白羽，臧學(xué)麗，張四喜，徐廣宇

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，吉林 長春 130031；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科，吉林 長春 130021；4.北華大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

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miR-199a對膀胱癌抑制作用的研究

白羽1，臧學(xué)麗2，張四喜3，徐廣宇4

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，吉林 長春 130031；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科，吉林 長春 130021；4.北華大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的 研究miR-199a對膀胱癌的抑制作用。方法 按處理方法不同將T24膀胱癌細(xì)胞分為空白對照組(control group)、pre-scamble轉(zhuǎn)染組(pre-scamble group)、pre-miR-199a轉(zhuǎn)染組(pre-miR-199a group)。采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染miR-199a對細(xì)胞增殖的影響，用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染miR-199a后對細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 pre-miR-199a group OD 值(0.436±0.042)顯著低于control group(0.634±0.020)和pre-scamble group(0.601±0.059)(P<0.05)。pre-miR-199a group細(xì)胞凋亡率為(19.25±1.57)%，顯著高于control group(10.19±0.98)%和pre-scamble group(12.27±1.38)%(P<0.05)。Control group、pre-scamble group和pre-miR-199a group的G1期細(xì)胞百分比分別為45.09%、47.57%、58.62%，轉(zhuǎn)染pre-miR-199a使細(xì)胞停滯在G1期。pre-miR-199a group細(xì)胞透過濾膜的平均個(gè)數(shù)為(46.00±1.58)個(gè)，顯著低于control group(67.00±1.58)個(gè)、pre-scamble group(61.20±1.30)個(gè)(P<0.05)。結(jié)論 miR-199a能抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。

miR-199a；膀胱癌；增殖；凋亡；細(xì)胞周期；侵襲

膀胱癌是臨床上常見的腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中占第7位。在中國，膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的腫瘤[1-2]。因此膀胱癌的治療任重而道遠(yuǎn)。隨著基因治療的不斷深入，miRNAs在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷與治療開辟了新的道路[3]。最近的研究表明miR-199a參與多種細(xì)胞腫瘤的形成與發(fā)展。Murakami[4]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)明顯降低。Yu T[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a在口腔癌的發(fā)展過程密切相關(guān)，并作為病情判斷的指標(biāo)。但目前很少有對miR-199a對膀胱癌抑制作用的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在揭示miR-119a與膀胱癌形成的關(guān)系，為膀胱癌的治療提供新的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：T24膀胱癌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫

主要試劑：胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、PBS磷酸緩沖液，購自Hyclone；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑，購自Invitrogen；Opti-MEM培養(yǎng)基，購自Gibco；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒，購自Keygen；細(xì)胞周期檢測試劑盒，購自凱基生物公司；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板，購自BD公司。

儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan Spectum Microplate 酶標(biāo)儀，購自Thermo scientific；BDFACSCantoII流式細(xì)胞儀，購自BD公司；超凈工作臺(tái)，購自蘇州安泰公司；U-CTR30-2倒置光學(xué)顯微鏡，OLYMPUSCKX41。

引物miR-199a，miR-199a-RT 5’-CTCAACTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAGGAACAGGT-3’;miR-199a-F 5’-ACACTC-CAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3’;miR-199a-R 5’-TGGTG-TCGTGGAGTCG-3’上海英俊生物公司提供；miRNA模擬物，Pre-miR negative control。

1.2 方法 按照司彤[6]的方法并稍作修改進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，5×103細(xì)胞/孔，每組3個(gè)復(fù)孔，讓細(xì)胞進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)使用pre-miR-199a(由miR-199a引物轉(zhuǎn)染)、pre-scramble(由不含miR-199a的miRNA模擬引物轉(zhuǎn)染)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)每孔加入200pmol RNA oilgo、5 μL Lipofectamine 2000、500 μL無血清培養(yǎng)液，混勻后室溫孵育20 min，6h后更換為10%小牛血清培養(yǎng)基。按處理方法不同分為空白對照組(control group)、pre-miR-199a轉(zhuǎn)染組(pre-miR-199a group)、pre-scamble轉(zhuǎn)染組(pre-scamble group)。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入無血清培養(yǎng)液，加入轉(zhuǎn)染混合物，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，6 h后換成10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 1:10稀釋的MTT底物溶液，于37 ℃反應(yīng)2 h后使用酶聯(lián)儀測OD450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖的抑制率。

