王立文，沈曉潔，俞茹云，林莉莉

(無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 康復(fù)系，江蘇 無錫 214028)

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靶向沉默CXCR4表達逆轉(zhuǎn)肺癌細胞吉西他濱耐藥性的作用研究

王立文Δ，沈曉潔，俞茹云，林莉莉

(無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 康復(fù)系，江蘇 無錫 214028)

目的 觀察靶向沉默CXCR4基因表達對非小細胞肺癌吉西他濱耐藥株(A549/Gem)逆轉(zhuǎn)作用的影響。方法 采用體外濃度梯度遞增的誘導(dǎo)方法建立非小細胞肺癌吉西他濱耐(Gemcitabine)獲得性耐藥細胞株(A549/Gem)。通過Quantitative RT-PCR(RT-qPCR)檢測A549與A549/Gem細胞中CXCR4的表達量。通過體外轉(zhuǎn)染CXCR4 shRNA干擾載體到A549/Gem細胞，RT-qPCR及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗證shRNA對CXCR4基因的靶向沉默效率。進而采用MTT法檢測A549、A549/Gem和CXCR4沉默表達細胞株(A549/Gem-CXCR4)對Gemcitabine的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)和耐藥指數(shù)(resistance index，RI)；最后采用Western blot法檢測A549、A549/Gem和A549/Gem-CXCR4細胞中JNK、p38和ERK1/2磷酸化蛋白的表達水平的變化。 結(jié)果 通過體外濃度梯度遞增的誘導(dǎo)方法成功建立A549/Gem細胞株(P<0.05)。A549/Gem細胞株中CXCR4的表達量明顯高于A549細胞株。體外轉(zhuǎn)染CXCR4 shRNA可明顯下調(diào)A549/Gem細胞株中CXCR4表達。MTT法檢測A549，A549/Gem和A549/Gem-CXCR4對Gemcitabine的IC50分別為(0.08±0.01)μmol/L，(14.01±0.21)μmol/L和(1.84±0.61)μmol/L。A549/Gem細胞株對Gemcitabine的耐藥指數(shù)(RI)是(127.12±12.28)，遠高于A549/Gem-CXCR4對Gemcitabine的耐藥指數(shù)(RI)(0.27±0.08)；Western blot結(jié)果顯示A549/Gem-CXCR4細胞株中JNK、p38和ERK1/2磷酸化蛋白的表達量較A549/Gem細胞株明顯下調(diào)。 結(jié)論 A549/Gem細胞株中CXCR4的表達明顯上調(diào)。靶向沉默CXCR4表達能夠逆轉(zhuǎn)肺癌細胞吉西他濱耐藥性，提示CXCR4是肺癌臨床放射治療相關(guān)的有效分子靶點。

非小細胞肺癌；吉西他濱；CXCR4；耐藥性

肺癌是世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因，我國肺癌在城市人口腫瘤患者死亡原因中由原來的第四位上升為第一位，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占了85%左右[l-2]。目前研究報道，只有14%的患者在確診肺癌后能生存五年或以上[3]。在診斷為晚期肺癌的患者中，研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱可明顯提高患者的生存率，其聯(lián)合任何一種抗癌藥物，如紫杉醇、鉑類、長春瑞濱等均被認為是晚期肺癌一線治療方案。盡管多樣的化療方案可以改善患者的預(yù)后，但由于耐藥及不可避免的藥物毒性導(dǎo)致大多數(shù)患者最終結(jié)果仍然是治療的失敗[4]。大量實驗和臨床研究已經(jīng)證明一系列分泌性趨化因子與NSCLC發(fā)展的病理機制有密切關(guān)系，特別是基質(zhì)源性細胞因子1(stromalcell-deriredfactor-1，SDF-1)與其受體CXCR4在NSCLC轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[5-6]。最新研究表明，CXCR4在肝癌組織中異常高表達，并且與肝癌預(yù)后明確相關(guān)[7]。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)，靶向沉默CXCR4基因的表達，觀察其對吉西他濱耐藥NSCLC細胞株A549逆轉(zhuǎn)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)購自 Milliproe公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和碘化丙啶(PI)均購自美國Sigma公司。人非小細胞肺癌細胞株A549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。鹽酸吉西他濱購(Gemcitabine)自南京正大天晴制藥有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購自Invitrogen公司，G418購自Gibico公司。RNA干擾載體CXCR4-shRNA及陰性對照載體(negative control)購自由本上海Genechem公司。兔抗人CXCR4抗體及ACTIN抗體購自Santa Cruz公司。JNK、p38和ERK1/2磷酸化抗體均購自美國CST公司。HRP標記山羊抗兔或鼠IgG二抗購自北京中衫金橋公司。PCR引物合成于北京鼎國生物公司，RT-qPCR試劑體系購自日本TaKaRa公司。

