夏新萌連偉民李成蒙（山東省聊城市畜牧獸醫(yī)局，山東聊城5000；湖北省?？悼h畜牧獸醫(yī)局，湖北?？?4600）

我國部分地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型流行病學(xué)調(diào)查

夏新萌1連偉民1李成蒙2
（1山東省聊城市畜牧獸醫(yī)局，山東聊城252000；2湖北省保康縣畜牧獸醫(yī)局，湖北保康441600）

摘要：為了弄清豬傳染性胸膜肺炎在我國部分地區(qū)豬場的流行情況，對(duì)湖北、湖南、四川、廣東、山東、福建等省的24個(gè)不同規(guī)模的未免疫養(yǎng)豬場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，共采集1 464份豬血清樣品，其中1 187份血清樣品通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行檢測，對(duì)陽性血清進(jìn)行分型，277份血清樣品使用豬傳染性胸膜肺炎ApxⅣ—ELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，378份血清樣品經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測為陽性，陽性率為31.84%（378/1 187）；164份血清樣品經(jīng)ELISA試劑盒檢測為陽性，陽性率為59.21%（164/277）。陽性血清樣品分型結(jié)果顯示，血清型7型、11型、10型、13型、5型和1型樣品分別有56、52、48、44、43和40份，陽性率分別為14.81%、13.76%、12.70%、11.64%、11.38%和10.58%。該研究表明，豬傳染性胸膜肺炎流行于我國部分地區(qū)，血清陽性率較高，其中以血清7型陽性率最高，且血清11型、10型、13型、5型和1型的陽性率都超過10%。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎；胸膜肺炎放線桿菌；血清型；流行病學(xué)

豬傳染性胸膜肺炎( Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一種以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為特征的高度接觸性呼吸道傳染病。該病發(fā)病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高達(dá)80%～100%。目前胸膜肺炎放線桿菌已經(jīng)分離出15種血清型，毒力因子多，各血清型之間交叉免疫保護(hù)率低，診斷和防治有一定困難。

自1957年豬傳染性胸膜肺炎被發(fā)現(xiàn)以后，現(xiàn)已在世界許多國家和地區(qū)流行，成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一。從20世紀(jì)90年代后期，隨著我國集約化和規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病在我國的流行趨勢越發(fā)明顯。王建新等[1]對(duì)海南省11個(gè)規(guī)模化豬場的608份血清進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)APP的感染率高達(dá)82.2%。姚四新等[2]對(duì)來自河南省新鄉(xiāng)市的8個(gè)不同規(guī)模養(yǎng)豬場的106份血清進(jìn)行APP檢測，證實(shí)APP的陽性率為33.02%，感染率為9.1%～58.8%。徐公義等[3]對(duì)魯西地區(qū)186頭病死豬和545頭無臨床癥狀的健康豬進(jìn)行了APP的流行病學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，186份病料中APP的陽性率占43.0%，545份豬血清中APP的陽性率為7.9%。鄧灶福等[4]對(duì)湖南不同地區(qū)的267份豬血清進(jìn)行APP檢測，結(jié)果陽性率為34.46%。由以上報(bào)道可知，APP已經(jīng)在我國大部分地區(qū)存在。

本次研究的重點(diǎn)在于調(diào)查豬傳染性胸膜肺炎在我國某些地區(qū)流行的情況，更好地掌握其流行的規(guī)律，探索有效的防控措施，改善養(yǎng)豬場的管理模式以及發(fā)病后的治愈方法，從而降低該病的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)格控制該病的流行，減少因該病引起的損失。

1材料

1 187份血清樣品（來自湖北15個(gè)豬場的768份血清、湖南1個(gè)豬場的80份血清、四川1個(gè)豬場的126份血清、廣東1個(gè)豬場的74份血清、山東1個(gè)豬場的99份血清、福建1個(gè)豬場的40份血清）。

277份血清樣品（來自湖北2個(gè)豬場的178份血清、福建1個(gè)豬場的40份血清、山東1個(gè)豬場的59份血清），其中包括仔豬、育肥豬、種豬，要求血清清亮，無溶血。

血清型1～13（無2、8）型的標(biāo)準(zhǔn)APP菌株、陰陽對(duì)照血清。

氯化鈉、瓊脂粉、硫柳汞、電子稱量臺(tái)、濕盒、培養(yǎng)管、超凈臺(tái)、恒溫箱。

豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ-ELSA抗體檢測試劑盒（由某動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司提供）。

2方法

2.1瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法

（1）APP的復(fù)蘇培養(yǎng)：將胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）加入到11個(gè)培養(yǎng)管（20 mL/管）中，每管5 mL，并加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD），將各種血清型的APP菌株與甘油混合液（體積比1∶1）從-80℃冰箱中取出，每個(gè)培養(yǎng)管100 μL，放入到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。如果24小時(shí)后培養(yǎng)管渾濁就表明APP生長良好。

