田　亮　穆　秦　岳　登　付塞琴

（陜西省銅川市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西銅川727031）

豬病防控Swine Disease Prevention and Control

豬流感病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究進(jìn)展

田亮穆秦岳登付塞琴

（陜西省銅川市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西銅川727031）

摘要：豬流感是由豬流感病毒引起的一種呼吸道傳染病，從目前的研究結(jié)果看，其免疫應(yīng)答機(jī)制并不十分清楚。本文從流感病毒在體外、體內(nèi)與豬免疫系統(tǒng)之間的相互作用兩方面就豬流感的免疫應(yīng)答反應(yīng)做一綜述，以期為更好地防治豬流感提供參考。

關(guān)鍵詞：豬流感；免疫應(yīng)答；綜述

近年來，關(guān)于流感疾病的研究有了很大進(jìn)步。然而，流感病毒疾病仍然是給人類健康造成威脅的主要疾病之一，并且多種動(dòng)物均可感染。該病毒是有外殼的正粘病毒科的單鏈RNA病毒，主要分為A、B、C型。A型流感病毒是以血凝素（HA）和神經(jīng)氨酶（NA）為依據(jù)的亞種，目前有17個(gè)HA型和9個(gè)NA型[1]。A、B型流感病毒RNA分別由8個(gè)節(jié)段基因組成，編碼11或者12個(gè)代表性病毒蛋白[2]。豬流感病毒是引起豬呼吸道癥狀的重要疾病，主要由H1N1、H1N2和H3N2三個(gè)亞型引起。豬對(duì)人和禽流感病毒易感，由于人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒三者或者兩兩之間會(huì)發(fā)生基因重組，因此豬可能是流感病毒產(chǎn)生新變異的“混合器”[3]。豬感染后可能進(jìn)一步導(dǎo)致病毒變異，將其傳播給人類。

大量的研究表明，甲型H1N1流感病毒和其他型的流感病毒在感染豬的發(fā)病機(jī)理和傳播途徑方面有了進(jìn)一步的研究。流感病毒對(duì)豬和人的致病機(jī)理及組織嗜性具有相似性，因此，在研究不同流行性感冒傳染病方面，豬是一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]。

在體外，流感病毒能夠感染多種細(xì)胞，包括MDCK細(xì)胞系、VERO細(xì)胞系、人血單核細(xì)胞及人單核巨噬細(xì)胞；在體內(nèi)，流感病毒主要感染動(dòng)物和人的呼吸道上皮細(xì)胞。近年來，對(duì)病毒的黏附與發(fā)病機(jī)制研究較多，但對(duì)流感病毒與細(xì)胞相互作用的免疫應(yīng)答反應(yīng)研究較少。因此，本文主要針對(duì)豬對(duì)豬流感病毒的免疫應(yīng)答反應(yīng)做一綜述。

1體外流感病毒與豬免疫系統(tǒng)之間的相互作用

1.1上皮細(xì)胞

上皮細(xì)胞是宿主的第一道防御屏障和流感病毒攻擊的主要目標(biāo)，因此研究流感病毒與呼吸道上皮細(xì)胞之間的相互作用，對(duì)流感病毒的防控具有重要意義。Nunes 等[5]以豬氣管作為體外的器官培養(yǎng)基，表現(xiàn)出與體內(nèi)病毒感染類似的組織病變。Punyadarsaniya等[6]用精密肺切片培養(yǎng)基與豬呼吸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)豬流感病毒和低致病性禽流感病毒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)禽流感病毒H9N2型比H7N7型更易感，并且豬流感病毒比禽流感病毒生長(zhǎng)更快，三種病毒在感染48小時(shí)后仍具有纖毛運(yùn)動(dòng)，并且隨著感染中病毒數(shù)量的增加，纖毛運(yùn)動(dòng)停止。結(jié)果表明，這三種病毒均能夠感染纖毛上皮細(xì)胞，豬流感病毒也能感染黏液細(xì)胞。

