李燕,萬汝根

(1.南陽市中心醫(yī)院 心內(nèi)二科，河南 南陽 473000；2.東陽市人民醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 東陽 322103)

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N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應(yīng)激和核因子NF-κB的干預(yù)研究

李燕1,萬汝根2

(1.南陽市中心醫(yī)院 心內(nèi)二科，河南 南陽 473000；2.東陽市人民醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 東陽 322103)

目的 探討N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應(yīng)激和核因子NF-κB的干預(yù)研究。方法 40 只健康成年大白兔，耳緣注射阿霉素制作心衰模型。8周后取造模成功的27只大白兔隨機(jī)分為心衰組(n=14)和N-乙酰半胱氨酸組(NAC組，n=13)，另取10只為對照組。對照組和心衰組給予注射生理鹽水1 mL/(kg·d)，NAC組給予注射NAC 300 mg/(kg·d)。干預(yù)4 周后，測定各組兔超聲心動圖參數(shù)(LVEDD、LVESD、IVST、EF、FS)、血清及心肌組織總抗氧化能力；酶聯(lián)免疫檢測各組兔血清和心肌組織8-iso-PGF2α的含量；免疫組化和Western blot 檢測NF-κB p65及其抑制物IκB-α在左室心肌細(xì)胞的表達(dá)和核結(jié)合活性的改變。結(jié)果 與對照組相比，心衰組兔左室舒張期末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮期末內(nèi)徑(LVESD)明顯增大(P<0.05)；射血分?jǐn)?shù)(EF)與短軸縮短率(FS)明顯降低(P<0.05)，室間隔厚度(IVST)未見明顯變薄。心衰組血清和心肌的總抗氧化能力均低于對照組(P<0.01)；與心衰組比較，NAC干預(yù)組總抗氧化能力明顯升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NAC注射組較心衰組心肌細(xì)胞NF-κB p65向核內(nèi)移位表達(dá)的陽性細(xì)胞明顯減少，NAC治療后兔心肌細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)較心衰組減少(P<0.05)，IκB-α表達(dá)較心衰組多(P<0.05)。心衰后給予NAC干預(yù)的兔血清和心肌組織8-iso-PGF2α含量較心衰組顯著降低(P<0.05)，血清和心肌8-iso-PGF2α的含量均與心功能顯著相關(guān)(r=0.975,P<0.005;r=0.974,P<0.05)。結(jié)論 氧化應(yīng)激參與了心力衰竭的發(fā)生和心功能的惡化；NAC 可通過抑制氧化應(yīng)激，拮抗NF-κB的活化和其在核內(nèi)的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，有效改善心功能，保護(hù)心肌。

心力衰竭；NF-κB；細(xì)胞凋亡；氧化應(yīng)激；N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種巰基化合物抗氧化劑，為谷胱甘肽的前體，能增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量，穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)細(xì)胞活性，還可直接清除活性氧， 已經(jīng)證實(shí)它能對抗缺血再灌注等病理狀態(tài)下因活性氧所引起的細(xì)胞凋亡[1]。NAC具有強(qiáng)大的抗氧化活性，同時也是一種NF-κB的抑制劑，目前作為心、腦缺血再灌注損傷的保護(hù)劑被人們重新認(rèn)識。它在減輕缺血再灌注損傷的同時對心力衰竭是否有影響，其對心衰中NF-κB是否影響心肌細(xì)胞的凋亡，心力衰竭的發(fā)生發(fā)展是否與其復(fù)雜的藥理作用機(jī)制有關(guān)，關(guān)于這方面的研究甚少。本課題在已公認(rèn)的阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰的兔模型基礎(chǔ)上，觀察兔左室心肌細(xì)胞NF-κB的活化、易位和蛋白表達(dá)變化與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系、凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、iNOS基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)變化以及心功能改變，同時對照觀察NAC對上述指標(biāo)的影響，探討氧化應(yīng)激及核因子NF-κB在心衰中的發(fā)生機(jī)制，以期闡明NAC發(fā)揮心臟保護(hù)的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：50只健康大白兔，雌雄不限，兔齡5～6個月，體質(zhì)量(2.50±0.35)kg, 購于南京安立默科技發(fā)展有限公司，動物合格證號：SYXK(蘇)2002-0017。本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

1.1.2 主要試劑和試劑盒：鹽酸阿霉素注射劑(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號050907)，NAC(乙酰半胱氨酸)注射液(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號0510081)，磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，蛋白分子量(Marker Promega 公司)，ECM 顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，PVDF 膜(美國NEC)，細(xì)胞裂解液(Pierce 公司)。

