林錦彬，任桐，連一江，李偉杰，金鑫，夏智波Δ,李文君Δ

(1.廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102； 2.廈門市手性藥物重點實驗室，福建 廈門 361102；3.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021)

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紅杜仲的美白活性及其途徑研究

林錦彬1,2，任桐3，連一江1,2，李偉杰1,2，金鑫1,2，夏智波1,2Δ,李文君1,2Δ

(1.廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102； 2.廈門市手性藥物重點實驗室，福建 廈門 361102；3.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021)

目的 研究紅杜仲的不同乙醇濃度醇提物對黑色素瘤B16細胞系酪氨酸酶活性、黑素合成的影響，初步探討紅杜仲作為皮膚美白劑或色素沉積藥物的可行性。方法 以不同濃度乙醇進行回流分別獲得30%、50%、70%、95%乙醇提取的得到4種紅杜仲醇提物(PEE30、PEE50、PEE70、PEE95)，選取對蘑菇酪氨酸酶抑制活性最強的提取物；再以B16造模，采用MTS法、NaOH裂解法、L-DOPA氧化法分別測定其對B16細胞的影響；Western blot檢測PEE作用后Tyrosinase、TRP-1蛋白表達水平的變化。結(jié)果 各紅杜仲醇提物在體外均具有抑制蘑菇酪氨酸酶的作用，效果最強的為PEE70。在不影響B(tài)16細胞的濃度內(nèi)，PEE70明顯降低B16細胞酪氨酸酶活性和黑素的合成量(P<0. 001)。Western blot結(jié)果表明，PEE70能夠顯著抑制黑素合成相關(guān)蛋白Tyrosinase、TRP-1的表達。結(jié)論 PEE能直接抑制B16細胞黑色素的合成，可用于美白產(chǎn)品或者色素沉積藥物的開發(fā)，且上述變化通過抑制酪氨酸酶活性來完成。

紅杜仲；B16細胞；黑素合成；抑制作用

白皙和潔潤的肌膚一直為絕大多數(shù)的婦女所推崇，而近年來隨著生活工作節(jié)奏的加快以及環(huán)境污染的加劇，由各種原因引起的色斑、色素沉著等已成為普遍問題，因此，美白化妝品已成為護膚類化妝品中的主流品種之一。目前，國際上比較認可的黑素合成途徑為：酪氨酸-多巴-多巴醌-多巴色素-二羥基吲哚-酮式吲哚-黑素[1]。酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶和限速酶，其具有獨特的雙重催化功能，首先催化L-酪氨酸羥基化形成L-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，之后多巴醌經(jīng)一系列的酶促和非酶促反應(yīng)后形成黑色素[2]。

紅杜仲藥材為夾竹桃科杜仲藤屬植物杜仲藤(Parabariummicranthum(A.DC.)Pierre)、紅杜仲藤(P.chunnianumTsiang)及毛杜仲藤(P.huaitingiiChunet Tsiang)的莖皮和根皮，或花皮膠藤屬花皮膠藤(EcdysantherautilisHay.et Kaw.)的干燥樹皮，主要含有生物堿、酚類、有機酸、黃酮等化學(xué)成分，紅杜仲藥材可以治療風(fēng)濕骨痛、外傷出血等[3]。但是，目前尚未見紅杜仲提取物在美白化妝品方面的報道。本文主要研究紅杜仲醇提物的活性部位對酪氨酸酶活性與黑素合成的抑制，為開發(fā)紅杜仲作為美白原料應(yīng)用于化妝品提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑：紅杜仲(廈門鷺燕醫(yī)藥有限公司)。雙抗(青霉素、鏈霉素)、EDTA、胰蛋白酶、PTU(苯硫脲)(美國Sigma公司)；MTS(Promega公司)，α-MSH(上海淘普生物科技公司)；Tyrosinase、TRP-1單抗(Boster公司)。

1.1.2 實驗儀器：公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；Ti-S型倒置熒光顯微鏡(日本Nicon)；多功能酶標儀 SpectraMax M2(Molecular Devices)；冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅杜仲醇提物的制備：取紅杜仲30 g，加480 mL 30%乙醇浸泡40 min，85 ℃水浴回流提取2 h，過濾，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙醇后得到粗浸膏，將粗浸膏置于-80 ℃后用冷凍干燥機干燥即為PEE30，備用。同樣的方法制備PEE50、 PEE70 、PEE95。