1.2.2 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡：將細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞用2 mL PBS洗滌，之后棄去PBS溶液，將細(xì)胞置于冰上，加入0.25%的胰蛋白酶0.5 mL，孵育，并輕輕吹打使細(xì)胞從培養(yǎng)板壁上脫落。將細(xì)胞預(yù)冷與1×結(jié)合緩沖液中使其密度約為1×106細(xì)胞/mL。取0.5 mL細(xì)胞懸液到離心管中，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫下避光反應(yīng)15 min，之后常溫1000 r/min，離心5 min，棄去上清，再次用0.5 mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL Propidium Iodide，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期：按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，4 ℃，1000 r/min，離心5 min，PBS充分懸浮細(xì)胞，上述條件再次離心2次，加入-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇1 mL，混勻后4 ℃固定24 h。離心收集細(xì)胞，用1 mL PBS洗滌細(xì)胞，加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化丙啶，100 μg/mL RNaseA，0.2%Triton-X-100,4 ℃避光孵育30 min，之后用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：調(diào)整處于對數(shù)生長期的B、C組細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×105細(xì)胞/mL，將100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，將600 μL完全培養(yǎng)液加入對應(yīng)的底部24孔板各孔中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)16 h，之后用棉簽擦除Transwell小室內(nèi)部的細(xì)胞，乙醇固定細(xì)胞10 min，用結(jié)晶紫染液染色。顯微鏡下觀察處于微孔濾膜側(cè)面上的侵襲的腫瘤細(xì)胞，400倍顯微鏡(OLYMPUSCKX41)下計(jì)數(shù)隨機(jī)5個(gè)不同視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取平均值，細(xì)胞數(shù)目反映了細(xì)胞侵襲能力的高低。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-199a后的OD值顯著低于control group和pre-scamble group(P<0.05)見表1。

表1 MTT法觀察各組T24膀胱癌細(xì)胞的增殖(n=3)Tab.1 Proliferation of T24 bladder cancer cell in each group determined by MTT method(n=3)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group；#P<0.05，與pre-scramble group比較，#P<0.05，compared with pre-scramble group

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 經(jīng)pre-miR-199a轉(zhuǎn)染后T24膀胱癌細(xì)胞的凋亡率為(19.25±1.57)%，與control group (10.19±0.98)%和pre-scamble group (12.27±1.38)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡的檢測(n=3)*P<0.05，與control group比較；#P<0.05，與pre-scramble group比較Fig.1 Cell apoptosis detected by flow cytometry(n=3)*P<0.05，compared with control group; #P<0.05，compared with pre-scramble group

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 Control group、pre-scamble group和pre-miR-199a group的G1期細(xì)胞百分比分別為45.09%、47.57%、58.62%，可見轉(zhuǎn)染pre-miR-199a使細(xì)胞停滯在G1期。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期的檢測Fig.2 Cell cycle detected by flow cytometry

組別細(xì)胞周期(%)G1SG2空白對照組45.0934.5820.33pre-scamble轉(zhuǎn)染組47.5733.3219.11pre-miR-199a轉(zhuǎn)染組58.6224.1817.20

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)是通過計(jì)數(shù)細(xì)胞透過濾膜的個(gè)數(shù)來衡量細(xì)胞侵襲能力的，見圖3。3組細(xì)胞透過濾膜的平均個(gè)數(shù)分別為(67.00±1.58)、(61.20±1.30)、(46.00±1.58)個(gè)?？梢妏re-miR-199a group與其余2組相比具有明顯的差異性(P<0.05)。說明T24膀胱癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pre-miR-199a后細(xì)胞侵襲能力下降。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×400,n=5)*P<0.05，與control group比較；#P<0.05，與pre-scramble group比較Fig.3 Result of transwell experiment (×400,n=5)*P<0.05，compared with control group; #P<0.05，compared with pre-scramble group

3 討論

miRNA屬于小RNA家族，通常長度為18～24個(gè)核苷酸。其大部分位于編碼蛋白或非編碼蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子中[7-8]。目前對miRNAs的了解甚少，目前的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、代謝以及個(gè)體發(fā)育和病毒感染等過程[9]。尤其是miRNA對腫瘤細(xì)胞增殖的影響成為目前研究的熱點(diǎn)。Porkka KP等[10]發(fā)現(xiàn)miR-199a在前列腺癌中的表達(dá)下調(diào)。Lee JW等[11]的研究發(fā)現(xiàn)miR-199a在宮頸癌中的表達(dá)上調(diào)。可見miR-199a在個(gè)腫瘤細(xì)胞中的作用不盡相同。本研究中通過MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-199a后膀胱癌細(xì)胞的增殖明顯受到了影響。一般細(xì)胞的分裂要經(jīng)歷G0/G1、S以及G2/M期，代表DNA合成前期、DNA的合成期和DNA的合成后期。本實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-199a能使膀胱癌細(xì)胞停滯在G1期，通過影響DNA的合成進(jìn)而干擾膀胱癌細(xì)胞的有絲分裂。腫瘤細(xì)胞的侵襲是其生長的主要方式，腫瘤細(xì)胞可以呈巢或條索狀沿組織間隙生長，破壞原有的組織結(jié)構(gòu)，也可以如流水樣沿組織間隙擴(kuò)散，保留原有的組織結(jié)構(gòu)。但無論怎樣侵襲是惡性腫瘤的重要標(biāo)志，常發(fā)生于腫瘤的晚期階段，對治療帶來極大的挑戰(zhàn)。本研究中轉(zhuǎn)染miR-199a后可見膀胱癌對組織的浸潤能力遠(yuǎn)較其他組下降。更進(jìn)一步明確了其在對抗膀胱癌中的作用。miRNA抑制腫瘤的細(xì)胞的作用機(jī)制各異，miR-29a能抑制乳腺癌TTP蛋白的高表達(dá)[12]。MiR-15a和miR-16通過調(diào)節(jié)AKT3、RPS6、MAP激酶和NF-κB激活MAP3KIP3進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤活性[13]。關(guān)于miR-199a抑制膀胱癌的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究明確。

