)，故有阿霉素的操作均須避光操作。

1.3 納米粒的表征

1.3.1 納米粒的平均粒徑和表面電位的測(cè)定：取DOX-CSO-NPs混懸液適量，過0.45 μm濾膜，用適量蒸餾水稀釋后用馬爾文納米粒度儀測(cè)定。

1.3.2 表面形態(tài)觀察：取少量阿霉素殼寡糖納米?；鞈乙旱沃龄佊刑寄さ你~網(wǎng)上，靜置5 min后滴加2%磷酸鎢染色，自然晾干后，于透射電鏡上觀察納米粒的形態(tài)。

1.4 包封率和載藥量的測(cè)定

1.4.1 阿霉素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取阿霉素適量，加蒸餾水配置成100 μg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密量取不同體積儲(chǔ)備液，用蒸餾水配置成濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL的阿霉素溶液。以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計(jì)在阿霉素最大吸收波長480 nm處測(cè)定吸光度，以阿霉素濃度對(duì)吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 包封率與載藥量的計(jì)算[6]：在4 ℃條件下，將阿霉素殼寡糖納米粒混懸液高速離心(15000 r/min)30 min，分離上清液。納米粒沉淀用水洗滌，冷凍干燥后稱重。上清液用蒸餾水稀釋至10 mL，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法在紫外-可見分光光度計(jì)上于480 nm處測(cè)定上清液中阿霉素的含量。所有的吸光度值均以相同條件下制得的空白納米粒的上清液為參比。

納米粒的包封率(encapsulation efficiency，EE%)和載藥量(Drug loading，DL%)的計(jì)算公式如下：包封率(EE%)=(DOX總藥量-上清液中游離的DOX藥量)/DOX總藥量×100%；載藥量(DL%)=(DOX總藥量-上清液中游離的DOX藥量)/納米粒質(zhì)量×100%。

1.5 載藥納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn) 精密移取阿霉素殼寡糖納米?；鞈乙? mL，放入預(yù)先處理好的透析袋中，用透析夾把透析袋兩端扎緊，懸浮于80 mL PBS緩沖溶液中，將其置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)透析(振蕩頻率為100 r/min)，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h取透析袋外液4 mL，在480 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)補(bǔ)充等量新鮮的磷酸鹽緩沖液。吸光度值以未載藥的空白殼寡糖納米粒在同等條件下透析的PBS緩沖液為參比。

1.6 納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞(1×105cells/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μL。置于37 ℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁過夜。實(shí)驗(yàn)分3組：游離阿霉素組(游離DOX)、空白納米粒組(CSO-NPs)和載阿霉素的納米粒組(DOX-CSO-NPs)，各組阿霉素藥物的濃度分別為0.25、0.5、1、2、4μg/mL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔與空白凋零孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)× 100%。

采用直線回歸法可以算出藥物干預(yù)24、48、72h后，游離DOX和DOX-CSO-NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50。

2 結(jié)果

2.1 在阿霉素-TPP復(fù)合物的形成過程中影響阿霉素包封率的因素 阿霉素結(jié)構(gòu)中帶有氨基，與TPP中的磷酸根離子的結(jié)合是靜電相互作用，不同的用量以及溫度、時(shí)間對(duì)結(jié)合的程度有著不同的影響，從而造成包封率的不同。一般來說，阿霉素與TPP結(jié)合的越緊密，與殼寡糖凝膠化后形成的納米粒中藥物的含量越高，從而包封率越高。

2.1.1 阿霉素用量對(duì)包封率的影響：稱取不同量的阿霉素溶于TPP溶液中，于50 ℃恒溫水浴中保溫5min，與殼寡糖溶液反應(yīng)制得載藥殼寡糖納米粒，測(cè)定其包封率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 阿霉素用量對(duì)包封率的影響Fig.1 Effect of the dosage of DOX on encapsulation efficiency

由圖所見，隨著阿霉素用量的增加，包封率呈上升的趨勢(shì)，但阿霉素用量達(dá)到0.6 mg時(shí)，阿霉素不能完全溶解于TPP溶液中，這可能說明阿霉素與TPP的結(jié)合存在飽和性，故阿霉素的用量定為0.5 mg。

2.1.2 保溫溫度對(duì)包封率的影響：稱取0.5 mg阿霉素溶于TPP溶液中，于不同的恒溫溫度下保溫5 min，待冷卻至室溫后，與殼寡糖溶液反應(yīng)形成納米粒，測(cè)定其包封率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 保溫溫度對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of the holding temperature on encapsulation efficiency

由圖可知，保溫溫度在50 ℃以下時(shí)，包封率比較低，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，包封率變化較小，這說明阿霉素與TPP的結(jié)合需要在一定的溫度范圍內(nèi)才能結(jié)合的較為緊密。雖然阿霉素對(duì)熱比較穩(wěn)定，但高溫長時(shí)間對(duì)穩(wěn)定性畢竟有一定的影響，以及從節(jié)能角度考慮，故選擇50 ℃為最佳的保溫溫度。

