馬莎，林俊Δ，晉松，李芹，張虹，于亮

(1.云南省第一人民醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，云南 昆明 650032；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室，云南 昆明 650118)

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siRNA抑制survivin基因表達(dá)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響

馬莎1，林俊1Δ，晉松1，李芹1，張虹1，于亮2

(1.云南省第一人民醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，云南 昆明 650032；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室，云南 昆明 650118)

目的 研究靶向存活素(survivin)的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制survivin基因表達(dá)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)增殖與凋亡的影響。方法 體外分離培養(yǎng)RA患者滑膜成纖維細(xì)胞(RASFs)，設(shè)計合成靶向survivin的siRNA及陰性對照，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染RASFs細(xì)胞；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白印跡法檢測RASFs中survivin的mRNA表達(dá)及蛋白水平。四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 實驗組與陰性對照siRNA組及空白對照組相比，轉(zhuǎn)染48h后滑膜成纖維細(xì)胞survivin的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。 實驗組與陰性對照siRNA組及空白對照組相比，轉(zhuǎn)染后的滑膜成纖維細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)。實驗組轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h生長抑制率分別為(11.5±2.6)%、(26.2±3.4)%、(47.6±4.1)%，于轉(zhuǎn)染后72小時最為顯著。實驗組凋亡率為(23.87±1.6)%，顯著高于陰性對照組(9.72±1.15)%和空白對照組(8.70±1.09) %(均P<0.05)。結(jié)論 靶向survivin的siRNA通過下調(diào)survivin表達(dá)水平，抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

存活素；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜成纖維樣細(xì)胞； siRNA；凋亡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)滑膜組織炎性增生、新生血管形成及關(guān)節(jié)破壞為主要特征的慢性、進(jìn)行性、自身免疫性疾病[1]。RA滑膜成纖維細(xì)胞(RA synovial fibroblasts，RASFs)是介導(dǎo)滑膜炎癥反應(yīng)、血管翳形成和關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞[2]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞凋亡障礙是RA發(fā)病的主要機(jī)制之一[3]。機(jī)體內(nèi)存活素 (survivin)作為凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis of protein ，IAP)家族成員，不僅具有調(diào)控細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期的雙重功能，而且可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管的生成等[4]。已有研究表明，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織，甚至成纖維樣滑膜細(xì)胞、滑液以及外周血中均發(fā)現(xiàn)有survivin異常高表達(dá)，且與關(guān)節(jié)侵蝕程度呈正相關(guān)[5-6]。Bokarewa等人發(fā)現(xiàn)血清中的survivn抗體能減緩這種侵襲過程，用survivin反義寡核苷酸下調(diào)survivin表達(dá)可以導(dǎo)致IL-6水平下降，從而減輕炎癥反應(yīng)。深入認(rèn)識和揭示survivin在RA滑膜凋亡異常及RA發(fā)病機(jī)制中的作用對尋找RA的基因靶向治療的方法具有重要意義。

本實驗旨在驗通過構(gòu)建靶向survivin的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染RASFs，觀察抑制survivin對RASFs增殖及凋亡的影響，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料：滑膜組織取材自云南省第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科關(guān)節(jié)鏡下3例行部分切除膝關(guān)節(jié)滑膜手術(shù)的RA患者，其均符合2009年由美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，并排除其它自身免疫性疾病、感染、腫瘤等關(guān)節(jié)相關(guān)疾病。所有患者均簽署知情同意書。

