王文娟，王炳全，韓軍

(聊城大學(xué) 生物制藥研究院，藥學(xué)院，山東 聊城 252059)

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熱力學(xué)研究輔料與蛋白藥物之間的相互作用

王文娟，王炳全Δ，韓軍

(聊城大學(xué) 生物制藥研究院，藥學(xué)院，山東 聊城 252059)

目的 研究不同輔料(氨基酸、糖類(lèi)、非離子型表面活性劑)對(duì)蛋白藥物IgG1單抗熱穩(wěn)定性的影響，探討輔料與蛋白之間的相互作用，判斷輔料與蛋白之間是否存在結(jié)合作用。方法 通過(guò)差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)獲得蛋白的變性溫度(Tm)或蛋白某一結(jié)構(gòu)域的變性溫度。采用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry ，ITC)測(cè)定蛋白與不同輔料之間的相互作用。結(jié)果 帶負(fù)電荷的氨基酸可以明顯降低IgG1單抗的變性溫度(△Tm>9 ℃)，其他輔料作用不明顯(△Tm<1 ℃)。不同pH下輔料對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響不同， 在pH=5時(shí)帶負(fù)電荷的氨基酸對(duì)IgG1單抗熱穩(wěn)定性的影響大于pH=7時(shí)。ITC實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示各種輔料和IgG1單抗的滴定等溫線近乎一條直線。結(jié)論 IgG1單抗與輔料之間不存在特異性相互作用，帶負(fù)電荷的氨基酸可以明顯降低IgG1單抗的變性溫度，應(yīng)該歸功于2者之間的靜電相互作用。

蛋白制劑；IgG1單抗；蛋白熱穩(wěn)定性；輔料；氨基酸；相互作用

隨著基因工程和生物制造工藝技術(shù)的發(fā)展，蛋白藥物發(fā)展越來(lái)越快。單克隆抗體由于其低的毒、副作用和高特異性，而逐漸成為安全有效的新型蛋白藥物，并在治療癌癥、心血管疾病和炎癥領(lǐng)域表現(xiàn)突出[1-3]。然而單克隆抗體治療一般需要定期給藥且所需劑量大，一般每周需要幾個(gè)mg/kg的量?，F(xiàn)在上市的單克隆抗體大多是靠靜脈注射方式給藥[4]，給患者帶來(lái)很多不便。皮下注射是一種安全便利的給藥途徑，且注射體積較小(小于1.5 mL)[5]，故需要較高濃度的單抗以滿(mǎn)足高劑量(100～400 mg)的要求。皮下給藥途徑的發(fā)展促進(jìn)了高濃度(一般大于50 mg/mL)蛋白藥物的發(fā)展[6]。

然而，生產(chǎn)高濃度蛋白藥物有很高的挑戰(zhàn)性。高濃度蛋白溶液的粘度一般較高，這給準(zhǔn)確填充裝瓶造成了困難。另外，蛋白質(zhì)的降解尤其是蛋白的團(tuán)聚現(xiàn)象在不同的生產(chǎn)工藝下都可能出現(xiàn)。團(tuán)聚的比例和程度與多種因素有關(guān)，如蛋白的物理-化學(xué)性質(zhì)、溶液條件、蛋白濃度及輔料。還有工藝上的因素，如無(wú)菌過(guò)濾、凍結(jié)和解凍的循環(huán)、液體蛋白藥物運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程都會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)團(tuán)聚。蛋白質(zhì)聚集會(huì)影響藥物的生物活性，還可能誘導(dǎo)患者的免疫反應(yīng)[7-8]。因此，如何提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是高濃度蛋白配方和生產(chǎn)的一大挑戰(zhàn)[9-12]。