2.1.3 保溫時(shí)間對(duì)包封率的影響：將0.5 mg的阿霉素溶解于TPP溶液中，于50 ℃恒溫水浴中保溫不同的時(shí)間，再與殼寡糖反應(yīng)凝膠化制得納米粒，測(cè)定其包封率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 保溫時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of the holding time on encapsulation efficiency

從圖中可以看出，隨著保溫時(shí)間的增加，納米粒的包封率很快就從1 min的15%上升到5 min的51%，但時(shí)間大于5 min后，包封率基本不再上升。說明了阿霉素與TPP的結(jié)合這一過程比較快速，反應(yīng)了5 min后包封率基本達(dá)到最大值，故阿霉素與TPP溶液的保溫時(shí)間確定為5 min。

2.2 納米粒的表征

2.2.1 納米粒的平均粒徑和表面電位的測(cè)定：結(jié)果DOX-CSO-NPs納米粒的平均粒徑為(136.77±1.21)nm，平均PDI為0.202±0.02，平均電位為(20.53±0.31)mV，表明載藥殼寡糖納米粒的粒度分布較為均勻，體系較穩(wěn)定。

2.2.2 表面形態(tài)觀察：制得的DOX-CSO-NPs納米粒的形態(tài)見圖4，可見納米粒形態(tài)比較完整，呈球形或類球形。

圖4 納米粒透射電鏡圖Fig.4 TEM of DOX-CSO-NPs

2.3 包封率和載藥量的測(cè)定 阿霉素溶液的線性回歸方程為：A=0.01797C+0.00436(r=0.9995)，表明阿霉素溶液的濃度在1.25～40 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系良好。

制備3批阿霉素殼寡糖納米粒，測(cè)定其包封率和載藥量，平均包封率為(56.99±1.40)%，RSD為2.46%，平均載藥量為(15.49±0.38)%，RSD為2.46%。

2.4 載藥納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn) 載藥殼寡糖納米粒和阿霉素水溶液在PBS緩沖鹽中的釋放結(jié)果如圖5所示。

圖5 阿霉素溶液與載藥殼寡糖納米粒體外釋放曲線Fig.5 Release profiles of DOX from solution and DOX-CSO-NPs in vitro

由圖可知，DOX-CSO-NPs與阿霉素溶液相比具有明顯的緩控釋作用，對(duì)照組阿霉素水溶液在4 h內(nèi)基本完全釋放，而載藥納米粒組阿霉素的釋放可分為3個(gè)階段：初始階段阿霉素快速釋放，呈突釋現(xiàn)象，4 h內(nèi)累積釋放量為41.06%；中期階段為緩釋階段，阿霉素的釋放非常緩慢，96 h內(nèi)累積釋放量為54.20%；最后階段，藥物釋放速度稍微加快，到168h累積釋放達(dá)72.15%，但仍然緩慢。

2.5 納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用 各組藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果見圖6。

圖6 3組藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞作用24、48、72h后的抑制率*P< 0.05，**P< 0.01，與CSO-NPs 組比較；#P< 0.05 ，##P< 0.01，與DOX 組比較Fig.6 Inhibitory rate of MCF-7 cells after 24 h, 48 h and 72 h treatment with different drugs*P< 0.05,**P< 0.01,compared with CSO-NPs group;#P< 0.05,##P< 0.01,compared with DOX group

從圖6可以看出，空白納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒作用，而游離DOX和載藥納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，提示DOX-CSO-NPs是主要通過阿霉素起抗腫瘤作用，而非載體。而且，游離DOX和DOX-CSO-NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的量效和時(shí)效關(guān)系，同時(shí)，隨著藥物干預(yù)時(shí)間延長至72h，DOX-CSO-NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用顯著高于游離DOX(P<0.05)。

經(jīng)藥物作用24 h后，載阿霉素的殼寡糖納米粒的毒性作用略強(qiáng)于游離阿霉素，而隨著作用時(shí)間的延長，載藥殼寡糖納米粒對(duì)MCF-7的細(xì)胞毒作用顯著高于DOX。見表1。

表1 DOX和DOX-CSO-NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞的

3 討論

3.1 以殼寡糖為材料制備載藥納米粒有顯著意義，值得進(jìn)一步研究 目前，對(duì)殼寡糖的研究多停留在其降解制備方法和其生物活性的機(jī)理及機(jī)制的探討上，以殼寡糖作為納米粒載體的研究還較少。殼寡糖相對(duì)殼聚糖來說分子量低很多，其作為載體形成的納米粒的粒徑比殼聚糖納米粒的粒徑要小得多。本實(shí)驗(yàn)采用離子凝膠法[7-8]成功制備了負(fù)載阿霉素的殼寡糖納米粒，此方法簡(jiǎn)單、方便、快速，由于殼寡糖制得的納米粒粒徑顯著較小，還可以進(jìn)一步嘗試對(duì)納米粒進(jìn)行修飾[9]，使其除具有被動(dòng)靶向作用[10]外，還能具有較好的主動(dòng)靶向作用，在雙重靶向作用下，能更好的將抗腫瘤藥物直接作用于腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)低毒高效。因此，以殼寡糖為材料制備納米粒有顯著意義，值得進(jìn)一步研究。