Bateman等[7]用H3N2型和人源重組基因的豬流感病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞，其能夠在富含維甲酸和表皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基的氣液界面生長(zhǎng)，甚至在缺少外源性胰蛋白酶的情況下也能生長(zhǎng)。Sun等[8]證明，人型、豬型以及禽型流感病毒在豬腸上皮細(xì)胞系上易感，但人的B型流感病毒生長(zhǎng)不佳。因此，可以將豬腸上皮細(xì)胞系作為豬流感病毒培養(yǎng)基，研究流感病毒在呼吸系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)理。

1.2天然免疫系統(tǒng)

天然免疫系統(tǒng)是抵抗流感病毒感染的第二道防線，由黏液、凝集素和急性時(shí)相蛋白等組成，防止呼吸道上皮細(xì)胞受到感染。

1.2.1膠原凝集素表面活性蛋白D（SP-D）

SP-D屬于C型凝集素家族，是天然免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)器。Hillaire等[9]研究表明，豬SP-D能夠結(jié)合血凝素，抑制神經(jīng)氨酸酶的活性比人源重組SP-D蛋白的效果更好，預(yù)測(cè)SP-D能夠作為抗過濾性病原體介質(zhì)來抵抗體外流感病毒。SP-D蛋白對(duì)A型流感病毒的抵抗范圍更廣，且能夠中和多種H1N1和H3N2流感病毒，SP-D能夠阻止人流感病毒H1N1和H3N2黏附呼吸道上皮細(xì)胞的感受器。

1.2.2巨噬細(xì)胞

Seo等[10]報(bào)道，人源流感病毒產(chǎn)生α干擾素（α-IFN）的量遠(yuǎn)高于H1N1型和B型流感病毒。α干擾素蛋白隨著感染時(shí)間的增加而增加，肺泡巨噬細(xì)胞在感染流感病毒時(shí)不凋亡，表明肺泡巨噬細(xì)胞在流感病毒的感染機(jī)理和免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有重要作用。

Kim等[11]研究表明α-IFN可能在豬流感病毒感染的病理生理學(xué)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。有研究證實(shí)，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)被H1N1感染的豬巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，感染后16小時(shí)IL-6和IL-8水平在上調(diào)，并且感染后36小時(shí)IL-8水平繼續(xù)升高，可能由于細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗病毒的α-IFN和腫瘤壞死因子。由于在感染前可能存在大量的腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體，因此不能檢出殘留的FasL和α腫瘤壞死因子[12]。

1.2.3樹突狀細(xì)胞

常見的樹突狀細(xì)胞(cDCs)，位于呼吸道上皮屏障下方和基底膜上方，通過被呼吸道上皮細(xì)胞緊密連接擴(kuò)展的樹突監(jiān)測(cè)呼吸道的內(nèi)腔[13]。cDCs能檢查和調(diào)理病毒粒子。在流感病毒感染時(shí)產(chǎn)生的多種樹突狀細(xì)胞中，許多具有細(xì)胞溶解活性，并且能夠促使支氣管相關(guān)的淋巴組織(BALT)產(chǎn)生[14]。有研究表明，豬骨髓樹突狀細(xì)胞構(gòu)成了類似于流感病毒體內(nèi)感染的小囊泡，并且在細(xì)胞質(zhì)中釋放。在表面感染8小時(shí)后才能檢測(cè)出有限的病毒，然而，當(dāng)產(chǎn)生細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用時(shí)，病毒粒子從受感染的豬骨髓樹突狀細(xì)胞中誘導(dǎo)易感細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞致病作用[15]。

類漿樹突狀細(xì)胞(pDCs)是樹突狀細(xì)胞的一個(gè)亞型，豬的pDCs在對(duì)所有分離株應(yīng)答時(shí)都能夠產(chǎn)生高水平的α-IFN，且α-IFN分泌具有很高的專一性，通過研究表明在pDCs應(yīng)答反應(yīng)中必須保持HA和它結(jié)合功能的完整性[16]。