蛋白藥物的穩(wěn)定性受各種因素的影響，如蛋白分子構(gòu)象的改變，蛋白質(zhì)團(tuán)聚體的形成都會(huì)受pH，緩沖液，離子強(qiáng)度等因素影響。當(dāng)前，提高蛋白藥物穩(wěn)定性常用的方法是嘗試加入不同輔料如各種氨基酸或各種表面活性劑等盡量減少蛋白-蛋白之間的相互聯(lián)結(jié)及團(tuán)聚現(xiàn)象。Shire小組[9]研究發(fā)現(xiàn)高濃度液體導(dǎo)致較強(qiáng)的蛋白分子之間的相互作用，蛋白分子之間距離更接近。Nichols等[12]通過(guò)設(shè)計(jì)降低溶液粘度的單克隆抗體突變體發(fā)現(xiàn)，靜電作用比疏水作用力在單抗分子間的相互作用中起更主要的作用。Inoue等[13]通過(guò)測(cè)定加入了不同輔料(LysHCl，GdnHCl，ArgHCl， NaCl)的牛丙種球蛋白(Bovine gamma globulin ，BGG)粘度發(fā)現(xiàn)精氨酸鹽酸鹽(ArgHCl)對(duì)降低高濃度牛丙種球蛋白溶液粘度有較好的作用，他們認(rèn)為ArgHCl的胍基與抗體上的芳香環(huán)有較強(qiáng)親和力，加入ArgHCl阻止了蛋白分子間的相互作用。精氨酸(Arg)作為抑制蛋白團(tuán)聚的輔料已用于上市的藥物中[14]。Lilyestrom 等[15]研究了在pH 6.0及不同的離子強(qiáng)度下IgG1寡聚物的狀態(tài)及其流變特性之間半定量的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)IgG1溶液的流變學(xué)與單抗聚集成簇的尺寸的熱力學(xué)平衡相關(guān)，與細(xì)長(zhǎng)的寡聚物結(jié)構(gòu)的粘性行為一致。還有，非離子型表面活性劑也是常用的輔料[16]。其中，吐溫20和吐溫80又是非離子表面活性劑中最常用的，既能防止表面吸附又能防止蛋白質(zhì)團(tuán)聚，從而提高高濃度蛋白配方的穩(wěn)定性[17-19]，又因其低毒性，被廣泛應(yīng)用于注射用蛋白藥物中[6]。

雖然近來(lái)對(duì)輔料與蛋白藥物的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但目前關(guān)于輔料提高抗體蛋白溶液流變性和穩(wěn)定性的機(jī)制還不太明確，輔料特別是不同的氨基酸與蛋白分子之間的相互作用還未深入了解。本研究旨在使用帶不同電荷的氨基酸(正電荷， 負(fù)電荷和不帶電荷)和表面活性劑作為輔料，采用不同的熱力學(xué)手段探討輔料與蛋白分子之間是否存在直接相互作用。本研究通過(guò)對(duì)比不同蛋白藥物與不同表面活性劑的相互作用差異，以期為蛋白藥物配方和工藝條件選擇最優(yōu)的輔料及pH值，為生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 IgG1單抗(上海張江生物技術(shù)有限公司制備)，人血清白蛋白(HSA，廣東雙林生物制藥有限公司，批號(hào)20140302)。本實(shí)驗(yàn)用的蛋白是經(jīng)透析處理獲得的無(wú)其他輔料的蛋白溶液。由Sigma生產(chǎn)的吐溫20(tween 20; polysorbate 20)、吐溫80(tween 80; polysorbate80)；及由Biotopped生產(chǎn)的蔗糖(sucrose)、精氨酸(Arg)、賴(lài)氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)均為分析純級(jí)。

1.2 主要儀器 MicroCal?VP-DSC(Malvern), MicroCal?ITC-200(Malvern)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 DSC實(shí)驗(yàn)中蛋白濃度為0.7 mg/mL， Arg和Lys是40 mM，Asp， Glu， Phe和Tyr是25 ℃時(shí)的飽和溶液，吐溫20和吐溫80濃度是0.2%，配3種不同pH值(5、6、7)的磷酸鹽緩沖液，濃度為20 mM。加熱范圍是25 ℃～78 ℃，加熱速率是1 ℃/min。每次實(shí)驗(yàn)之前先掃參比3～5遍，參比與樣品實(shí)驗(yàn)條件相同，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，所得數(shù)據(jù)為3次平均值，所得結(jié)果用ORIGIN軟件分析。

ITC實(shí)驗(yàn)中的蛋白濃度為0.1 mM,磷酸鹽緩沖液20 mM。ITC實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)速為650r/min，注射器容量40 μL，2 μL/滴，池子容量為280 μL。滴定速率0.05 μL/s，間隔為180 s，初始平衡時(shí)間是300 s，平衡溫度 25 ℃，參照功率5 μcal/s。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，所得結(jié)果用ORIGIN軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 輔料對(duì)IgG1單抗熱穩(wěn)定性的影響 分別加入不同輔料(氨基酸、糖和表面活性劑)，通過(guò)DSC方法測(cè)得的蛋白變性溫度(Tm值)與沒(méi)加入輔料之前對(duì)比，有些輔料對(duì)蛋白Tm值影響較大， 有些幾乎沒(méi)有影響 (見(jiàn)表1)。并且， 測(cè)了不同pH值對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響，及不同pH下輔料對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)中所用的氨基酸帶有不同的電荷 ，其中Arg和Lys帶正電荷，Asp， Glu帶負(fù)電荷，Phe 和Tyr不帶電荷，但具有芳香環(huán)。