1.2.2 蘑菇酪氨酸酶活性抑制實驗： 根據(jù)Matsuda H[4]的方法并改良進行蘑菇酪氨酸酶活性抑制試驗。以 1.5 g/L的左旋多巴為底物，添加80 μL磷酸緩沖液及 40 μL不同濃度(4、8、16 μg/mL)提取物。然后加入30 μL的100 U/mL酪氨酸酶磷酸緩沖液，充分混勻，30 ℃恒溫在475 nm處測定吸光度，每5 s記1次數(shù)，連續(xù)測定30 s，以反應(yīng)時間對吸光度作圖并進行直線擬合，根據(jù)樣品孔與陽性對照孔直線斜率的變化計算抑制率。陽性對照為曲酸。每組設(shè)3個復(fù)孔，計算公式如下(式中kT：樣品孔直線斜率；kC：陽性對照孔直線斜率)：

蘑菇酪氨酸酶活性抑制率(%)=[1-kT/kC]×100%

IC50值定義為抑制率為50%時所需酪氨酸酶抑制劑的濃度，以樣品的濃度對酪氨酸酶的抑制率作圖并進行擬合，讀取計算IC50值。

1.2.3 B16細胞的培養(yǎng)及細胞增殖活性測定：實驗中選擇處于對數(shù)生長期的B16細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104個/mL，每孔100 L，接種于96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)觀察待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度紅杜仲醇提物的培養(yǎng)液200 μL，同時設(shè)置空白對照孔，培養(yǎng)72 h后，MTS法測定各孔吸光值(A)，并按照如下公式計算細胞的存活率，及細胞存活率≥90%作為標準確定紅杜仲對細胞的安全濃度。

細胞存活率(%)=A處理/A對照×100%。

1.2.4 細胞酪氨酸酶活性測定[5]：培養(yǎng)B16至對數(shù)期，按密度1×105/孔將B16接種于6孔板，每孔2 mL；于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液加入2 mL 100 nM的α-MSH(黑色素刺激劑)，24 h后每孔加入不同濃度的醇提物，每一濃度設(shè)立3個復(fù)孔取平均值，孵育72 h。收集后的細胞每管加入1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)150 μL，4 ℃溶解半小時，13000 r/min，4 ℃離心20 min，收集上清液；在96孔板中每孔加入90 μL細胞裂解液和10 μL 0.25%的L-DOPA溶液，在 37 ℃ 反應(yīng)60 min。用酶標儀在475 nm處測量各孔的吸光度，BCA法測定各孔蛋白含量并計算細胞酪氨酸酶相對活性。每一處理因素重復(fù)測定3次。

酪氨酸酶相對活性(%)= [(給藥組吸光度值/給藥組蛋白濃度吸光度值)/(對照組吸光度值/對照組蛋白濃度的吸光度值)]*100%

1.2.5 細胞黑色素含量測定：細胞的接種密度、處理、培養(yǎng)條件及收獲方法同1.2.3。用1000 μL含10%DMSO(二甲基亞砜)的NaOH溶液(1M)溶解，于90 ℃下加熱2 h，細胞裂解液吸取100 μL加入到96孔中，405 nm處測定各孔的吸光值，BCA法測定各孔蛋白含量并計算細胞黑色素相對含量。每一處理因素重復(fù)測定3次。

黑素合成相對含量(%)= [(給藥組黑素含量的吸光度值/給藥組蛋白濃度的吸光度值)/(對照組黑素含量的吸光度值/對照組蛋白濃度的吸光度值)]×100%

1.2.6 Western blot法檢測Tyrosinase、TRP-1蛋白表達水平[6]：前處理同1.2.3，PIRA裂解取上清完后，BCA法測定蛋白含量，以30 μg蛋白樣品為各組上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗為Tyrosinase (1:200)或者TRP-1(1:200)，β-actin(1:10000)。4 ℃過夜；PBST洗5遍，每次10 min；二抗兔抗山羊或者兔抗搖床孵育1 h，PBST洗5遍，每次10 min；加入ECL底物顯色后普光，用ImageJ軟件讀取灰度值，取目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。該實驗獨立重復(fù)測定3次，結(jié)果以相對于對照組的百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 不同乙醇濃度紅杜仲提取物對蘑菇酪氨酸酶活性的影響 實驗證明，陽性藥物曲酸的IC50值為(0.004±0.018)， PEE30、PEE50、PEE70、PEE95都能對蘑菇酪氨酸酶的活性產(chǎn)生抑制作用，其抑制蘑菇酪氨酸酶的IC50值分別為(0.246±0.128)、(0.131±0.067)、(0.057±0.044)、(0.069±0.032) mg/mL，效果最好的是PEE70，選取該部分提取物用于后續(xù)的實驗。

