鄭立波　李麗　張小慧　尹慧　劉艷紅　董銀卯

近年來，隨著歐盟對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的取締，體外替代實(shí)驗(yàn)逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。本文利用SkinEthic^TM重組皮膚模型對(duì)無水乳液的刺激性進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該實(shí)驗(yàn)條件下所測(cè)得的數(shù)據(jù)符合OECD規(guī)定。10%Vc油包醇體系、10%Vc油包水體系、純油體系樣品對(duì)SkinE也ic^TM重組皮膚模型顯示無刺激性。

自2009年3月歐盟正式公布禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品毒性和過敏實(shí)驗(yàn)，體外代替實(shí)驗(yàn)逐步引起人們的廣泛關(guān)注。1975年Rhein Waldg和Green通過培養(yǎng)上表皮細(xì)胞，成功獲得皮膚模型，并成功用于皮膚缺損創(chuàng)面的治療。從此，皮膚模型得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。研究報(bào)道多應(yīng)用于化學(xué)品、化妝品的刺激性、腐蝕性實(shí)驗(yàn)、功效性評(píng)價(jià)、透皮吸收性等方面的研究。2013年7月26日，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for EconomicCo-operation and DevelopmentOECD）對(duì)皮膚模型的具體要求及操作方式提出了新的更具體的要求，使得皮膚模型逐步商業(yè)化，操作更加具體化。

皮膚模型的優(yōu)勢(shì)如下：可測(cè)定化合物經(jīng)皮吸收后對(duì)皮膚內(nèi)部細(xì)胞的影響；重復(fù)性高：取自不同人群的皮膚，更具說服力；適用于各種劑型藥物；可部分替代動(dòng)物刺激性實(shí)驗(yàn)，減少輿論；靈敏度、特異性高和精確性好。

無水乳化體系主要包括油包多元醇、油包油體系。無水乳液作為一種新的化妝品劑型，在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，國(guó)外對(duì)無水乳液的報(bào)道也較少，多數(shù)是對(duì)于藥物緩釋、物質(zhì)穩(wěn)定性方面的報(bào)道。無水乳液有下列優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)功效成分具有緩釋的效果；②能夠溶解水不溶性或在水中不穩(wěn)定的功效成分；③內(nèi)相承載物質(zhì)后能夠與外相分割，防止與空氣接觸后發(fā)生氧化變性；④通過外層對(duì)油相的包裹，滋潤(rùn)效果更好；⑤在藥物制劑中，很多功效成分溶于水后有難以下咽的味道，無水乳化對(duì)于嬰兒或者難以下咽藥片的老人有很好的幫助。

近年來，由于無水體系的諸多優(yōu)點(diǎn)，人們也開始對(duì)這一配方體系進(jìn)行研究。但無水乳液不溶于水這一性質(zhì)致使其安全性不適合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。重組皮膚模型適合于檢測(cè)各種劑型的化妝品，化學(xué)品。所以，本文采用SkinEthic^TM重組皮膚模型對(duì)無水乳液的刺激性進(jìn)行研究。為以后3-D皮膚模型應(yīng)用與化妝品的安全性檢測(cè)提供參考。

材料與方法

1.材料

SkinEthic^TM（購于美國(guó)MatTek公司）、含10%Vc的硅油包多元醇無水乳液、含10%Vc的硅油包水乳液、功能油（三個(gè)樣品均由北京工商大學(xué)研制）

2.儀器與試劑

*儀器：4℃的冰箱[MBR-107D（H）]、二氧化培養(yǎng)箱（ThermoForma 3111）、超凈工作臺(tái)[MCV-B91S（T）/Bgl F（T）]，倒置顯微鏡（OlymPuslX5）、不同量程移液槍（德國(guó)Eppendorf），酶標(biāo)儀（BiokitELX800）*試劑耗材：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基和相應(yīng)的緩沖液（Sigma）、胰酶（ScienCell）、DPBS、異丙醇（Sigma）、MTT實(shí)驗(yàn)所需耗材、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T175）、尼龍布，無菌鉗，一次性滅菌移液管、吸管，6孔板、24孔板、96孔板。

3.試驗(yàn)方法

（1）樣品準(zhǔn)備：5%SDS為陽性對(duì)照，DPBS為陰性對(duì)照。選取6個(gè)測(cè)試樣品待用。

（2）收到樣品當(dāng)天應(yīng)檢查皮膚是否完整，有無異常，將DPBS置于（5±3）℃冰箱中，將MTT溶液置于（-20±5）?！姹渲?。

（3）將皮膚模型用無菌鉗取出后用紗布蘸取其底部的多余瓊脂糖后將其置于空的24孔板中。檢查皮膚是否完整，將表面多余的水分盡量吸干。此過程應(yīng)在5min之內(nèi)完成。