表1 IgG1單抗在pH為5，6 和7時(shí)加入不同輔料后的變性溫度(n=3)Tab.1 Denaturation temperature (Tm/℃) of IgG1 MAb in the presence of different excipients at pH 5, 6 and 7(n=3)

由圖1可看出，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp和Glu)對(duì)蛋白的Tm值影響最大，明顯降低了樣品的Tm值。如表1所示，加入氨基酸后吸熱峰發(fā)生明顯移動(dòng)，pH=5時(shí)(圖1A)加入輔料Asp后，樣品的Tm值顯著減小20 ℃，加入Glu 25℃飽和溶液后，樣品的Tm值顯著減小15.7 ℃。而pH=7(圖1B)，加入輔料Asp 25℃飽和溶液后，樣品的Tm值顯著減小15.6 ℃，加入Glu后，樣品的Tm值顯著減小9.4 ℃。

圖1 IgG1單抗(0.7 mg/mL)在20 mM磷酸鹽緩沖溶液中的DSC溫度曲線A.pH=5；B.pH=7Fig.1 Heat capacity curves (Cp) of IgG1(0.7 mg/mL) in 20 mM phosphate bufferA.pH=5；B.pH=7

不帶電荷的氨基酸對(duì)IgG1單抗熱穩(wěn)定性的影響，見(jiàn)圖2。帶正電荷氨基酸(Arg和Lys)及不帶電荷的氨基酸(Phe和Tyr)對(duì)蛋白熱穩(wěn)定性影響很小(△T<1 ℃)，溫度曲線在形狀上也沒(méi)明顯變化。其他輔料如蔗糖，吐溫20和吐溫80對(duì)樣品熱穩(wěn)定性的影響與芳香族氨基酸(見(jiàn)圖2)類(lèi)似。

圖2 IgG1 (0.7 mg/mL)在20 mM磷酸鹽緩沖溶液DSC溫度曲線A.pH=5；B.pH=7Fig.2 Heat capacity curves (Cp) of IgG1(0.7 mg/mL) in 20 mM phosphate bufferA.pH=5；B.pH=7

2.2 pH值對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響 為了探索pH值對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響，在此試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3個(gè)不同pH值(pH=5、6、7)。表1顯示，IgG1的熱穩(wěn)定性一般隨pH值減小而降低。由圖1可看出，不同pH值時(shí)，樣品DSC溫度曲線的形狀也有所不同，pH=5時(shí)IgG1的吸熱峰有2個(gè)，1個(gè)大峰，后面1個(gè)小峰(后面的蛋白聚合放熱曲線在圖上沒(méi)有顯示)；pH=7時(shí)，只能在大峰右側(cè)看到1個(gè)肩峰，后面是蛋白聚合放熱曲線；pH=6時(shí)，右側(cè)肩峰要比pH=7時(shí)明顯(pH=6的數(shù)據(jù)沒(méi)有在此展示)。圖1顯示不同pH條件下相同輔料對(duì)同一蛋白熱穩(wěn)定性影響程度不同。pH=5時(shí)帶負(fù)電荷的氨基酸對(duì)蛋白熱穩(wěn)定性降低程度較大。

2.3 去折疊后蛋白的溶解性 圖2B中吸熱峰后面溫度曲線急劇下降的部分代表了去折疊后蛋白的溶解性。圖3中，在pH=7時(shí)，蛋白的變性溫度，比pH=5 時(shí)明顯要高，但在不同吐溫之間，不存在明顯差異。但蛋白去折疊后溶解性存在差異，去折疊后蛋白的溶解性最差的(曲線急劇下降)是pH=7時(shí)加吐溫20的樣品。

圖3 IgG1樣品(0.7 mg/mL)加入吐溫20(5 mM)和吐溫80(5 mM)后的DSC溫度曲線磷酸鹽緩沖溶液20 mMFig.3 Heat capacity curves (Cp) of IgG1(0.7 mg/mL) in the presence of polysorbate80 (5 mM) or polysorbate20 (5Mm) Buffer composition:20 mM phosphate