主要試劑：澳洲胎牛血清FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、II型膠原酶(美國Sigma)，survivin兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)，GAPDH鼠抗人單克隆抗體(上海abmart公司)，SYBR Green Master(Roch公司)，Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，小干擾RNA(siRNA)序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。實時熒光定量PCR引物(Invitrogen公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(北京全式金)，RI-PA裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒顯色法(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)RA滑膜成纖維細(xì)胞：在無菌術(shù)室條件之下，關(guān)節(jié)鏡手術(shù)獲取RA患者的滑膜組織，一次性平皿中PBS沖洗組織4～5次，眼科剪充分剪碎至糊狀，加入約30倍體積的Ⅱ型膠原酶(1 mg/mL)于37 ℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化4 h，每15 min取出振搖一次，對其進(jìn)行1000 r/min離心，在5 min之后，去除其中膠原酶，并添加PBS液洗進(jìn)行3次離心操作，并應(yīng)用細(xì)胞篩除去組織中存在的碎塊，適量加入15%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液(含青鏈霉素雙抗)后，用巴氏細(xì)胞吸管反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，每過3 d后更換1次培養(yǎng)液，并除去其中未貼壁的細(xì)胞，2周之后，成纖維細(xì)胞貼壁生長密度可以達(dá)到85%～90%，并可按1:3比例設(shè)置，培養(yǎng)傳代細(xì)胞。對于本實驗中，將應(yīng)用3～7代滑膜成纖維細(xì)胞。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染滑膜成纖維細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前24 h選擇對數(shù)生長期RASFs細(xì)胞，按照4×105個/孔密度接種至6孔板，每孔使用2 mL不含抗生素10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，融合密度達(dá)80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對照組(加入DMEM高糖培養(yǎng)基)、陰性對照組(加入陰性對照序列siRNA)、實驗組(加入合成的survivin-siRNA)，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明進(jìn)行實驗。實驗組siRNA-survivin靶序列5’-GAAGCAGTT-TGAAGAATTA-3’NT391～409，陰性對照siRNA 5’-TTCTCCG-AACGTGTCACGT-3’。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測:可根據(jù)PCR檢測survivin mRNA的表達(dá)情況，收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，依據(jù)Trizol方法提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的總RNA，并應(yīng)用紫外分光光度計檢測其純度和濃度。采用合格的RNA標(biāo)本，每組總RNA各2 μg，按北京全式金cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA作為模板，采用SYBR熒光染料法進(jìn)行實時定量PCR檢測各組mRNA表達(dá)，反應(yīng)體系為25 μL，每個樣品分別設(shè)計3個重復(fù)。survivin上游引物：“5’-GACCACCGCATCTCTACATTC-3’ ”，下游引物：“5’-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3’ ”；GAPDH上游引物為：“5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ ”，下游的引物為：“5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ ”；實時定量PCR儀循環(huán)設(shè)置：95 ℃10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s，58 ℃30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。用相對定量方法2-△△Ct值[8]表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.2.4 檢測survivin蛋白表達(dá)水平:轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞并提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將定量后的蛋白(30 μg)用15%的十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離膠進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(poly vinylidenefluoride，PVDF)膜，然后用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，孵育survivin一抗(1:2000稀釋)、和內(nèi)參GAPDH一抗(1:10000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，用特異性辣根過氧化物酶去標(biāo)記二抗( 稀釋比例1:7000)，在室溫內(nèi)孵育1 h，應(yīng)用TBST3次洗膜，每次10 min。最后用化學(xué)發(fā)光試劑(chemiluminescence，ECL)顯色并于暗室曝光。標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值由survivin目的條帶和GAPDH內(nèi)參條帶的比值來確定。用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進(jìn)行密度掃描，用Scion-Image軟件對圖像進(jìn)行分析，測目標(biāo)蛋白和內(nèi)對照GAPDH蛋白二者電泳條的灰度值，以其得出的比值來表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。每個樣本設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。表達(dá)抑制率=(1-實驗組蛋白相對表達(dá)量/空白對照組蛋白相對表達(dá)量)×100%

1.2.5 四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazoly tetrazolium，MTT法)檢測抑制survivin表達(dá)對RASFs增殖的影響:取對數(shù)生長期的RASFs，轉(zhuǎn)染前24 h按5×103個/孔的比例將細(xì)胞接種到96孔板上，并根據(jù)上述分組，依照96孔板的參數(shù)說明規(guī)則進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，在轉(zhuǎn)染6 h之后，完全更換其培養(yǎng)基，并在隔段培養(yǎng)24 h、48 h、72 h過程中，均在每孔中加入5 mg/mL濃度的MTT30 μL，37 ℃作用4 h，PBS輕微洗滌2次后每孔加入150 μL DMSO，室溫避光振搖15 min。每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，測定490 nm波長下的吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100%。