2.2 不同濃度紅杜仲醇提物對B16細胞增殖活性的影響 紅杜仲70%醇提物作用于B16細胞72 h后，均會對B16細胞生長活性產(chǎn)生不同程度的影響，見圖1。由圖1可知，在0～20 mg/L濃度范圍內(nèi)，PEE30、PEE50和PEE70作用于B16細胞72 h后的細胞存活率≥90%，定義在該濃度范圍為安全濃度；因此，PEE95的安全濃度范圍為0～15 mg/L。分別選取對B16細胞無明顯毒性(細胞存活率≥90%)的紅杜仲提取物用于后續(xù)的實驗。

圖1 不同濃度紅杜仲醇提物對B16細胞增殖活性的影響±s，n=3)Fig.1 Effect of different concentration PEE on B16 cell ±s，n=3)

2.3 不同濃度紅杜仲醇提物對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響 在5～20 mg/L范圍內(nèi)，PEE30效果最差，對酪氨酸酶活性影響差異均無顯著性；PEE95只有>10 mg/L才能對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活力起到明顯的抑制作用(P<0.01)。在安全濃度范圍內(nèi)，PEE50、PEE70對胞內(nèi)酪氨酸酶活力的抑制效果較好(P<0.05，P<0.01)，隨著給藥濃度的增加， B16 細胞酪氨酸酶活性逐漸降低，呈現(xiàn)較好的劑量依賴性，效果最好的是PEE70(P<0.001)，其對酪氨酸酶活性最高抑制率達到(38±1.072)%。見圖2。

圖2 不同濃度紅杜仲醇提物對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響±s，n=3)*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，與對照組比較Fig.2 Effect of different concentration PEE on the Tyrosinase activity in*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

2.4 不同濃度乙醇紅杜仲提取物對B16細胞內(nèi)黑素含量的影響 不同濃度乙醇紅杜仲提取物均能明顯降低B16細胞黑素含量(P<0.05，P<0.01)。與對照組相比，效果最佳的是PEE70，在5、10、20 mg/L時使B16細胞中的黑色素分別降低了(10±0.231)%、(27±0.523)%、(36±0.896)%，隨著濃度的增加呈現(xiàn)了較好的劑量依賴性，見圖3。由圖3可知，4種乙醇濃度提取的紅杜仲對黑素的合成具有抑制作用，其中，PEE70有最好的美白效果，而后對其進行進一步的驗證。

圖3 不同濃度乙醇紅杜仲提取物對B16細胞內(nèi)黑素含量的影響±s，n=3)*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，與對照組比較Fig.3 Effect of different concentration PEE on the melanin*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

2.5 PEE70對Tyrosinase、TRP-1蛋白表達量的影響 黑色素研究表明[7]，酪氨酸酶是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，也是黑色素合成的限速酶，它通過將酪氨酸羥化，產(chǎn)生L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，然后再將L-DOPA進一步氧化成多巴醌，從而形成黑色素，它的過量表達是導(dǎo)致色素沉著過度的主要原因。

以PEE70為效應(yīng)物，研究不同濃度效應(yīng)物對小鼠B16細胞中與黑色素生成相關(guān)蛋白Tyrosinase、TRP-1的蛋白表達量的影響，見圖4。由圖4可知，與空白組相比，加模型組達到了極顯著水平(P<0.001)；與模型組相比，濃度為10、20 mg/L的PEE70可導(dǎo)致小鼠B16細胞中Tyrosinase、TRP-1蛋白表達量顯著的降低(P<0. 01)，而內(nèi)參β-actin蛋白的表達量并沒有顯著變化。說明PEE70可導(dǎo)致黑素合成關(guān)鍵蛋白Tyrosinase及酪氨酸酶相關(guān)蛋白1TRP-1都有一定程度上的降解。