（2）酚水抗原的制備：從培養(yǎng)管取出APP的24小時(shí)培養(yǎng)物，溶解在適量PBS中，以5 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄掉上清液，菌體沉淀用PBS洗兩次。菌體沉淀用適量的68℃蒸餾水稀釋。充分混勻后加入等體積、同溫度的90%酚，在68℃水浴鍋中水浴20分鐘，每過2分鐘取出，上下攪拌混勻。水浴結(jié)束后立即取出，冷卻冰浴10分鐘，然后再在4℃離心機(jī)中以7 500 轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取水相；再重復(fù)上一次做法，再加入上次同量的68℃蒸餾水，水浴、攪拌、冰浴、取水相。將兩次取出的水相混合就是酚水抗原。

（3）瓊脂凝膠板的制備：按照每100 mL蒸餾水含8.5 g氯化鈉、1.0 g瓊脂粉、0.1 g硫柳汞配置。取所需材料量在微波爐中用沸水融化，按照制板分裝。待冷卻后用打孔器打孔，孔徑5 mm，孔距5 mm，孔深3 mm。再稍微用酒精燈烘烤底面，使其底面瓊脂與玻璃板粘連緊密以防止加樣滲漏。

（4）加樣：按照所需在孔中加入抗原和待測血清（原待測血清用PBS稀釋4倍后），中間孔加各種APP血清型的抗原（或待測血清），周圍孔加入待測血清（或抗原），設(shè)置陰、陽性對(duì)照孔，每孔加滿為宜，但不要溢出。

（5）加樣好的瓊脂板放入濕盒中，再將濕盒放入37℃恒溫箱中，放置24小時(shí)后觀察結(jié)果。

（6）中央孔加酚水抗原，周圍孔加入待測血清，24小時(shí)溫育后，陽性反應(yīng)即待測血清和抗原之間會(huì)出現(xiàn)一條白色的特異沉淀線，該沉淀線會(huì)靠近抗原孔。血清型1、9、11型之間，血清型3、6之間，為了消除非特異性沉淀線的干擾，可以在有交叉反應(yīng)的血清中加入非對(duì)應(yīng)的血清型菌體，在37℃中震蕩吸收2小時(shí)，以7 000 轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘除去菌體，如果吸收完全，可以去除非特異性沉淀線。例如血清型1型血清用血清型9型菌體吸收后，可以消除交叉反應(yīng)。也可以通過白色沉淀線的清晰度來辨認(rèn)非特異性和特異性沉淀線。

2.2 ApxⅣ-ELISA試驗(yàn)方法

嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)。

（1）稀釋樣品：在血清稀釋板中按照1∶40的體積稀釋待檢血清，195 μL樣品稀釋液中加入5 μL待檢血清樣品。對(duì)照組稀釋：在血清稀釋板中按照1∶4分別稀釋陽性對(duì)照和陰性對(duì)照血清，180 μL樣品稀釋液中加入60 μL對(duì)照血清。

（2）取抗原包被板，將稀釋好的待檢血清、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照血清各取100 μL加入到抗原包被板中，待檢血清設(shè)1孔，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照血清各設(shè)2孔。輕輕振動(dòng)樣品，使其充分混勻，放置在37℃下溫育30分鐘。

（3）溫育后，甩掉板孔中的液體，用洗滌液洗板5次，每次200 μL，每次靜置3分鐘后倒掉洗滌液，并在干凈吸水紙上拍干。

（4）每個(gè)孔加入羊抗豬酶標(biāo)二抗100 μL，放置在37℃下溫育30分鐘。

（5）溫育后洗滌5次，方法同步驟（2）。

（6）每個(gè)孔加入底物A和底物B各1滴（約50μL），混勻后，放置在室溫下（20～25℃）避光顯色10分鐘。

（7）每個(gè)孔加入終止液1滴（約50 μL），10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。

結(jié)果判定：在酶標(biāo)儀上測各孔的OD630 nm值。試驗(yàn)成立的條件是：陽性對(duì)照孔OD630nm值均≥0.6；陰性對(duì)照孔OD630 nm值均＜0.3。如果N（待檢樣品孔OD630 nm值）≥M（陽性對(duì)照孔平均OD630nm值）×0.25，判定為陽性；如果N＜M×0.25，則判定為陰性。

3結(jié)果

見表1和表2。

4分析討論

經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，可以計(jì)算出1 187份血清中陽性血清有378份，陽性率占31.84%。378份陽性血清中感染APP的血清型7型有56份，占14.81%；血清型11型有52份，陽性率占13.76%；血清型10型有48份，陽性率占12.70%；血清型13型有44份，陽性率占11.64%；血清型5型有43份，陽性率占11.38%；血清型1型有40份，陽性率占10.58%；血清型3型有28份，陽性率占7.41%；血清型12型有20份，陽性率占5.29%；血清型4型有19份，陽性率占5.02%；血清型9型有17份，陽性率占4.50%；血清型6型有11份，陽性率占2.91%。由此可見，在APP陽性感染血清中，7型的感染率排在首位，11、10、13、5、1型位居其后，感染陽性率差別不大。這與以前多數(shù)關(guān)于我國APP流行病學(xué)的報(bào)道一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，湖北地區(qū)APP感染陽性率有23.18%，湖南某養(yǎng)豬場APP感染陽性率為87.5%，四川某養(yǎng)豬場為20.63%，山東某養(yǎng)豬場為65.66%，福建某養(yǎng)豬場為42.5%。