1.2.6 細(xì)胞凋亡分析:采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。接種細(xì)胞至爬片后按上述方法轉(zhuǎn)染及分組，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞爬片，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。可在光鏡下去觀察細(xì)胞的染色情況，對于細(xì)胞核中，若是出現(xiàn)棕黃色顆粒，就表示是陽性細(xì)胞，也就是凋亡的細(xì)胞。對于每張爬片中，應(yīng)用5個高倍鏡視野( 400×)計數(shù)其凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)以及總細(xì)胞核數(shù)，則細(xì)胞凋亡率 = 陽性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%，可取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測survivin蛋白表達(dá) 對于轉(zhuǎn)染48h之后，在實驗組以及陰性對照組與空白對照組中，其survivin蛋白的相對表達(dá)量是0.11±0.03、0.63±0.09、0.66±0.09(圖1)，實驗組顯著低于空白對照組和陰性對照組(F=68.13，P<0.05)，在陰性對照組和空白對照組之間，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與空白對照組比較，實驗組survivin蛋白表達(dá)明顯下降，表達(dá)抑制率為83.3%。Western blot的結(jié)果與熒光實時定量PCR的結(jié)果一致，與陰性對照組和空白對照組相比較，轉(zhuǎn)染survivin- siRNA的實驗組RASFs細(xì)胞中，survivin蛋白被顯著抑制。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染48 h后各組結(jié)果比較Tab.1 Comparison of the results after transfection 48 ±s)

*P<0.05，與陰性對照組比較，compared with the negative control group；#P<0.05，與空白對照組比較，compared with the blank control group

圖1 各組滑膜細(xì)胞survivin的蛋白表達(dá)量A：空白對照組；B：陰性對照組；C：實驗組Fig.1 The protein expression of Survivin in synovial cells of each groupA: Blank control group, B: Negative control group, C: Experimental group

2.2 survivin mRNA表達(dá)的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 在轉(zhuǎn)染48 h之后，在實驗組、陰性對照組以及空白對照組中，其survivin mRNA相對表達(dá)量分別是(21.0±2.6)%、(95.3±3.5)%、100%，實驗組顯著低于空白對照組以及陰性對照組(F=914.6，P<0.05)，同時，對比陰性對照組與空白對照組，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.065，P>0.05)。見表1。

2.3 survivin-siRNA干擾RASFs細(xì)胞后對其凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組細(xì)胞凋亡率為(23.87±1.6)%，與空白對照組(8.70±1.09)%和陰性對照組(9.72±1.15)%比較，實驗組細(xì)胞凋亡率明顯增加(F=167.10，P<0.05 )。在陰性對照組和空白對照組中的細(xì)胞凋亡率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.30，P>0.05)，提示干擾survivin基因表達(dá)后促進(jìn)了RASFs細(xì)胞的凋亡。見表1。

2.4 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染24 h后實驗組細(xì)胞生長速度較空白對照組和陰性對照組減慢(F=18.58，P<0.05)，生長抑制率為(11.5±2.6)%，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞增殖能力較空白組和陰性對照組受到明顯抑制(F=112.44，P<0.05)，生長抑制率為(26.2±3.4)%。轉(zhuǎn)染72 h后，實驗組細(xì)胞生長抑制率為(47.6±4.1)%，與對陰性照組比較，實驗組細(xì)胞的生長抑制則更為明顯 (P<0.05)；在陰性對照組與空白對照組中，在轉(zhuǎn)染后各個時點中，其細(xì)胞生長抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

組別24h48h72h空白對照組0.159±0.0070.170±0.0040.185±0.007實驗組0.136±0.006*#0.126±0.005*0.097±0.005*陰性對照組0.156±0.0050.167±0.0050.186±0.004F值18.58112.44340.23p值0.0010.0010.001

*P<0.05，同一轉(zhuǎn)染時間與陰性對照組比較，compared with the negative control group at the same transfection time；#P<0.05，同一轉(zhuǎn)染時間與空白對照組比較，compared with the blank control group at the same transfection time

3 討論

正常的滑膜組織僅由1～2層細(xì)胞構(gòu)成，而RA可增至8～10層，這些過度增殖的滑膜細(xì)胞向關(guān)節(jié)軟骨及骨組織浸潤性生長，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙[9]。RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡異常在RA的疾病發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，最終導(dǎo)致滑膜病理性增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞等一系列病理生理改變[3]。在Ahn JK等人研究中，應(yīng)用免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)在RA關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞中，survivin表達(dá)的水平高于正常人，認(rèn)為滑膜成纖維細(xì)胞是形成產(chǎn)生survivin的一個重要來源；在凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族中，survivin是具有可以抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，在其研究中表明，在常見的惡性腫瘤中亦可發(fā)現(xiàn)survivin的高表達(dá)[11]。對于RA患者中，可發(fā)現(xiàn)在滑膜細(xì)胞、滑液以及外周血中，均有survivin高表達(dá)發(fā)生，而對于正常成熟滑膜細(xì)胞以及骨骼組織之中，則無survivin表達(dá)異常，且survivin的表達(dá)與RA病情活動及骨侵蝕程度呈正相關(guān)，而抗Survivin抗體與關(guān)節(jié)侵蝕呈負(fù)相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)，RA患者經(jīng)抗風(fēng)濕藥物(DMARS)治療后，以及對于改善病情的RA患者，其滑膜細(xì)胞中的Survivin高表達(dá)水平有明顯降低趨勢；臨床中，應(yīng)用Survivin反義寡核昔酸，也可下調(diào)IL-6炎性因子，這些研究使得survivin靶向治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成為可能[4-7]。

