鄭國亞，連波，劉順梅Δ，齊佳，劉曉影，綦慧敏

( 1. 濰坊醫(yī)學院 生物科學與技術(shù)學院，山東 濰坊 261053；2. 濰坊醫(yī)學院 藥學院，山東 濰坊 261053)

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單次大劑量和多次小劑量STZ誘導昆明小鼠1型糖尿病模型的探究

鄭國亞1，連波1，劉順梅1Δ，齊佳1，劉曉影1，綦慧敏2

( 1. 濰坊醫(yī)學院 生物科學與技術(shù)學院，山東 濰坊 261053；2. 濰坊醫(yī)學院 藥學院，山東 濰坊 261053)

目的 通過研究單次大劑量和多次小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 誘導昆明小鼠1型糖尿病的成模率和穩(wěn)定性，探究理想的1型糖尿病小鼠建模方法。方法 60只昆明小鼠隨機分為4組(15只/組)：空白對照組、陰性對照組(注射磷酸鹽緩沖液)、單次大劑量組(150 mg/kg，單次腹腔注射)、多次小劑量組(50 mg/kg，連續(xù)注射5 d)。末次注射后，每天測定小鼠攝食量和飲水量，每周測定小鼠空腹血糖及體質(zhì)量1次，連續(xù)觀察4周。結(jié)果 2個模型組小鼠均表現(xiàn)出糖尿病的“三多一少”癥狀，模型組小鼠的平均空腹血糖均明顯高于2個對照組(P<0.05)。單次大劑量組和多次小劑量組的小鼠第1周時成模率分別為60%和53.33%，4周后分別為60%和80%，4周后的死亡率分別為33.33%和20%。且多次小劑量組中高血糖小鼠的血糖值從第2周始一直穩(wěn)定上升并維持在較高水平。結(jié)論 多次小劑量注射STZ (50 mg/kg連續(xù)注射5d)是較理想的建立昆明小鼠1型糖尿病模型的方法。

鏈脲佐菌素；1型糖尿病模型；昆明小鼠；單次大劑量；多次小劑量

糖尿病(diabetes mellitus，DM)的全球患病率逐年上升，目前已成為繼腫瘤與心腦血管病之后的第三大嚴重威脅人類健康的慢性代謝類疾病，主要分為1型(type 1 diabetes mellitus，T1DM)及2型(T2DM)。T1DM被認為是由T細胞介導的胰島β細胞選擇性破壞而引起的自身免疫性疾病[1-2]。迄今為止，該病的病因及發(fā)病機理還不完全清楚，預防和治療措施仍不完善。因此，構(gòu)建T1DM動物模型成為現(xiàn)代醫(yī)學研究T1DM的重要舉措[1]。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 是目前世界范圍內(nèi)最常用的誘發(fā)動物糖尿病的化學誘導劑[3]，具有毒性低、用藥量小、高特異性的破壞胰島β細胞等優(yōu)點。STZ誘導DM動物模型的方法有兩種，即單次大劑量或多次小劑量腹腔注射[3-6]。盡管目前已有多篇STZ用于糖尿病鼠建模的文獻報道，但大多數(shù)研究是使用大鼠[4，7-9]和C57BL/6J小鼠[1-2，5-6，10-11]，利用昆明小鼠建模的報道較少[12-14]。而昆明小鼠相對于大鼠來說，不但價格便宜，而且可節(jié)省實驗用藥量，特別適合用于降血糖藥物比較珍貴和難以獲取的實驗。昆明小鼠相對于C57BL/6J小鼠價格便宜很多，對于那些需要較多模型鼠的實驗來說可節(jié)省不少研究費用。所以，利用STZ建立昆明小鼠糖尿病模型的研究是非常必要的。