2.4 ITC研究輔料與蛋白的相互作用 通過(guò)ITC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)輔料與蛋白的相互作用，如下圖4是精氨酸滴加到IgG1單抗時(shí)的反應(yīng)。其他氨基酸，糖類(lèi)與IgG1單抗的ITC結(jié)合等溫線與圖4一致，近乎一條直線。吐溫20和吐溫80作為蛋白藥物最常用的非離子表面活性劑輔料，其與IgG1單抗的相互作用見(jiàn)圖5(吐溫80和吐溫20的結(jié)果相同，在這沒(méi)呈現(xiàn)吐溫80結(jié)果)。如圖5所示，參比與混合釋放的熱量比較接近，最后的等溫線近乎一條直線。與IgG1相比，吐溫與HSA的結(jié)合反應(yīng)更明顯(見(jiàn)圖6)，使用origin軟件進(jìn)行處理(結(jié)合模型one set of sites)[20]，25 ℃時(shí)每個(gè)HSA分子可結(jié)合1～2個(gè)吐溫分子，吐溫20和HSA結(jié)合常數(shù)為2.9×103±63.5 M-1吐溫80和HSA結(jié)合常數(shù)為2.7× 103±65.5 M-1。吐溫20-HSA的其他相關(guān)熱力學(xué)數(shù)據(jù)：△H=-64.9±2 kJ mol-1, T×△S=-45.7 kJ mol-1,△G=-19.2±2 kJ mol-1，吐溫80-HSA：△H=-51.7±0.5 kJ mol-1，T×△S=-31.9 kJ mol-1，△G=-19.8±2 kJ mol-1。

圖4 Arg(5 mM)滴加到IgG1單抗溶液(0.1 mM)時(shí)的熱量變化圖(左圖)和ITC結(jié)合等溫線(右圖)緩沖溶液為20 mM的磷酸鹽緩沖液，pH=7Reference:Arg滴加到緩沖溶液時(shí)的熱量變化；Arg-IgG1：Arg滴加到IgG1單抗溶液時(shí)的熱量變化Fig.4 Experimental power flow signals (left) and binding isotherm (right) (obtained by integration of the titration peaks) after injection of Arg (5 mM) to IgG1 (0.1 mM) at 25 ℃ Buffer composition: 20 mM phosphate, pH=7Reference refers to the titration of Arg into buffer；Arg-IgGl refers to the titration of Arg into IgGl soultion

圖5 磷酸鹽緩沖溶液(20 mM)pH=7時(shí)，吐溫20(5 mM)滴加到IgG1單抗溶液(0.1 mM) 溶液中的熱量變化圖(左圖)和ITC結(jié)合等溫線(右圖)Reference：吐溫20滴加到緩沖溶液時(shí)的熱量變化； Polysorbate20-IgG1：吐溫20滴加到IgG1單抗溶液時(shí)的熱量變化Fig.5 Experimental power flow signals (left) and binding isotherm (right) (obtained by integration of the titration peaks) after injection of polysorbate 20 (5 mM) to IgG1 (0.1 mM) Reference refers to the thermal change of polysorbate 20 drops into buffer. Polysorbate20-IgG1 refers to the thermal change of phosphate 20 drops into IgG1 solution

圖6 磷酸鹽緩沖溶液(20 mM)pH=7時(shí)，吐溫20、吐溫80 (5 Mm)分別滴加到HSA (0.1 mM)溶液中的中的熱量變化圖和ITC結(jié)合等溫線Reference: 吐溫20(左上)、吐溫80(右上)滴加到緩沖溶液時(shí)的熱量變化；Polysorbate20-HSA、Polysorbate80-HAS：吐溫20、吐溫80滴加到HSA溶液時(shí)的熱量變化Fig.6 Experimental power flow signals and binding isotherm (obtained by integration of the titration peaks) after injection of polysorbate 20、polysorbate 80 (5 mM) to HSA (0.1 mM) Reference refers to the thermal change of polysorbate 20(upper left), polysorbate 80 (upper right ) drops into buffer； Polysorbate20-IgG1 refers to the thermal change of phosphate 20 drops into IgG1 solution； Polysorbate20-HAS、 Polysorbate80-HASrefers to the thermal change of phosphate 20,phosphate 80 drops into HSA solution

