李占海

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

黃柏八味散，蒙藥名為沙日毛都-8，由黃柏、香墨、梔子、甘草、紅花、蓽茇、牛膽粉、黑云香八味藥材組成，具有清熱解毒作用，用于熾熱，血熱，臟腑之熱，肺熱咳嗽，痰中帶血，肝火肋痛［1］。紅花是黃柏8 味散的主要成分之一，具有擴(kuò)血管、降血壓、降血脂、抗凝血、抗炎和提高抗缺氧能力等作用。羥基紅花黃色素A 是紅花的主要化學(xué)成分。黃柏八味散是《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》(1998 年版)收載品種，原標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有收載相關(guān)定性定量指標(biāo)，故參照文獻(xiàn)［2-11］采用高效液相色譜法對(duì)黃柏八味散中紅花進(jìn)行含量測(cè)定，可為該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器: 大連依利特P230 型高效液相色譜儀;色譜柱: 依利特Hypersil ODS2(5μm，4.6mm×250mm);KQ5200E 型超聲儀(功率200W，頻率40KHz);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，0.0001g)。

1.2 試劑與藥品: 鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào): 110713 -

201212)，梔子苷對(duì)照品(批號(hào): 110749 -201316)，胡椒堿對(duì)照品(批號(hào): 110775 -201104)，羥基紅花黃色素A 對(duì)照品(批號(hào): 111637 -201106)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。黃柏八味散(呼和浩特市中蒙醫(yī)院，批號(hào): 130615、130910、140421);甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃柏的薄層鑒別: 取本品粉末0.4g，加1%醋酸甲醇溶液20mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液濃縮至2mL，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品0.1g，缺黃柏陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，分別吸取上述3 種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30: 10: 4)的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。紫外燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示: 供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性色譜無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2 梔子的薄層鑒別: 取本品粉末0.67g，加乙醇溶液10mL，超聲處理40min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。另取梔子苷對(duì)照品g，缺梔子陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成梔子苷對(duì)照品溶液和陰樣品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，分別吸取上述3 種溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5: 5: 1: 1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 加熱條件下顯色。結(jié)果顯示: 供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅褐色斑點(diǎn)，且陰性色譜無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2 。

2.1.3 蓽茇的薄層鑒別: 取本品粉末0.4g，加無(wú)水乙醇溶液10 mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取胡椒堿0.2g，缺蓽茇陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，分別吸取上述3 種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7;2: 1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。至紫外燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示: 供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，且陰性色譜無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件: 色譜柱: 依利特Hypersil ODS2(5μm，4.6mm × 250mm);流動(dòng)相: 甲醇-0.5%乙酸溶液(20: 80);檢測(cè)波長(zhǎng): 403nm;流速: 1.0mL·min-1;柱溫: 25℃。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A 計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 溶液的制備: 對(duì)照品溶液的制備: 精密稱取羥基紅花黃色素A 對(duì)照品5.00mg，置100mL 棕色容量瓶中，加入25%甲醇溶解，定容，制成50μg·mL-1的溶液，作為儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液15mL 于50mL 棕色容量瓶中，加入25%甲醇稀釋至刻度，制成15μg·mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備: 取黃柏八味散約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液50mL，稱定重量，超聲處理40min，放冷，稱定重量，加25%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液的制備: 按黃柏八味散處方稱取除紅花外的其余藥材，按照制備供試品溶液的方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn): 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性樣品溶液各20μL，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A 與其他組分色譜峰可基線分離，分離度符合規(guī)定，且陰性樣品無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖4。

2.2.4 線性范圍: 精密吸取羥基紅花黃色素A 對(duì)照品溶液(50.00μg·mL-1)0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、8.0mL，分別置于10mL 棕色容量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成1、2.5、5、15、25、40μg·mL-1的溶液。按照上述色譜條件，分別吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為: A=23290C-9400.2，r=0.9997。結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A 在1μg·mL-1～40μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn): 分別精密吸取供試品溶液(呼和浩特市中蒙醫(yī)院，批號(hào): 130615)與對(duì)照品溶液(15μg·mL-1)各20μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)定峰面積。結(jié)果對(duì)照品溶液的RSD 為1.3%;供試品溶液的RSD為0.9%。結(jié)果表明: 該測(cè)定方法精密度良好，符合含量測(cè)定要求。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn): 取供試品(呼和浩特市中蒙醫(yī)院，批號(hào): 130615)溶液，分別于0，2，4，6，8、10h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD 為1.6%。結(jié)果表明: 供試品溶液在10h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合含量測(cè)定要求。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn): 取供試品(呼和浩特市中蒙醫(yī)院，批號(hào): 130615)約1g，精密稱定，共6 份，分別按供試品溶液的制備方法制備溶液，各精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果羥基紅花黃色素A 平均含量為0.6102mg·g-1，RSD 為1.1%。結(jié)果表明: 該測(cè)定方法的重復(fù)性良好，符合含量測(cè)定要求。

2.2.8 回收率試驗(yàn): 取已知含量供試品粉末(呼和浩特市中蒙醫(yī)院，批號(hào): 130615)約0.5g，共6 份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，每份加入羥基紅花黃色素A 對(duì)照品一定量。分別按供試品溶液的制備方法制備溶液，各精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為101.0%，RSD 為0.8%。結(jié)果表明: 該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度良好，符合含量測(cè)定要求。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 供試品含量測(cè)定

分別取3 個(gè)不同批號(hào)的供試品約1g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備溶液，各吸取溶液20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。按照《中國(guó)藥典》2010 版一部的規(guī)定，紅花中含羥基紅花黃色素A 不得低于1.0%來(lái)計(jì)算，黃柏八味散含羥基紅花黃色素A 應(yīng)不得低于0.5952mg·g-1。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取時(shí)間的選擇: 實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取的時(shí)間進(jìn)行了考察，比較了30min，40min，50min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲40min已基本提取完全。故確定提取時(shí)間為40min。

3.2 流動(dòng)相的選擇: 通過(guò)參考文獻(xiàn)，比較了不同的流動(dòng)相: 甲醇: 0.5%乙酸溶液(20: 80)、甲醇: 0.2%磷酸溶液(27: 73)［7］、甲醇: 乙腈: 0.7%磷酸溶液(26: 2: 72)［8］，結(jié)果表明: 用甲醇-0.5%乙酸溶液(20: 80)為流動(dòng)相保留時(shí)間適宜，分離效果好，故采用甲醇-0.5%乙酸溶液(20: 80)為流動(dòng)相。

3.3 研究展望: 本試驗(yàn)以紅花為研究對(duì)象進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為了更加全面的提高該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有待于進(jìn)一步對(duì)其他組分進(jìn)行綜合研究，必要時(shí)可對(duì)黃柏八味散進(jìn)行指紋圖譜的研究。

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