游離脂肪酸試劑盒、乳酸試劑盒和ATP 酶試劑盒、總抗氧化能力試劑盒(南京建成生物工程研究所)，8-iso-PGF2α定量酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(純化的鼠抗兔IgG 包被的微孔板、8-iso-PGF2α抗體和Ache 標(biāo)記的8-iso-PGF2α抗原及其他試劑組成)、鼠抗兔多克隆NF-κB p65、IκB-α 抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)，NF-κB、IκB-α兔SP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SABC試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心力衰竭動物模型的制備和分組：隨機(jī)選取40 只健康大白兔，根據(jù)Dorr RT文獻(xiàn)[2]將鹽酸阿霉素用生理鹽水稀釋成1 mg/mL溶液，耳緣靜脈注射，每次按1.0 mg/kg體質(zhì)量給藥，每周2次，連續(xù)8周，制作兔心衰模型。取造模8周后成功的27 只大白兔隨機(jī)分為心衰組(n=14)和NAC 干預(yù)組(n=13)，NAC組給予NAC注射液300 mg/kg，耳緣靜脈注射，每天1次，共4 周，對照組與心衰組均注射等體積生理鹽水。剩余10只大白兔設(shè)為對照組，耳緣靜脈注射生理鹽水1 mL/kg，每周2 次，連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)動物單籠喂養(yǎng)，自由飲水。定期稱體質(zhì)量，以上3組實(shí)驗(yàn)周期為12周，各組動物年齡、體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2 超聲心動圖檢查：37只大白兔均在12周末進(jìn)行超聲心動圖檢查。檢查前剪去胸前絨毛并肌肉注射安定2 mg鎮(zhèn)定。切面選擇常規(guī)胸骨旁左室長軸切面二維條件下測量左房和左室內(nèi)徑、左室舒張期末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮期末內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)和室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)，乳頭肌水平短軸切面行M型取樣以計(jì)算射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fraction shortening，F(xiàn)S)、胸骨旁四腔和觀察室壁運(yùn)動，肺動脈長軸切面測量肺動脈內(nèi)徑和頻譜。取心尖三腔、四腔或五腔切面測量主動脈和二尖瓣頻譜。

1.2.3 血清及心肌組織總抗氧化能力(TAOC)測定：動物處死前留取2 mL靜脈血，以3500 r/min離心15 min后留取血清，放于低溫冰箱保存(-20 ℃)備用。取液氮凍存的左心室肌稱重后，于冰浴中剪碎，制備成10%的心肌組織勻漿液，將勻漿1000 r/min離心10 min后留取上清液，分別測定血清及心肌組織中TAOC(采用比色法)。

1.2.4 定量酶聯(lián)免疫檢測兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量：采用抗原競爭EIA 法(美國Cayman 化學(xué)公司)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動物前留取2 mL靜脈血，4000 r/min離心15 min取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∫旱獌龃娴淖笮氖壹〗M織，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(含0.1 mmol的EDTA)，用勻漿器制成組織勻漿液，將勻漿4000 r/min離心15 min后留取上清備用，檢測8-iso-PGF2α。

2 結(jié)果

2.1 N-乙酰半胱氨酸對心衰兔氧化應(yīng)激的干預(yù)作用

2.1.1 3組動物超聲心動圖各參數(shù)值比較：經(jīng)胸超聲心動圖結(jié)果：與對照組相比，心衰組兔左室舒張期末內(nèi)徑、左室收縮期末內(nèi)徑均增大(P<0.05)；射血分?jǐn)?shù)與短軸縮短率降低(P<0.05)，室間隔厚度未見明顯變薄，見表1。NAC組上述各指標(biāo)較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 3組動物超聲心動圖各參數(shù)值比較±s)Tab.1 Comparison of each parameter value of echocardiography parameters among three ±s)

#P<0.05，與對照組比，compared with control group；*P<0.05，與心衰組比，compared with heart failure group

2.1.2 血清及心肌組織總抗氧化能力的變化：心衰組血清和心肌的總抗氧化能力均低于對照組(P<0.01)；與心衰組比較，NAC干預(yù)組總抗氧化能力明顯升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 3組動物血清及心肌組織TAOC比較±s)Tab.2 Comparison of TAOC in serum and myocardial tissue among three ±s)

#P<0.05，與對照組比，compared with control group；*P<0.01，與心衰組比，compared with heart failure group

2.1.3 血清和心肌8-iso-PGF2α的含量變化：從表3可知，兔心衰后血清和心肌組織8-iso-PGF2α水平明顯高于對照組(P<0.05)，而心衰后給予NAC干預(yù)的兔血清和心肌組織8-iso-PGF2α的含量較心衰組顯著降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.001)。