1.1.2 儀器 5810R冷凍離心機購自德國eppendorf公司；5415D臺式離心機購自德國eppendorf公司；Heλiosγ紫外分光光度計購自美國Thermo公司；TS-2脫色搖床購自江蘇其林貝爾公司；TS-8轉(zhuǎn)移脫色搖床購自江蘇其林貝爾公司；EPS-300電泳儀購自上海天能公司；VE-180微型垂直電泳槽購自上海天能公司；VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽購自上海天能公司；微量加樣器購自德國eppendorf公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺購自日本AIR TECH公司；TP600梯度PCR儀購自日本TaKaRa公司；TP800Real time PCR儀購自日本TaKaRa公司；Elx800型自動酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)于 37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，每1～2 d傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 耐藥細胞株的建立：采用體外逐步遞增濃度方法誘導(dǎo)。取對數(shù)生長期的A549細胞加入含吉西他濱的培養(yǎng)液，吉西他濱從低濃度10 nmol/L濃度開始處理，作用24 h，敏感細胞逐漸死亡，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗3遍，換新鮮培養(yǎng)液，耐藥細胞在不含藥物的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期，逐漸提高吉西他濱的濃度，如此反復(fù)誘導(dǎo)，換液傳代，直至該細胞株能夠在2.0 μmol/L 吉西他濱濃度下穩(wěn)定生長。歷時8個月，最終得到耐受吉西他濱 2.0 μmol/L的細胞株A549/Gem。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測：用Trizol提取各組細胞總RNA。取1 μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板PCR擴增CXCR4，按照TaKaRau熒光定量試劑盒說明書，以cDNA為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量 PCR 儀上進行RT-qPCR反應(yīng)。實驗反應(yīng)體系為：模版cDNA 1 μL，SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Mix 10 μL，正、反向引物(20 μmol)共1.6 μL，CXCR4上游引物為 5′- CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG -3′，下游引物為5′- AGGATGACTGTGGTCTTGAGGG -3′；以β-ACTIN為內(nèi)參，β-ACTIN上游引物為 5′- GACTTAGTTGCGTTAC-ACCCTTTCT -3′，下游引物為5′- ACTGCTGTCACCTTCACCGTTC -3′，加RNase-free water 7.4 μL至總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共45 個循環(huán)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染干擾載體CXCR4 shRNA(5’- CCAAUGACUUGUGGGUGGUUG：UGUU -3’)及陰性對照載體(negative control)(5’- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA -3’)均購自上海Genechem公司。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前取對數(shù)生長期的A549細胞進行消化，細胞計數(shù)板計數(shù)，用含10 FBS無抗生素的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為6×106個/mL，以2×104個/mL于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，當(dāng)細胞培養(yǎng)達到75% 左右融合后進行轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染48 h后消化細胞，按1:6接種于6孔板，用無抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.5 細胞分組：實驗中共分為3組：正常非小細胞肺癌細胞株(A549)；吉西他濱耐藥肺癌細胞株(A549/Gem)；靶向沉默CXCR4后的吉西他濱耐藥肺癌細胞株(A549/Gem- CXCR4)。