3 討論

單抗的功能依賴(lài)其結(jié)構(gòu)，DSC測(cè)得的變性溫度(Tm)與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。IgG1單抗有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性不同，在加熱時(shí)最先去折疊的是CH2結(jié)構(gòu)域，后面依次是Fab和CH3結(jié)構(gòu)域[21]。圖1A中不加輔料的樣品溫度曲線呈現(xiàn)出一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的吸熱峰，加入輔料后出現(xiàn)多個(gè)吸熱峰。不加輔料的樣品呈現(xiàn)的吸熱峰可能是多個(gè)結(jié)構(gòu)域吸熱峰部分重疊在一起形成的。而其他氨基酸輔料對(duì)蛋白的熱穩(wěn)定性影響則不明顯。應(yīng)該是低濃度的帶電荷輔料在蛋白溶液中發(fā)揮電解質(zhì)的作用，從而影響了蛋白分子之間的靜電相互作用[13]。ITC實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4)。其他氨基酸輔料與IgG1單抗的ITC結(jié)合等溫線與圖4一致，參比釋放的熱量與輔料-樣品釋放或吸收的熱量很相近，無(wú)論吸熱峰還是放熱峰都非常小，而且結(jié)合等溫線近似一條直線，說(shuō)明IgG1單抗分子與氨基酸之間沒(méi)有特異性結(jié)合作用。輔料所帶的負(fù)電荷使IgG1單抗的各結(jié)構(gòu)域之間的穩(wěn)定性差距變大，CH2結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性明顯變差。

pH值也是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定的因素，由圖1和圖2可看出， pH值影響了不同結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性。帶負(fù)電荷的氨基酸，在pH=5時(shí)對(duì)蛋白熱穩(wěn)定性降低程度最大，可能是pH=5時(shí)離此種IgG1單抗的等電點(diǎn)(pI>7)更遠(yuǎn), 輔料和蛋白分子間的靜電相互作用較強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白的局部構(gòu)象變化進(jìn)而導(dǎo)致蛋白的熱穩(wěn)定性變差。

除此之外，影響IgG1穩(wěn)定性的另一因素是去折疊后蛋白的溶解性[21], 這在DSC結(jié)果中也可看到，圖2B中吸熱峰后面溫度曲線急劇下降的部分代表了去折疊后蛋白的溶解性。而蛋白質(zhì)聚合或沉淀會(huì)使得蛋白折疊與去折疊之間的平衡向去折疊方向移動(dòng)，所以可溶的去折疊中間體越少，蛋白聚合體和去折疊蛋白越多。pH=7時(shí)吐溫80比吐溫20吸熱峰后面的溫度曲線下降較緩慢，可能反映了其較好的溶解性。所以，在為IgG1單抗選擇表面活性劑時(shí)，吐溫80優(yōu)先考慮。

至于吐溫20和吐溫80對(duì)IgG1單抗熱穩(wěn)定性的影響，在此實(shí)驗(yàn)條件下，無(wú)論是對(duì)Tm值還是吸熱峰的形狀影響都很小。吐溫20和吐溫80對(duì)于蛋白藥物所起的穩(wěn)定性依賴(lài)于其濃度，有文獻(xiàn)報(bào)道0.1～0.4 mM的吐溫20可以有效降低由攪拌誘導(dǎo)的免疫球蛋白聚合[22-23]。 Bam等[24]表明吐溫可以使重組人生長(zhǎng)激素避免攪拌導(dǎo)致的損害，且吐溫與蛋白的摩爾比大于4時(shí)效果最好。

吐溫20和吐溫80常用來(lái)防止蛋白藥物聚合，目前關(guān)于吐溫20和吐溫80的作用機(jī)制主要有以下幾種觀點(diǎn)：第一種觀點(diǎn)認(rèn)為，表面活性劑與蛋白在空氣/水表面位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)，從而限制蛋白分子暴露于空氣界面[25]。第二種觀點(diǎn)認(rèn)為，表面活性劑扮演分子伴侶的角色，能瞬間結(jié)合到部分折疊的蛋白分子上，從而使蛋白重現(xiàn)折疊，并且在空間上阻止蛋白-蛋白分子之間的相互作用[26]。第三種觀點(diǎn)認(rèn)為，表面活性劑與蛋白分子直接相互作用。表面活性劑結(jié)合到蛋白分子暴露在外的疏水區(qū)，從而阻止蛋白聚合[27-29]。此研究主要探索吐溫20和吐溫80是否與IgG1分子存在特異性結(jié)合，即最后一種觀點(diǎn)。ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吐溫(吐溫20和吐溫80的結(jié)果相同，在這沒(méi)呈現(xiàn)吐溫80結(jié)果)與IgG1單抗親和力非常低，2者之間幾乎不發(fā)生特異性結(jié)合(圖5A)，這有可能是在此條件下，蛋白-蛋白之間的相互作用較強(qiáng)，影響了輔料和蛋白之間的特異性，結(jié)合非常弱[30- 31]。