3.2 殼寡糖納米粒載體能降低阿霉素藥物的用量，潛在應(yīng)用價(jià)值大 有研究報(bào)道，殼寡糖具有抗腫瘤生物活性[11]，但從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白殼寡糖納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞幾乎沒有毒性，這可能是因?yàn)闅す烟菨舛忍筒恢苯訁⑴c抑制腫瘤的增生[12]，而體內(nèi)環(huán)境下殼寡糖主要通過調(diào)節(jié)免疫功能和抑制腫瘤血管生長、遷移[13]等實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用的。

從初步的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DOX-CSO-NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間的延長而大于游離阿霉素，其原因可能有2方面：一是由于納米粒具有緩釋作用。載藥納米粒的體外釋放試驗(yàn)初期，藥物能夠快速釋放的主要原因是納米?；鞈乙褐写嬖诘挠坞x阿霉素以及部分阿霉素只單純的物理吸附在納米粒的表面，能快速溶解擴(kuò)散，有利于藥物的快速起效；中期藥物釋放較為緩慢，其原因是被包裹在納米粒內(nèi)部的阿霉素通過納米粒的孔道以擴(kuò)散方式穩(wěn)定釋放；最后，隨著時(shí)間的延長，納米粒載體材料殼寡糖慢慢地被溶蝕降解，致使納米粒疏松，孔道增多，促進(jìn)擴(kuò)散，從而加快了藥物的釋放，但沒有酶的存在，這一過程也是極其緩慢的。二是由于腫瘤細(xì)胞對(duì)納米粒具有選擇性吞噬作用[14]，而DOX是以擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)說明了殼寡糖納米粒載體的應(yīng)用有望降低阿霉素藥物的用量，從而降低藥物的系統(tǒng)毒性，具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

3.3 其它 透射電鏡測(cè)得的納米粒粒徑(小于100 nm)明顯比粒度分析儀測(cè)出的結(jié)果小，這可能是因?yàn)榧{米粒是水凝膠體系，具有一定的溶脹/收縮性是凝膠的重要性質(zhì)之一[15]。電鏡檢測(cè)是在干燥條件下，粒子此時(shí)處于收縮狀態(tài)，而粒度分析儀測(cè)定粒徑時(shí)，樣品為溶液，粒子處于溶脹狀態(tài)。

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(編校：吳茜)

Preparation of doxorubicin-loaded chitosan oligosaccharide nanoparticles and its anti-tumor effect in vitro

LIU Huan1,JIANG Jing-yi1,WANG Li-ling1,LIU Zhi-hui2Δ

(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2.Department of pharmacy, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210036, China)

ObjectiveTo prepare doxorubicin-loaded chitosan oligosaccharide nanoparticles (DOX-CSO-NPs), and investigate the physiochemical properties and anti-tumor activity in vitro.MethodsDOX-CSO-NPs were prepared by the method of ionic cross-linking; the shape of nanoparticles were observed by transmission electron microscope (TEM), the paticle size and surface potential were determined by laser particle size analyzer, encapsulation efficiency and drug-loading rate were measured by ultraviolet spectrometry.The drug release characteristics of nanoparticles in vitro were preliminarily evaluated.The cytotoxicity of drug-loaded nanoparticles to MCF-7 cells in vitro were also investigated by MTT assay.ResultsDOX-CSO-NPs were spherical and complete in shape as shown under the transmission election microscope, the average size, Zeta potential, encapsulation efficiency and drug-loading rate were (136.77±1.21)nm, (20.53±0.31)mV, (56.99±1.40)% and (15.49±0.38)%, respectively.The total amount of accumulative release was 72.15% at the 168th hour.Free doxorubicin and DOX-CSO-NPs could inhibit the proliferation of MCF-7 cells in dose and time dependent manners in vitro obviously.Furthermore, the inhibition of the DOX-CSO-NPs to the MCF-7 cells was increasing with time and stronger than free doxorubicin. ConclusionThe particle size of DOX-CSO-NPs prepared by this method is smal and features a good quality of slow releasing，and it has better anti-tumor effect.

chitosan oligosaccharide nanoparticles; doxorubicin; anti-tumor effect

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD2011)

劉歡，女，碩士在讀，研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)，E-mail：liuhuan_y0812@163.com；劉志輝，通訊作者，主任中藥師，研究方向：中藥制劑開發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：liuzh1008@126.com。

R944.9

A

1005-1678(2015)01-0025-05