1.2.6 MTT法檢測不同細胞株耐藥指數(shù)(resistance index，RI)及對Gemcitabine的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50) 取對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化，制成單細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度至3.5×104個/mL，接種于96孔板，每孔接種100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，孵育過夜，吸出原培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同濃度各種藥物200 μL，記為實驗組。每個藥物濃度設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組(僅含培養(yǎng)基)、細胞對照組(僅含細胞和培養(yǎng)液不含藥物)。培養(yǎng)72 h后，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用移液槍洗出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶溶解，酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(OD)，計算生長抑制率。生長抑制率=[(細胞對照組OD值-實驗組OD值)/(細胞對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%。根據(jù)生長抑制率計算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。IR=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.7 Western blot檢測：研究發(fā)現(xiàn)p38，JNK1/2及ERK1/2磷酸化蛋白表達水平與腫瘤化療敏感性密切相關(guān)[8-10]。為進一步探究A549/Gem-CXCR4逆轉(zhuǎn)Gemcitabine耐藥的分子機制，本研究使用與Western blot技術(shù)檢測試驗各組p38，JNK1/2，ERK1/2磷酸化蛋白表達水平，選擇生長良好的細胞1×107個，細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加一抗稀釋液(兔抗人CXCR4抗體1:500，兔抗人β-ACTIN抗體1:5000，抗phospho-p38抗體1:800，抗phospho-JNK1/2抗體1:500，抗phospho-ERK1/2抗體 1:400)4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后加相應(yīng)二抗稀釋液室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯影。膠片成像系統(tǒng)掃描記錄，全自動凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行分析并拍照。蛋白表達以光密度表示，Quantity One軟件進行灰度分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白β-ACTIN表示蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4在A549與A549/Gem細胞株的表達特征 通過 2-ΔΔCT計算 CXCR4 表達量在A549/Gem相對A549細胞株倍數(shù)并作圖。CXCR4在A549/Gem細胞株中的相對表達量為(6.3±0.56)要明顯高于在A549細胞株中的相對表達量(1.10±0.37)(P<0. 01)，見圖1A。同樣，Western blot結(jié)果顯示，A549/Gem細胞株中CXCR4的表達量(灰度值為3218761±78311)要明顯高于在A549細胞株中的相對表達量(灰度值為820064±53121)(P<0. 01)，見圖1B。

圖1 CXCR4在A549與A549/Gem細胞株的表達特征(n=3) A：mRNA；B：蛋白**P<0. 01，與A549比較Fig.1 Expressions of CXCR4 in both A549 and A549/Gem cell lines(n=3) A：mRNA；B：protein**P<0. 01，compared with A549

2.2 CXCR4 shRNA對A549/Gem細胞株CXCR4表達的影響 經(jīng)RT-qPCR檢測，與正常陰性對照組細胞株(A549/Gem)相比，CXCR4 shRNA組A549/Gem細胞株(A549/Gem-CXCR4)細胞中CXCR4 mRNA表達受到了明顯的抑制，其抑制率高達70%。CXCR4在A549/Gem-CXCR4細胞株中的相對表達量為(0.28±0.04)要明顯低于在A549/Gem細胞株中的相對表達量(1.00±0.07)(P<0.05)，見圖2A。同樣，Western blot檢測提示，A549/Gem-CXCR4細胞株中CXCR4的表達量(灰度值為306417±38311)要明顯低于在A549/Gem細胞株中的相對表達量(灰度值為2710994±63121)(P<0.05)，見圖2B。

圖2 CXCR4 shRNA對A549/Gem細胞株CXCR4表達的影響(n=3)A：mRNA；B：蛋白**P<0. 01，與A549比較Fig.2 The effect of CXCR4 shRNA in A549/Gem cell lines(n=3)A：mRNA；B：protein**P<0. 01，compared with A549

2.3 MTT法檢測A549，A549/Gem及A549/Gem-CXCR4細胞株對Gemcitabine的耐藥濃度(IC50)及耐藥指數(shù)(RI)分析 經(jīng)MTT試驗發(fā)現(xiàn)A549，A549/Gem和A549/Gem-CXCR4細胞株對Gemcitabine的IC50分別為(0.08±0.01)μmol/L，(14.01±0.21)μmol/L和(1.84±0.61)μmol/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05)。A549/Gem細胞株對Gemcitabine的RI是(127.12±12.28)，遠高于A549/Gem-CXCR4對Gemcitabine的RI值(27.3±0.98)，(P<0. 05)。