表3 3動物血清及心肌組織8-iso-PGF2α含量比較Tab.3 Comparison of serum and myocardial tissue 8-iso-PGF2αcontents among three ±s,pg/mg)

#P<0.05，與對照組比，compared with control group；*P<0.05，與心衰組比，compared with heart failure group

2.1.4 8-iso-PGF2α與心功能的相關(guān)性：直線相關(guān)分析結(jié)果顯示：血清和心肌組織的8-iso-PGF2α水平之間存在著直線關(guān)系(F=220.59，P<0.005)，相關(guān)系數(shù)為0.975，具有顯著意義(P<0.005)。氧化應(yīng)激指標(biāo)血清和心肌8-iso-PGF2α與心功能相關(guān)分析結(jié)果顯示：血清和心肌8-iso-PGF2α水平與心功能指標(biāo)LVEDP、±dp/dtmax呈顯著直線相關(guān)，與其中LVEDP增高程度平行(P<0.01)，與±dp/dtmax均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)，說明阿霉素誘導(dǎo)心衰兔中的血流動力學(xué)惡化與氧化應(yīng)激有關(guān)。見表4。

表4 8-iso-PGF2α與心功能的相關(guān)性Tab.4 Correlation of 8-iso-PGF2α and cardiac function

2.2 N-乙酰半胱氨酸對兔心衰中核因子NF-κB的干預(yù)作用 NAC對心衰兔心肌細(xì)胞NF-κB p65蛋白結(jié)合活性的影響：對照組NF-κB p65主要存在于胞質(zhì)，無明顯核表達(dá)。心衰組可見NF-κB p65大量活化，從胞質(zhì)移位于細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB p65蛋白在心肌細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)較對照組增多。NAC注射組較心衰組心肌細(xì)胞NF-κB p65向核內(nèi)移位表達(dá)的陽性細(xì)胞減少。見圖1。

圖1 各組NF-κB p65蛋白免疫組化染色結(jié)果(×400)Fig.1 Immunohistochemical staining results of NF-κB p65 protein in each groups (×400)

心肌細(xì)胞NF-κB p65和IκB-α蛋白表達(dá)的變化： SDS-PAGE凝膠電泳照片,見圖2。心衰組兔左室心肌NF-κB p65蛋白表達(dá)高于正常組(P<0.05)，IκB-α蛋白低于正常組(P<0.05)；NAC治療后兔心肌細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)較心衰組減少(P<0.05)，IκB-α表達(dá)較心衰組增多(P<0.05)，但與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 3組心肌NF-κB p65和IκB-α蛋白表達(dá)比較1，2 ：正常組；3，4：心衰組；5，6：NAC組#P<0.05，與對照組比；*P<0.05，與心衰組比Fig.2 Comparison of myocardial NF-κB p65 and IκB-α protein expression among three groups1,2:control group;3,4: heart failure group;5,6:NAC group#P<0.05, compared with control group;*P<0.05, compared with heart failure group

3 討論

很多種疾病在其病理發(fā)展過程中大都伴有超氧自由基的生成，它們能引起脂質(zhì)過氧化造成組織損傷。近年來，人們已建立了一些反映體內(nèi)氧自由基的生化指標(biāo)，如超氧化物歧化酶(SOD)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)等，但它們易受體內(nèi)外因素的影響，其特異性和敏感性均較低[3-5]。且測定結(jié)果不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)真實(shí)水平，臨床意義有限。異構(gòu)前列腺素(iso-PGF2α)是一種具有生物活性的擬前列腺物質(zhì)，通過非環(huán)氧化酶催化的自由基分解機(jī)制，損傷脂質(zhì)細(xì)胞膜花生四烯酸后，經(jīng)自由基脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物，性質(zhì)穩(wěn)定，這一代謝途徑不受阿司匹林、吲哚美辛等的影響，只與氧自由基有關(guān)，在氧化性水平升高的情況下大量生成，在體液內(nèi)含量非常穩(wěn)定。Iso-PGF2α是一組異構(gòu)體衍生物，其中含量最高的是8-表氧-PGF2α(8-iso-PGF2α)，目前研究的主要成分是8-iso-PGF2。因此8-iso-PGF2α被認(rèn)為是一種反映氧自由基增加所致的脂質(zhì)過氧化作用有較高敏感和特異性的生化指標(biāo)，也是臨床上作為評價抗氧化劑療效的較理想生化指標(biāo)[6]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，注射阿霉素后兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量增多，總抗氧化能力下降，說明用藥后發(fā)生了氧化應(yīng)激，直線相關(guān)分析顯示血清和心肌組織8-iso-PGF2α水平之間存在著直線關(guān)系，說明血清8-iso-PGF2α水平可以反映心肌氧化應(yīng)激的程度。而8-iso-PGF2α與心功能進(jìn)行相關(guān)分析的結(jié)果顯示：血清和心肌8-iso-PGF2α水平與心功能指標(biāo)LVEDP、±dp/dtmax呈顯著直線相關(guān)，心功能下降與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，隨著氧化應(yīng)激的加重，心功能受損也越嚴(yán)重，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。同時，本實(shí)驗(yàn)對心衰兔進(jìn)行了為期4周的NAC藥物干預(yù)后，觀察到NAC明顯升高了血清及心肌總抗氧化能力，且血清和心肌組織中變化保持一致，降低了心衰兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量，從而降低了體內(nèi)氧化應(yīng)激的水平，推測NAC改善心功能的內(nèi)在機(jī)制可能為：直接清除過多的活性氧，抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高心肌的抗氧化能力，改善心衰的血流動力學(xué)指標(biāo)，從而改善心功能。本研究結(jié)果也顯示在心衰兔心肌中IκB-α蛋白水平降低，并存在NF-κB 持續(xù)漸活化增多，表明 NF-κB p65的激活與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。NAC不僅是抗氧化劑，還是半胱氨酸和谷光甘肽的前體，后一個特性使得NAC與其他抗氧化劑區(qū)別開來，NAC能提高心肌谷光甘肽的含量40%，抑制TNF-α介導(dǎo)的ROS活性氧簇的產(chǎn)生[7]，消除高劑量TNF-α對鈣瞬變和心電刺激心肌細(xì)胞收縮的不良影響。