1.2.4自然殺傷細(xì)胞

自然殺傷性細(xì)胞是天然免疫應(yīng)答反應(yīng)重要的效應(yīng)細(xì)胞。它們能夠識(shí)別抗體結(jié)合的流感病毒感染的細(xì)胞，并裂解這些細(xì)胞，這一過程稱為抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用(ADCC)。有研究預(yù)測(cè)，恒量的自然殺傷性T細(xì)胞（iNKT）能夠刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫功能并調(diào)節(jié)感染引起的病理改變[17]。豬的自然殺傷性細(xì)胞單克隆抗體和豬肺中檢測(cè)到的iNKT細(xì)胞，在豬體內(nèi)具有識(shí)別自然殺傷性細(xì)胞的標(biāo)記，表明這些細(xì)胞對(duì)于流感病毒感染豬具有重要作用[18]。

2豬感染流感病毒的體內(nèi)免疫應(yīng)答

流感病毒引起的疾病在豬和人上的癥狀基本類似，具有較低的死亡率但較高的發(fā)病率[19]。豬易感禽源和人源的流感病毒，并且偶然傳播給人類。因此，研究其在體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)具有重要意義。

2.1急性時(shí)相蛋白

急性期反應(yīng)是各種刺激引起有機(jī)體的非特異性的早期反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子調(diào)節(jié)這些反應(yīng)，包括局部和全身反應(yīng)，引起急性時(shí)相蛋白(APPs)濃度的變化[20]。豬的APPs有C反應(yīng)蛋白(CRP)、結(jié)合珠蛋白(Hp)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)和豬主要急性時(shí)相蛋白(Pig-MAP)，然而僅有少量研究探討了APPs在流感病毒感染期的作用。

Brookes等[21]研究表明，H1N1流感病毒在急性感染期時(shí)，CRP和Hp的濃度增加。有報(bào)道稱，豬流感病毒H1N1通過氣管感染豬，CRP、Hp、LPS結(jié)合蛋白（LBP）存在于支氣管肺泡灌洗液（BALF）中，CRP和Hp在感染2天后、LBP在感染30天后達(dá)到最高值，之后減少。然而在血清中，CRP和Hp濃度在48小時(shí)達(dá)到最高值，而LBP水平基本維持穩(wěn)定。APPs在血清中的水平高于在BALF中，并且和病毒載量沒有直接關(guān)系。有少量豬在控制感染病毒濃度后其APPs濃度沒有顯著的變化[22]。

當(dāng)大量的病毒被釋放時(shí)，被感染豬的CRP、Hp、SAA濃度顯著增加，并且Pig-MAP的水平保持不變，且血清中SAA的濃度與肺功能正相關(guān)，提示SAA可以作為試驗(yàn)感染的指示或者作為疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志[23]。

2.2豬流感病毒

2.2.1母源抗體作用

Loeffen等[24]用豬流感病毒H1N1進(jìn)行同源感染，表明母源抗體保護(hù)豬抵抗臨床感染初期的流感病毒，但這些保護(hù)并不完全。Kitikoon等[25]研究表明，母源抗體抑制血清中的抗體反應(yīng)，用二價(jià)的滅活疫苗免疫后能誘導(dǎo)產(chǎn)生豬流感病毒的特異性記憶T細(xì)胞。有母源抗體的豬免疫后，用異源的H1N1病毒攻擊時(shí)，可觀察到肺炎癥狀明顯。

2.2.2 H1N1和H3N2流感病毒

接種豬流感病毒H1N1的豬體內(nèi)，檢測(cè)到具有生物活性的α-IFN、α-TNF和IL-1，細(xì)胞因子在發(fā)病初期廣泛存在，并且伴有呼吸道癥狀甚至引起支氣管壞死。研究顯示，α-IFN、α-TNF和IL-6與肺中病毒量和癥狀的嚴(yán)重程度有關(guān)，表明其與豬流感病毒發(fā)病機(jī)理有關(guān)[26]。

Larsen等[27]研究表明，豬在感染豬流感病毒H1N1期間產(chǎn)生全身的黏膜應(yīng)答反應(yīng)，IgG在血清中占優(yōu)勢(shì)，IgA在上下呼吸道中占優(yōu)勢(shì)。IFN-α分泌細(xì)胞作為T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的標(biāo)志，主要集中在脾臟和器官支氣管淋巴結(jié)。