表1瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測APP分型結(jié)果　　（份）

表2部分省份豬場APP感染調(diào)查結(jié)果

從ApxⅣ-ELISA試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，湖北、福建、山東總體APP感染平均陽性率為59.21%，湖北地區(qū)APP陽性感染率達(dá)64.61%，其中2號(hào)豬場部分豬的感染率高達(dá)100%，3號(hào)豬場的陽性感染率也達(dá)到了88.33%。由此可見湖北地區(qū)的APP感染情況還是很嚴(yán)重。可能是因?yàn)?號(hào)和3號(hào)養(yǎng)豬場的規(guī)模比較大，飼養(yǎng)密度過大，APP感染和傳播的可能性提高。福建和山東地區(qū)也有不同程度的APP感染。

仔豬APP的感染率不高，育肥豬的感染率平均為75%，種豬感染率為55.24%。這個(gè)結(jié)果和之前多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道APP主要感染1～4月齡的育肥豬是一致的。仔豬體內(nèi)可能還有母源抗體存在，以及仔豬飼料里面的添加劑含有某些抗生素之類的藥物，對(duì)APP的感染有很好地抑制作用，這些都使得APP感染仔豬的可能性降低。育肥豬的感染率相對(duì)較高，可能是與母源抗體的消失以及抗生素的攝取減少、豬舍飼養(yǎng)密度過大、衛(wèi)生條件差、生活環(huán)境改變等因素有關(guān)，還可能是因?yàn)橛守i感染了其他傳染病，使得抵抗力和免疫力降低，從而給PCP的發(fā)生帶來了可能，發(fā)展成為混合感染?？傊?，這些豬場的飼養(yǎng)管理可能存在一些問題，沒有做好預(yù)防APP感染的工作，消毒衛(wèi)生條件差，應(yīng)激因素多，使得豬傳染性胸膜肺炎發(fā)生的可能性大大增加。

由以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，APP已經(jīng)在我國大部分地區(qū)存在，陽性率隨著地區(qū)、豬場的不同而差別較大，不同的地區(qū)、豬場的APP流行程度可能和地理位置、氣候環(huán)境、地域海拔以及豬場的規(guī)模、管理水平、衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)方式、防治情況等因素相關(guān)。

豬傳染性胸膜肺炎已經(jīng)給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，使養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。近年來，我國雖然對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的防治工作做出了巨大努力，也取得了一定的成就，但從調(diào)查的結(jié)果看，其情況還不容樂觀。對(duì)于豬傳染性胸膜肺炎的預(yù)防還是要做好以下幾點(diǎn)。

首先，應(yīng)改善飼養(yǎng)環(huán)境。嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生消毒措施，對(duì)豬舍、豬欄、用具、通道等定期消毒。本病病原菌對(duì)許多常用消毒劑敏感，搞好消毒滅菌工作，減少環(huán)境中病原菌的數(shù)量，可以防止傳染性病原微生物從母豬傳播到仔豬。注意通風(fēng)換氣，保持舍內(nèi)空氣清新。其次，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、提高飼養(yǎng)管理水平。減少各種應(yīng)激因素，保持豬群足夠合理的營養(yǎng)水平。降低豬群飼養(yǎng)密度，改善通風(fēng)條件，做好保溫防暑，限制舍溫變化過大等各種應(yīng)激因素，減少急性病例的發(fā)生。嚴(yán)禁飼喂發(fā)霉飼料，防止產(chǎn)生免疫抑制。加強(qiáng)引種安檢，從無病豬場引種，種豬入場前隔離飼養(yǎng)，防止病豬入場。堅(jiān)持全進(jìn)全出、隔離飼養(yǎng)、隔離治療的原則，應(yīng)堅(jiān)決淘汰那些久治不愈、失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重病豬，杜絕惡性循環(huán)。最后，堅(jiān)持以預(yù)防為主、治療為輔、防治結(jié)合的原則。做好豬偽狂犬病、豬瘟、喘氣病、藍(lán)耳病、副豬嗜血桿菌感染等有關(guān)疫病的免疫接種，特別是對(duì)一些免疫抑制性疾病。對(duì)于本病的免疫預(yù)防，可選用武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)的豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活苗，安全性高，免疫原性好。

5結(jié)論

⑴豬傳染性胸膜肺炎在我國湖北、湖南、四川、廣東、福建、山東等地都有不同程度的存在，總平均陽性率為37.02%

⑵我國湖北、湖南、四川、廣東、福建、山東等地豬傳染性胸膜肺炎陽性感染病例中，胸膜肺炎放線桿菌血清型中7型的感染率排在首位，陽性血清中的占有率為14.81%，血清型11、10、13、5、1型占有率位居其后，它們的感染陽性率差別不大。

⑶胸膜肺炎放線桿菌主要感染育肥豬，所以育肥豬是本病防治的重點(diǎn)對(duì)象。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1673-4645(2015)12-0050-04

收稿日期：2015-08-28