RNA干擾(RNA interference RNAi)，就是在短雙鏈RNA誘導(dǎo)以及同源mRNA之間的降解過程中，能夠?qū)虺聊?，運用RNAi干擾技術(shù)，可以在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄后，抑制基因水平表達(dá)，可研究控制基因功能[12]。本研究合成靶向survivin的siRNA，轉(zhuǎn)染RA滑膜成纖維細(xì)胞，48h后滑膜成纖維細(xì)胞survivin的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降。實驗組survivin基因mRNA相對表達(dá)量為(21.0±2.6)%，蛋白的相對表達(dá)量為(0.11±0.03)，與陰性對照組以及空白對照組進(jìn)行比較，P<0.05，細(xì)胞凋亡在陰性對照組和空白對照組中進(jìn)行比較，則差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證實轉(zhuǎn)染特異性survivin-siRNA在一定程度抑制了RA滑膜成纖維細(xì)胞survivin基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)，而陰性序列siRNA對survivin的表達(dá)無影響。轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h實驗組細(xì)胞與陰性對照與空白對照組進(jìn)行比較，其細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生下降，其差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)，細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)于轉(zhuǎn)染24 h后出現(xiàn)，隨著時間的增加抑制效應(yīng)遞增。細(xì)胞凋亡檢測證明轉(zhuǎn)染48h后實驗組凋亡率為(23.87±1.6)%，較陰性對照組和空白對照組顯著增加(P<0.05)，證明下調(diào)survivin基因的表達(dá)可促進(jìn)RASFs細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究證實了靶向沉默survivin表達(dá)有抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的作用，提示survivin可能在RA滑膜病理性增生的調(diào)控中具有重要作用，從而具有作為基因靶點治療RA的潛能。

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(編校：譚玲)

siRNA inhibition of survivin gene expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblast proliferation and apoptosis

MA Sha1, LIN Jun1Δ, JIN Song1, LI Qin1, ZHANG Hong1, YU Liang2

(1. Department of Rheumatism and Immunology, Yunnan First People’s Hospital, Kunming 650032, China; 2.Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Genetics, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo study the targeting survivin small interfering RNA (siRNA) to inhibit proliferation and apoptosis survivin gene expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASFs).MethodsRA patients were isolated and cultured in vitro synovial fibroblasts (RASFs), designed and synthesized siRNA targeting survivin and negative control, by liposome transfection RASFs cell; real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and Western blot RASFs detect mRNA expression and protein levels of survivin. Tetrazolium blue (MTT) assay of cell proliferation; TUNEL assay apoptosis.ResultsThe experimental group compared with the negative control siRNA group and control group, 48h after transfection of synovial fibroblasts survivin mRNA and protein expression levels were significantly decreased(P<0.05). The experimental group compared with the negative control siRNA group and control group, synovial fibroblast proliferation after transfection significantly decreased(P<0.05). After the experimental group transfected 24h, 48h, 72h growth inhibition rates were (11.5±2.6)%, (26.2±3.4)%, (47.6±4.1)%, at 72 hours after transfection most significant. The rate of apoptosis in experimental group (23.87±1.6)%, significantly higher than the negative control group (9.72±1.15)% and the control group (8.70±1.09)% (allP<0.05). ConclusionsiRNA targeting survivin expression levels through reducing survivin, inhibit synovial fibroblast proliferation and promotes apoptosis.

survivin; rheumatoid arthritis; synovial fibroblast-like cells; siRNA; apoptosis

云南省科技廳昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項基金(2011FB215)

馬莎，女 ，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：自身免疫性疾病的臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail：15925203463@126.com；林俊，通信作者,女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：彌漫性結(jié)締組織病的診治，E-mail：lunjun06@sina.com。

R593.22

A

1005-1678(2015)12-0017-04