Kim等研究了感染豬流感病毒H1N1和H3N2的豬的抗體對(duì)特異性病毒蛋白的應(yīng)答反應(yīng)，NP蛋白的血清學(xué)檢測(cè)不受亞型的限制，NS1的血清學(xué)檢測(cè)在感染和疫苗接種豬具有差異。Heinen等研究表明，感染后4～7天出現(xiàn)特異性IgM且病毒在口咽中被清除。因此，認(rèn)為初次感染后IgM與病毒的清除有關(guān)。Kitikoon等研究表明，不同型的豬流感病毒在感染初期，M2抗體應(yīng)答反應(yīng)較低，受到同源病毒的攻擊時(shí)抗體滴度不增加，但是受到異源病毒的攻擊時(shí)抗體滴度增加。當(dāng)發(fā)生血清轉(zhuǎn)化時(shí)，HA、M2e對(duì)感染的劑量產(chǎn)生影響，而M1不影響抗體水平。

2.2.3 H1N2流感病毒

Jo等在感染H1N2豬流感病毒的豬肺中檢測(cè)到高劑量的IL-1、IL-8和α-TNF，感染后5天α-TNF的量達(dá)到最高值，感染3天后鼻液中分泌病毒。Kim等將豬流感病毒經(jīng)鼻腔接種3周齡的豬，能夠在BAL中產(chǎn)生相同的細(xì)胞因子，感染后1天BAL中的α-TNF濃度達(dá)到最高值，感染3天后顯著下降，在BAL中α-TNF的水平與體溫相關(guān)并且肺的損傷與α-TNF的濃度正相關(guān)。

豬流感病毒H1N2感染5天后能夠檢測(cè)到特異性T細(xì)胞，感染7天后在豬血清中能夠檢測(cè)到抗體。豬流感病毒H1N2感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)比其他亞型H1N1和H3N2的應(yīng)答反應(yīng)遲緩。

3展望

盡管豬流感所致的死亡率不高，與其他病毒性豬傳染病相比，造成的經(jīng)濟(jì)損失也小得多，但由于豬是人流感和禽流感的“混合器”，又由于豬可以作為人流感病毒的存儲(chǔ)器，在豬體內(nèi)保持很長(zhǎng)時(shí)間，在適當(dāng)?shù)臈l件下，這些病毒可在人群中造成流行，因此豬流感具有重要的公共衛(wèi)生意義。因此，開展對(duì)豬流感免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究，不僅對(duì)豬流感病的防治具有重要意義，而且對(duì)禽、人流感的研究具有參考價(jià)值。

主要參考文獻(xiàn)

[1] Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109:4269-4274.

[2] Medina R, Garcia-Sastre A. Influenza A viruses: new research developments[J]. Nature Reviews Microbiology, 2011(9):590-603.

[3] Ma W, Lager K, Vincent A, et al. The role of swine in the generation of novel influenza viruses [J]. Zoonoses Public Health, 2009, 56: 326-337.

[4] Meurens F, Summerfield A, Nauwynck H, et al. The pig: a model for human infectious diseases[J]. Trends in Microbiology, 2012, 20:50-57.

[5] Nunes S, Murcia P, Tiley L, et al. An ex vivo swine tracheal organ culture for the study of influenza infection [J]. Influenza and Other Respiratory Viruses, 2010(4):7-15.

[6] Punyadarsaniya D, Liang C, Winter C, et al. Infection of differentiated porcine airway epithelial cells by influenza virus: differential susceptibility to infection by porcine and avian viruses [J]. PLoS ONE, 2011, 6:e28429.

[7] Bateman A, Karasin A, Olsen C. Differentiated swine airway epithelial cell cultures for the investigation of influenza A virus infection and replication. Influenza and Other Respiratory Viruses, 2013, 7(2): 139-150.