2.4 Western blot法測定A549 A549/Gem及A549/Gem-CXCR4細胞株中p38，JNK1/2，ERK1/2磷酸化蛋白表達水平結(jié)果顯示，與正常A549/Gem細胞株相比，CXCR4靶向沉默的A549/Gem-CXCR4 細胞株中ERK1/2，JNK1/2，p38的磷酸化受到了明顯的抑制，見圖3。Quantity One軟件進行灰度分析Western blot檢測條帶的光密度，以β-ACTIN表達量作為蛋白定量分析內(nèi)參，每組實驗重復(fù)3次。與A549細胞株相比，A549/Gem細胞中p38的表達量以及JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見表1。與A549/Gem相比，A549/Gem-CXCR4細胞株中p38的表達量以及JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

圖3 A549，A549/Gem及A549/Gem-CXCR4細胞株中p38，JNK1/2，ERK1/2磷酸化蛋白表達變化(n=3)Fig.3 Expressions of p38, phosphor-JNK1/2 and phosphor-ERK1/2 in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cell lines(n=3)

組別p38phospho-ERK1/2phospho-JNK1/2β-actinA549934440±125688 603116±148758 198266±138248 4247626±237218 A549/Gem3794874±879348*1850118±133968*939474±137218*4146450±223778*A549/Gem-CX-CR41064940±231637△603116±142138△401540±124698△4345231±245718△

*P<0.01，與A549組相比，compared with A549；△P<0.01，與A549/Gem相比，compared with A549/Gem

3 討論

大部分腫瘤細胞都表達趨化因子及趨化因子受體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中趨化因子及其受體表現(xiàn)出關(guān)鍵的作用。因此，以趨化因子及其受體分子為靶點，通過抑制或拮抗趨化因子受體的信號傳導(dǎo)來控制趨化因子系統(tǒng)的功能，可望用于有效防止惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。CXCR4是組織表達最為廣泛的細胞趨化因子受體之一，對多種惡性腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移都具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。

本研究為了探究靶向沉默CXCR4的表達對吉西他濱耐藥的影響，首先在體外實驗構(gòu)建了Gemcitabine耐藥的肺癌細胞模型A549/Gem，通過現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)CXCR4的表達量在耐藥肺癌細胞株A549/Gem明顯升高，提示CXCR4可能與吉西他濱的耐藥性有關(guān)；為了進一步驗證本猜想，本研究構(gòu)建了CXCR4靶向沉默的吉西他濱耐藥細胞株A549/Gem-CXCR4，并探究A549/Gem-CXCR4細胞株對Gemcitabine耐藥實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A549/Gem相比，A549/Gem-CXCR4對Gemcitabine的敏感性明顯提高，其耐藥程度降低。為了進一步探究CXCR4的逆轉(zhuǎn)耐藥機理，本研究還考察了CXCR4對p38，phosphor-JNK1/2和phosphor-ERK1/2的表達量的影響。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)是促分裂原活化蛋白激酶的一個亞群，為細胞凋亡信號傳導(dǎo)中的重要介質(zhì)。JNK包括了至少10種亞型，由JNK1、JNK2、JNK3基因編碼[12]。研究表明JNK磷酸化蛋白的失活和腫瘤細胞化療耐藥性密切相關(guān)，JNK磷酸化蛋白的激活可以明顯增加NSCLC對化療和放療的敏感性[13]。Teraishi等[12]對NSCLC耐Gemcitabine細胞株(H1299-GR)及其親本細胞株(H1299)進行體外研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H1299細胞株中JNK磷酸化蛋白被激活，而Gemcitabine誘導(dǎo)的H1299-GR細胞株中的JNK磷酸化蛋白始終未被激活。此外Teraishi等還在H1299細胞中通過一種特殊的JNK磷酸化蛋白阻斷劑SP600125來阻滯JNK磷酸化蛋白的正常信號傳導(dǎo)，結(jié)果表明Gemcitabine介導(dǎo)的細胞凋亡顯著減少。另外對JNK1-JNK2融合蛋白的瞬時轉(zhuǎn)染可以部分逆轉(zhuǎn)H1299-GR對Gemcitabine的耐藥。上述結(jié)果充分表明JNK在吉西他濱介導(dǎo)對NSCLC細胞毒過程中有著重要作用，同時JNK磷酸化蛋白活性的減少和Gemcitabine耐藥密切相關(guān)[14]。