（4）培養(yǎng)基預(yù)熱至20～25℃，在6孔板中加入0.9mL的培養(yǎng)基，用無菌鉗取出皮膚后將皮膚模型轉(zhuǎn)移到6孔板中。在（37±1）℃，（5±1）%培養(yǎng)（60±5）min（使其中的固定物釋放）。將皮膚模型轉(zhuǎn)移到新的含0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中，在（37±1）℃，（5±1）%CO₂條件下培養(yǎng)（18±3）h。

（5）將皮膚模型轉(zhuǎn)移到含新的0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中，用尼龍布將皮膚表面的液體吸凈。

將受試物加至人造皮膚模型表面（固體先加25uL蒸餾水后加25mg樣品，液體吸取30μL樣品）后，加一層尼龍布，使樣品分散均勻。用接種環(huán)將樣品分散均勻。每個(gè)樣品做三個(gè)平行試驗(yàn)。將樣品放在（37±1）℃，（5±1）%CO₂條件下孵育35min后將皮膚從培養(yǎng)箱中取出，直到皮膚與樣品接觸60min為止。

（6）樣品暴露（60±1）min后，立即用DPBS多次沖洗組織。后用尼龍布將皮膚表面的DPBS吸凈，將其換入新的含0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)（24±2）h。

（7）（24±2）h后收集培養(yǎng)基，置于24孔板中，利用試劑盒測(cè)定其白介素含量。同時(shí)將皮膚轉(zhuǎn)移到新的含0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)（18±2）h。

（8）培養(yǎng)液后將皮膚組織進(jìn)行沖洗后轉(zhuǎn)移到300uL的MTT溶液中避光保存，進(jìn)行MTT染色。

（9）MTT染色后，去除MTT溶液，用DPBS沖洗兩次，將皮膚轉(zhuǎn)移到2mL的異丙醇中。提取細(xì)胞中的甲躦。

（10）將提取液轉(zhuǎn)移到96孔板中，在550～570nm下測(cè)定吸光度。受試物的吸光度與陰性對(duì)照比較。以樣品相對(duì)于陰性對(duì)照的細(xì)胞存活率的變化來評(píng)估受試物的潛在刺激性。

相對(duì)細(xì)胞活率百分?jǐn)?shù)=（樣品平均吸光度值/陰性對(duì)照的平均吸光度值）×100%

4.判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）陰性對(duì)照可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：在570nmT其OD值X應(yīng)滿足1.0

（2）陽性對(duì)照與陰性對(duì)照組細(xì)胞存活率的比值應(yīng)<20%

（3）各個(gè)樣品的SD<18%

（4）在上述情況下其細(xì)胞活率若>50%為無刺激，細(xì)胞活率若≤50%為有刺激。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如下圖所示：為檢測(cè)化學(xué)品、化妝品刺激性的實(shí)驗(yàn)方法之一。本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3種產(chǎn)品對(duì)SkinEthic^TM重組皮膚模型的刺激性，最終判斷了10%Vc油包醇體系，10%Vc油包水體系、純油體系對(duì)SkinEthic^TM重組皮膚模型無刺激性。

由圖1可知，陰性對(duì)照組在570nm下其OD值×=2.2534<20%；陽性對(duì)照與陰性對(duì)照組細(xì)胞存活率的比值=3.3616/99.9978×1D0%=3.3617%<20%；其中各個(gè)樣品的SD<18%，所以，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合OEcD規(guī)定。利用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得其細(xì)胞活率分別為97.90%、107.11%、120.65%，所以判定10%Vc油包元醇體系、10%Vc油包水體系、純油體系對(duì)SkinEthic^TM重組皮膚模型無刺激性。

討論

體外重組皮膚模型是取自人體具有增殖能力的細(xì)胞后，種植于具有生物兼容性的高分子材料中，通過原代培養(yǎng)，獲得具有類似于人體皮膚的模型結(jié)構(gòu)。根據(jù)其皮膚模型所含皮膚的層數(shù)及深度，主要包括單層細(xì)胞模型、表皮模型，復(fù)層皮膚模型。其中，復(fù)層皮膚檢測(cè)模型結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚刺激實(shí)驗(yàn)替代的理想模型。通過本次實(shí)驗(yàn)可知：在此條件下，SkinEthic^TM重組皮膚模型可以滿足OECD的各項(xiàng)規(guī)定，可作為以后皮膚模型在化妝品刺激性方面的應(yīng)用提供參考。