圖4 不同濃度的PEE70對Tyrosinase、TRP-1蛋白表達量的影響*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，與對照組比較Fig.4 Effect of different concentration of PEE70 on Tyrosinase and*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

3 討論

由于化妝品潛在的突變和對皮膚的刺激作用，尋找天然產(chǎn)物作為美白劑成為化妝品行業(yè)的一個發(fā)展趨勢，天然產(chǎn)物既具有較高的安全性，又有一定的生理活性，滿足了消費者的需求。紅杜仲是我國名貴滋補藥材，各國學(xué)者相繼開展了大量研究以確定紅杜仲的活性物質(zhì)，不同的化學(xué)成分并分別具有不同的化學(xué)活性。特別是作為壯瑤醫(yī)常用的藥物之一，紅杜仲值得進一步深入研究和開發(fā)，目前還未見其在美白方向的報道[3]。

本實驗通過多種體外實驗研究了不同濃度乙醇回流的紅杜仲的美白活性，確定PEE70效果最佳，其對B16細胞內(nèi)的酪氨酸酶活性和黑素合成量的抑制作用都能達到極其顯著的抑制作用(與對照組比，P<0.001)，且呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性；進一步研究發(fā)現(xiàn)，PEE70能夠顯著降低B16細胞中Tyrosinase、TRP-1的表達(與對照組比，P<0.01)，結(jié)合PEE70能夠很好的降低蘑菇酪氨酸酶活力、抑制B16細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，本研究認為PEE70具有抑制皮膚黑素合成的作用，其作用途徑與抑制酪氨酸酶的生成量和激活有關(guān)。

綜上所述，紅杜仲在美白化妝品方向上具有一定的開發(fā)前景，值得進一步進行活性成分的研究。本實驗為紅杜仲的進一步應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但是由于生物體內(nèi)黑色素形成與積累過程比較復(fù)雜，其抑制途徑也是多方面的，因此對于紅杜仲是否還可以通過其他途徑阻止黑色素的合成與積累有待進一步的深入研究。

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(編校：王冬梅)

Study on the Whitening activity and pathway of red eucommia herbs

LIN Jin-bin1,2, REN Tong3, LIAN Yi-jiang1,2, LI Wei-jie1,2, JIN Xin1,2, XIA Zhi-bo1,2Δ, LI Wen-jun1,2Δ

(1.Medical College,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Xiamen Key Laboratory of Chiral Drugs, Xiamen 361102,China； 3.School of Biomedical Science, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China;)

ObjectiveTo determine the impact of PEE with different ethanol concentration extract on the activity of tyrosinase in B16 melanoma and to explore the feasibility of PEE used as skin whitening agent make use of a model organism.Methods30%, 50%, 70%, 95%,different concentration of ethanol reflux got four kinds of PEE alcohol extract, respectively. And selected the most active inhibition to mushroom tyrosinase(PEE30、PEE50、PEE70、PEE95). The effect of extracts from the selected on B16 cell model was determined by MTS, NaOH splitting decomposition, L-DOPA oxidation progress. The change in protein expression level after ethanol extract of PEE was determined by Western bolt.ResultsThe capacity of inhibition to mushroom tyrosinase in each concentration of PEE extraction, but PEE70 had the most active inhibition. When challenged with B16 cell model, PEE70 showed the capacity of decrease in tyrosinase activities and melanin synthesis (P<0.01) and had a does dependence ; it also decreased Tyrosinase and TRP-1 expression compared with control B16 cells.ConclusionThese data support the idea that PEE can restrain melanogenesis, through its inhibitory effect on the activity of tyrosinase.

red eucommia herbs; B16 cells; melanin synthesis; inhibition effect

林錦彬，男，碩士，實驗員，研究方向：中藥活性成分研究，E-mail：704959837@qq.com；夏智波，通信作者，男，副教授，研究方向：中醫(yī)藥研究，E-mail:xiazhibo@xmu.cdu.cn;李文君，共同通信作者，女，碩士，高級實驗師，研究方向：糖尿病、腦缺血等，E-mail:liwenjun@xmu.edu.cn。

R285

A

1005-1678(2015)12-0021-04