p38為一個38kDa的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，在各種細胞外刺激作用下，p38三肽基區(qū)的蘇氨酸、酪氨酸被雙磷酸化而被激活。近年研究表明p38在全身炎癥反應(yīng)、休克、細胞遷移、心血管疾病等方面具有重要作用[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)p38的活化與肺癌的耐藥呈明顯負相關(guān)[16-17]。ERK1/2對腫瘤的作用主要體現(xiàn)在促增殖方面，活化的ERK激酶可激活或滅活其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子(如NF-κB，Akt，CREB 等)以及重要的轉(zhuǎn)錄因子(Ets，Ap-1，C-myc)，并能調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)因子(cyclin D，p21)和凋亡分子(bcl-2，bcl-XI，F(xiàn)asI)的表達，其持續(xù)活化最終促進細胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化[18]。研究提示，ERK磷酸化蛋白活化，亦可增加腫瘤的化療敏感性[19]。進一步探究發(fā)現(xiàn)靶向沉默CXCR4后A549/Gem-CXCR4細胞株中p38，JNK和ERK1/2的磷酸化蛋白活化減少。

上述實驗結(jié)果表明，靶向沉默CXCR4表達能夠逆轉(zhuǎn)肺癌細胞吉西他濱耐藥性，提示CXCR4是肺癌臨床放射治療相關(guān)的有效分子靶點。該研究不僅為非小細胞癌吉西他濱耐藥機制提供了依據(jù)，也為聯(lián)合檢測CXCR4可能有助于評估肺癌的預(yù)后，并可為以此為靶點的腫瘤治療新藥的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

[1] 錢桂生.為提高我國呼吸系統(tǒng)疾病的診治水平而努力[J/CD].中華肺部疾病雜志：電子版，2012，5(1)：1-3.

[2] 李羲，錢桂生．從已知危險因素人手降低肺癌發(fā)病率『J/ CD].中華肺部疾病雜志：電子版，2012，5(6)：490492.

[3] Azzoli CG，Baker S Jr，Temin S，et a1．American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline update on chemotherapy for stage 1V non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol，2009，27 (36)：6251-6266.

[4] 史文超，劉曉民．吉西他濱治療非小細胞肺癌耐藥機制的研究進展[J].中華肺部疾病雜志：電子版，2013，6(6)：63-65.

[5] 李磊，石學(xué)濤．SDF-1/CXCR4與肝細胞肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(9)：737-740.

[6] 張建波，仲偉霞．胰腺癌CXCL12/CXCR4通路研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2012，19(8)：634-637.

[7] 向作林，曾昭沖，唐釗猷，等．趨化因子受體4核陽性及血管內(nèi)皮生長因子C和細胞角蛋白19的表達水平與肝細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2010，32(5)：344-349.

[8] Judde J G, Rebucci M, Vogt N, et al.Gefitinib and Chemotherapy Combination Studies in Five Novel Human Non Small Cell Lung Cancer Xenografts. Evidence Linking Egfr Signaling to Gefitinib Antitumor Response[J]. Int J Cancer,2007(120)：1579-1590.

[9] Li J, Liang X, and Yang X, Ursolic Acid Inhibits Growth and Induces Apoptosis in Gemcitabine-Resistant Human Pancreatic Cancer Via the Jnk and Pi3k/Akt/Nf-Kappab Pathways[J]. Oncol Rep,2012(28)：501-510.

[10] Zheng C, Jiao X, Jiang Y, et al.Erk1/2 Activity Contributes to Gemcitabine Resistance in Pancreatic Cancer Cells[J]. J Int Med Res,2013(41)：300-306.

[11] 常遠鴻，李汀，陰俊，等．靶向沉默CXCR4基因抑制肝胞癌侵襲體外研究[J].中華腫瘤防治雜志，2013，20(20)：1569-1579.

[12] Teraishi F，Zhang L，Guo W，et a1．Activation of c-Jun NH2-terminal kinase is required for gemcitabine’s cytotoxic effect in human lung cancer H1299 cells[J].FEBS Lett，2005，579(29)：6681-6687.