吐溫和不同蛋白結(jié)合有明顯的區(qū)別，這可能與蛋白的結(jié)構(gòu)有關(guān)，IgG1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是β-折疊(β-sheet)，HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋(α-helix)為主。鑒于HSA天然的生物學(xué)功能, HSA在溶液中展示出很大的靈活性，所以它可以和不同配體結(jié)合[32]。吐溫20與HSA的親和力稍高于吐溫80，Chou等[33]進(jìn)行的吐溫和HSA結(jié)合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)也證明吐溫20與HSA的親和力更高一些, 這可能是因?yàn)橥聹?0分子脂肪酸更長(zhǎng)，從空間上妨礙了吐溫80與HSA的結(jié)合。吐溫20-HSA的其他相關(guān)熱力學(xué)數(shù)據(jù)如△H，T×△S表明吐溫20和吐溫80與HSA結(jié)合反應(yīng)非常相似，在這種結(jié)合模式中有范德華力作用和/或蛋白-吐溫之間氫鍵形成[34]。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)中各種輔料對(duì)蛋白藥物的熱穩(wěn)定性的影響差異很大，其中帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp和Glu)明顯降低了IgG的Tm值，使得單抗各結(jié)構(gòu)域的去折疊溫度差變大，且pH=5比pH=7時(shí)作用更明顯。而帶正電荷(Arg和Lys)和帶芳香環(huán)的氨基酸(Phe和Tyr)，蔗糖，吐溫20及吐溫80對(duì)IgG熱穩(wěn)定性影響不大，且IgG1抗體溶液在pH=7時(shí)的熱穩(wěn)定性要比在pH=5時(shí)好。pH=5時(shí)離蛋白的pI較遠(yuǎn)，輔料和蛋白分子間的靜電相互作用較強(qiáng)。通過(guò)ITC測(cè)得的數(shù)據(jù)表明, 吐溫20 和吐溫80與HSA的結(jié)合反應(yīng)明顯, 但各種輔料包括吐溫與IgG1抗體之間沒(méi)有特異性結(jié)合作用。這也說(shuō)明帶負(fù)電荷的氨基酸發(fā)揮電解質(zhì)作用，影響了蛋白分子間的靜電相互作用，從而降低了蛋白藥物的熱穩(wěn)定性。

致謝

感謝上海張江生物的王皓教授慷慨提供了IgG1單抗, 及李軍老師對(duì)本工作提供的幫助。本研究也獲得了山東省泰山學(xué)者研究基金資助，在山東省抗體制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，山東省納米藥物與釋藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心完成，特此感謝。

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(編校：王冬梅)

Thermodyn amic study on the interaction of excipients and protein

WANG Wen-juan, WANG Bing-quanΔ, HAN Jun

(Institute of BioPharmaceutical Research/School of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)

ObjectiveTo determine the effects of different excipients (amino acids, carbohydrates and nonionic surfactants) on thermal stability of the IgG1 monoclonal antibody, and to examine the interactions between the excipients and the protein.MethodsDifferential scanning calorimetry (DSC) was used to study thermal stability of the protein in different solutions and got information on the solubility of the unfolded forms of the protein.Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to examine the binding interactions between the excipients and the protein.ResultsNegatively charged amino acids could significantly reduce the denaturation temperature (Tm) of IgG1(△Tm>9 ℃), and other excipients didn’t have a major effect (△Tm<1 ℃).Excipients shared different impacts on thermal stability of the IgG1 monoclonal antibody under different pH, and negatively charged amino acids result in a much lower Tmat pH 5 than at pH 7.The ITC binding isotherms of different excipients (including polysorbate 20 and 80) and IgG1 were almost straight lines, while there was strong binding interaction between polysorbate 20 or 80 and Human Serum Albumin (HSA).ConclusionThe results suggest that there is no binding interaction between these studied excipients and the IgG1 monoclonal antibody; instead electrostatic interactions seem to play a leading role between the excipients and the IgG1 monoclonal antibody.

protein formulation; IgG1 monoclonal antibody; thermal stability; excipient; amino acid; specific interaction

國(guó)家自然科學(xué)基金(21373106)

王文娟，女，碩士，研究方向：蛋白藥物，E-mail:elma95@126.com；王炳全，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：生物制劑和蛋白藥物穩(wěn)定性的研究，E-mail:1298145393@qq.com。

R94

A

1005-1678(2015)07-0005-05