[8] Sun Z, Huber V, McCormick K, et al. Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for influenza virus production[J]. Journal of General Virology, 2012, 93:2008-2016.

[9] Hillaire M, Van E, Van T, et al. Assessment of the antiviral properties of recombinant porcine SP -D against various influenza A viruses in vitro[J]. PLoS ONE, 2011, 6:e25005.

[10] Seo S, Webby R, Webster R. No apoptotic deaths and different levels of inductions of Infla-mmatory cytokines in alveolar macrophages infected with influenza viruses[J]. Virology, 2004, 329:270-279.

[11] Kim B, Ahn K, Ha Y, et al. Association of tumor necrosis factoralpha with fever and pulmonary lesion score in pigs experimentally infected with swine influenza virus subtype H1N2[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2009, 71:611-616.

[12] Gao W, Sun W, Qu B, et al. Distinct regulation of host responses by ERK and JNK MAP kinases in swine macrophages infected with pandemic (H1N1) 2009 influenza virus [J]. PLoS ONE, 2012,7: e30328.

[13] Kreijtz J, Fouchier R, Rimmelzwaan G. Immune responses to influenza virus infection[J].Virus Research, 2011, 162:19-30.

[14] Kreijtz J, Fouchier R, Rimmelzwaan G. Immune responses to influenza virus infection[J]. Virus Research, 2011, 162:19-30.

[15] Mussá T, Rodriguez-Carino C, Pujol M, et al. Interaction of porcine conventional dendritic cells with swine influenza virus[J]. Virology, 2011, 420:125-134.

[16] Calzada-Nova G, Schnitzlein W, Husmann R, et al. Characteri-zation of the cytokine and maturation responses of pure populations of porcine plasmacytoid dendritic cells to porcine viruses and toll-like receptor agonists [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2009, 135:20-33.

[17] Paget C, Ivanov S, Fontaine J, et al. Potential role of invariant NKT cells in the control of pulmonary inflammation and CD8+ T cell response during acute influenza A virus H3N2 pneumonia [J]. Journal of Immunology, 2011, 186:5590-5602.

[18] Mair K, Essler S, Patzl M, et al. NKp46 expression discriminates porcine NK cells with different functional properties [J]. European Journal of Immunology, 2012, 42:1261-1271.

[19] Brown I. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs[J]. Veterinary Microbiology, 2000, 74:29-46.

[20] Pomorska M, Markowska D, Pejsak Z. Acute phase protein response during subclin-ical infection of pigs with H1N1 swine influenza virus[J]. Veterinary Microbiology, 2012, 159:499-503.

[21] Brookes S, Nunez A, Choudhury B, et al. Replication,pathogenesis and transmission of pand-emic (H1N1) 2009 virus in non-immune pigs[J]. PLoS ONE, 2010, 5:e9068.

[22] Barbe F, Atanasova K, Van R. Cytokines and acute phase proteins associated with acute swine influenza infection in pigs [J]. Veterinary Journal, 2011, 187:48-53.

[23] Pomorska M, Markowska D, Kwit K. Immune and acute phase response in pigs experimentally infected with H1N2 swine influenza virus [J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2012, 66:334-342.

[24] Loeffen W, Heinen P, Bianchi A, et al. Effect of maternally derived antibodies on the clinical signs and immune response in pigs after primary and secondary infection with an influenza H1N1 virus[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2003, 92:23-35.

[25] Kitikoon P, Nilubol D, Erickson B, et al. The immune response and maternal antibody interference to a heterologous H1N1 swine influenza virus infection following vaccination[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2006, 112:117-128.

[26] Van R, Van G, Pensaert M. Correlations between lung proinflammatory cytokine levels,virus replication, and disease after swine influenza virus challenge of vaccination-immune pigs[J]. Viral Immunology, 2002, 15:583-594.

[27] Larsen D, Karasin A, Zuckermann F, et al. Systemic and mucosal immune responses to H1N1 influenza virus infection in pigs[J]. Veterinary Microbiology, 2000, 74:117-131.

中圖分類號(hào)：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4645(2015)01-0045-04

收稿日期：2014-08-27