[13] Vicent S，Garayoa M，López-Picazo JM，et al．Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 is overexpressed in non-small cell lung cancer and is an independent predictor of outcome in patients[J].Clin Cancer Res，2004，10(11)：3639-3649.

[14] 胡南均，干惠珠，盧振霞．非小細胞肺癌吉西他濱化療耐藥相關(guān)酶[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2009，36(8)：604-606.

[15] Lin HH，Chen JH．Huang CC，et al．Apoptotic effect of 3,4-dihydroxy-benzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38 MAPK signaling activation[J].Int J Cancer，2007，120(11)：2306-2316.

[16] Yan HQ, Huang XB, Ke SZ, et al., Interleukin 6 Augments Lung Cancer Chemotherapeutic Resistance Via Ataxia-Telangiectasia Mutated/Nf-Kappab Pathway Activation[J]. Cancer Sci,2014(105):1220-1227.

[17] Kim YJ, Choi WI, Jeon BN, et al., Stereospecific Effects of Ginsenoside 20-Rg3 Inhibits Tgf-Beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition and Suppresses Lung Cancer Migration, Invasion and Anoikis Resistance[J].Toxicology,2014(322):23-33.

[18] 梁佳，包翠芬，魏嘉，等．P38和ERK1/2在肝細胞癌中的表達及意義[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2009，18(2)：202-205.

[19] Chen TJ, Zhou YF, Ning JJ, et al., Nbm-T-Bmx-Os01, an Osthole Derivative, Sensitizes Human Lung Cancer A549 Cells to Cisplatin through Ampk-Dependent Inhibition of Erk and Akt Pathway[J].Cell Physiol Biochem,2015(36):893-906.

(編校：譚玲)

Study on the reversion effect of targeting silence CXCR4 gene on Gemcitabine-resistance in non-small cell lung cancer

WANG Li-wenΔ, SHEN Xiao-jie, YU Ru-yun, LIN Li-li

(Department of Rehabilitation,Wuxi Technical Vocational College, Wuxi 214028, China)

ObjectiveTo explore the reversion effect of Gemcitabine-resistance A549 cell (A549/Gem) by silencing CXCR4.MethodsA549 cell was induced by continuous stepwise exposure to Gemcitabine in order to obtain Gemcitabine-resistance A549 cell (A549/Gem) in vitro. The CXCR4 expressions level of A549 and A549/Gem were detected by Quantitative RT-PCR (RT-qPCR) and Western blot analyses. The CXCR4 shRNA vector was transfected into the A549/Gem cell by targeting silence CXCR4. Furthermore, MTT assay was used to explore the IC50and RI in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cells. Moreover, Western blot analysis was performed to detect the expressions of phospho-JNK, phospho-p38 and phospho-ERK 1/2 in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cells.ResultsGemcitabine-resistance A549 cell (A549/Gem) was successful constructed by using continuous stepwise exposure to Gemcitabine in vitro. The expression level of CXCR4 was up-regulated in A549/Gem cell than in A549 cell. The CXCR4 shRNA vector could significantly decrease CXCR4 expression in A549/Gem cell. The IC50 values of Gemcitabine in A549, A549/Gem and A549/Gem-CXCR4 cell were (0.08±0.01) μmol/L, (14.01±0.21)μmol/L and (1.84±0.61)μmol/L, respectively. The RI value of Gemcitabine was (127.12±12.28) in A549/Gem cells, while the value of RI was (27.3±0.98) in A549/Gem-CXCR4 cells. The expression level of phospho-JNK, phospho-p38 and phospho-ERK 1/2 were also markedly inhibited in A549/Gem-CXCR4 cell than in A549/Gem cell. ConclusionCXCR4 is up-regulated in A549/Gem cell. Targeting silence CXCR4 can successfully reverse drug-resistance of Gemcitabine in A549/Gem cells, which hints CXCR4 is associated with lung cancer radiation therapy as an effective molecular target.

non-small cell lung cancer; Gemcitabine; CXCR4; drug-resistance

無錫市醫(yī)院管理中心科研項目 (YGZXM14021)

王立文，通信作者， 男，碩士，副教授，研究方向：康復(fù)治療技術(shù)研發(fā)，E-mail: wangliwen0310@163.com。

R734.2

A

1005-1678(2015)12-0024-05