綜上所述， NAC可通過升高血清及心肌總抗氧化能力，降低心衰兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量和NF-κB p54、IκB-α蛋白表達(dá)水平，有效改善心功能，保護(hù)心肌。

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(編校：王儼儼，吳茜)

Effect of N-acetylcysteine on oxidative stress and NF-κB in heart failure rabbits and its mechanism

LI Yan1,WAN Ru-gen2

(1.Department of Cardiology, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, China; 2.Department of Cardiology, Dongyang People’s Hospital, Dongyang 322103, China)

ObjectiveTo explore the intervention of N-acetylcysteine on oxidative stress and NF-κB in heart failure rabbit and its mechanism.Methods40 healthy mature rabbits with heart failure caused by adriamycin administration through ear venous were modeled.27 rabbits were survival after modeling 8 weeks, and randomly divided into heart failure group (n=14) and N-acetylcysteine group (NAC,n=13).10 another healthy rabbits were chosen as control group.The heart failure group and control group were administrated with saline 1 mL/ (kg·d)and NAC group with NAC 300 mg/ (kg·d).After four weeks, echocardiography parameters (LVEDD，LVESD，IVST，EF and FS), total antioxidant capacity in serum and cardiac muscle tissue of each group were measured.The content of 8-iso-PGF2αin serum and myocardial tissue were detected by ELISA.The change of NF-κB p65 and its inhibitor IκB-α protein expression and nuclear binding activity in the left ventricular myocardial cell were detected by immunohistochemical method and Western blot.ResultsCompared with control group, the left ventricular end diastolic diameter and left ventricular end systolic diameter in heart failure group increased (P<0.05), the ejection fraction and fractional shortening decreased (P<0.05), but interventricular septal thickness was not showing significantly thinner.Total antioxidant capacity in serum and myocardium of heart failure group were lower than those of control group (P<0.01), Compared with heart failure group, the total antioxidant capacity increased in NAC group (P<0.05), and the total antioxidant capacity in control group and NAC group had no statistical difference.The numbers of positive myocardial cells of NF-κB p65 nuclear translocation in NAC group significantly reduced than those in heart failure group NF-κB p65 expression in myocardium of NAC group was lower than heart failure group(P<0.05),and IκB-α expression was higher than heart failure group(P<0.05).The content of 8-iso-PGF2αin serum myocardium of NAC group was significantly lower than that of heart failure group, respectively(P<0.05).The content of 8-iso-PGF2αin serum and myocardium was associated with cardiac function(r=0.975,P<0.005;r=0.974,P<0.05). ConclusionThe oxidative stress is involved in the occurrence and deterioration of cardiac function in heart failure.NAC has strong antioxidant activity, which could inhibit the activation and nuclear expression of NF-κB, reduce apoptosis and myocardial inflammation reaction, and improve cardiac function with myocardial protection.

heart failure; nuclear factor-κB; apoptosis; oxidative stress; N-acetylcystein

浙江省衛(wèi)生廳(2011KYB151)

李燕，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病介入治療，E-maili：ly12114@163.com。

R96

A

1005-1678(2015)02-0055-04