[1] Ploeg M，Aben KK,Kiemeney LA.The present and future burden of urinary bladder Cancer in the world[J].World J Urol,2009,27(3):289-293.

[2] 赫捷，趙平，陳萬青.2011中國腫瘤登記年報(bào)仁[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012：2-5，26-37，74-75.

[3] Calin GA,Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers [J].Nat Rev Cancer,2006,6(11):857-866.

[4] Murakami Y,Yasuda T,Saigo K,et al.Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues[J].Oncogene,2006,25(17):2537-2545.

[5] Yu T,Wang XY,Gong RG,et al.The expression profile of microRNAs in a model of 7,12-dimethyl-benz[a]anthrance-induced oral carcinogenesis in Syrian hamster[J].J Exp Clin Cancer Res,2009,28:64.[6] 司彤.miR-199a在腎細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床意義及其對腎癌細(xì)胞生物學(xué)性狀影響的實(shí)驗(yàn)研究[M].南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

[7] Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[8] Rodriguez A,Griffiths-Jones S,Ashurst JL,et al.Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units[J].Genome Res,2004,14(10):1902-1910.

[9] Pillai RS.MicroRNA function:multiple mechanisms for a tiny RNA? [J].RNA,2005,11(12):1753-1761.

[10] Porkka KP,Pfeiffer MJ,Waltering KK,et al.MicroRNA expression profiling in prostate cancer[J].Cancer Res 2007,67(13):6130-6135.

[11] Lee JW，Choi CH，Choi JJ，et al.Altered MicroRNA expression in cervical carcinomas[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2535-2542.

[12] Gebeshuber CA,Zatloukal K,Martinez J.miR-29a suppresses tristetraprolin,which is a regulator of epithelial polarity and metastasis[J].EMBO Rep,2009,10(4):400-405.

[13] Zhu JY,Pfuhl T,Motsch N,et al.Identification of novel Epstein-Barr virus microRNA genes from nasopharyngeal carcinomas[J].J Virol,2009,83(7):3333-3341.

(編校：王儼儼)

Inhibitory effect of miR-199a on bladder cancer

BAI Yu1, ZANG Xue-li2, ZHANG Si-xi3, XU Guang-yu4

(1.College of Pharmacy, Jilin Medical University, Jilin 132013, China; 2.Department of Pharmacy,Changchun Medical College, Changchun 130031, China; 3.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China; 4.College of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013,China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of miR-199a on bladder cancer.MethodsT24 bladder cancer cells were divided into control group, pre-scamble group and pre-miR-199a group according to different treatment.Cell proliferation was assayed by MTT, cell apoptosis and cell cycle by flow cytometry, and cell invasion by Transwell.ResultsThe OD value of pre-miR-199a group (0.436±0.042) was significantly lower than that of control group (0.634±0.020) and pre-scamble group (0.601±0.059)(P<0.05).Cell apoptosis of pre-miR-199a group(19.25±1.57)% was higher than that of control group(10.19±0.98)% and pre-scamble group(12.27±1.38)%(P<0.05).The cell ratio in G1 phase of control group、pre-scamble group and pre-miR-199a group was 45.09%, 47.57%, and 58.62%, respectively.The cell cycle arrested in G1 phase after transfected with pre-miR-199a.The cells migration number of pre-miR-199a group (46.00±1.58) was lower than those of control group(67.00±1.58) and pre-scamble group(61.20±1.30)(P<0.05).ConclusionMiR-199a could inhibit the growth of bladder cancer cells.

miR-199a; bladder cancer; proliferation； apoptosis; cell cycle; migration

衛(wèi)計(jì)委吳階平專項(xiàng)基金(320.6750.13216)；吉林省教育廳資助項(xiàng)目(吉教科合字[2014]第505 號)；北華大學(xué)博士啟動(dòng)基因項(xiàng)目(2014)

白羽，女，博士，講師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：baiyu218@163.com；徐廣宇，通訊作者，男，博士，講師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：xuguangyu2005@163.com。

R737.14

A

1005-1678(2015)07-0032-03