由于不同的動物品系會對同樣的藥物及劑量產(chǎn)生不同的反應，C57BL/6J以及其它品系小鼠的適宜建模方法不一定適用于昆明小鼠。因此，本文探討了單次大劑量和多次小劑量STZ注射誘導T1DM小鼠模型的成模率及死亡率，以期為構(gòu)建理想的T1DM昆明小鼠模型提供實驗指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：昆明小鼠，雄性，60只，SPF級，6周齡，體質(zhì)量(25±2)g，購自山東大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(魯) 2013-0009。小鼠飼養(yǎng)于通風、清潔的動物房中，室溫(23±2) ℃，相對濕度(50±5)%，12 h光照和12 h黑暗循環(huán)進行，所有小鼠均自由攝食、飲水。實驗動物嚴格遵守《實驗動物保護條例》，動物處理程序經(jīng)過濰坊醫(yī)學院倫理委員會認證。

1.1.2 藥品與儀器：藥品：STZ購自Sigma公司。儀器：德國卓越型羅氏血糖儀和血糖試紙。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制：1% STZ溶液的配制：將STZ粉末溶于預冷的pH 4.2～4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中配成新鮮的1% STZ溶液，并用0.22 μm一次性濾器過濾除菌。

1.2.2 動物分組與處理：購買的昆明小鼠在實驗室適應性飼養(yǎng)2周后選取空腹血糖介于3.0～6.0 mmol/L的健康小鼠為實驗對象，隨機分為4組(15只/組)：正常對照組、陰性對照組、單次大劑量組(150 mg/kg)和多次小劑量組(50 mg/kg)。小鼠的建模方法參考文獻[1-2,5]中的方案，并加以優(yōu)化，各組小鼠分籠飼養(yǎng)，造模前禁食12 h，自由飲水。禁食結(jié)束后，正常對照組無任何處理；陰性對照組連續(xù)5 d腹腔注射與實驗組同體積(約0.35 mL)的檸檬酸緩沖液；單次大劑量組一次性腹腔注射150 mg/kg 1% STZ溶液；多次小劑量組連續(xù)5 d腹腔注射50 mg/kg 1% STZ溶液。

1.2.3 模型評鑒指標：注射STZ后每天觀察并記錄小鼠的一般狀況和死亡情況，一般狀況主要包括精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、運動情況和排尿情況等；每天測量各組小鼠的攝食量和飲水量；每周測量一次空腹血糖和體質(zhì)量，連續(xù)4周?？崭寡侵怠?1.1 mmol/L為建模成功[10]。比較各組的成模率和死亡率、成模小鼠的血糖值變化和體質(zhì)量變化等。

2 結(jié)果

2.1 小鼠外觀形態(tài)觀察 注射STZ后，各組給予充足的糧和水，墊料每天更換一次，保持干燥。在整個實驗期間，對各組小鼠外觀形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組和陰性對照組(下稱對照組)的小鼠皮毛潔白干凈，有光澤，精神狀況良好，比較活潑，反應靈敏，排尿量少；而單次大劑量組和多次小劑量組(下稱模型組)的小鼠出現(xiàn)毛色灰暗、變黃，精神萎靡，活動少，反應遲緩等表象。單次大劑量組從注射后第3 d起出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，多次小劑量組從第一次注射后的第6 d起出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，2個模型組的墊料明顯比2個對照組墊料的濕度大，多尿癥狀明顯。

2.2 不同建模方法對小鼠飲水量和攝食量的影響 注射STZ后，兩個實驗組與兩個同齡對照組相比飲水量均有顯著增加(P<0.01)。第1周(首次注射后的第7天)，單次大劑量組的飲水量明顯大于多次小劑量組(P<0.01)，隨后多次小劑量組的飲水量逐漸增加，第3周時2個模型組的飲水量差異無統(tǒng)計學意義，第4周時多次小劑量組的飲水量明顯高于單次大劑量組(P<0.05)。以上結(jié)果表明兩種方法誘導的糖尿病模型小鼠均出現(xiàn)了明顯的多飲癥狀。見表1。

表1 各組小鼠建模前后的飲水量±s，mL)Tab. 1 Water intake of each group of mice before and after modeling ±s，mL)

*P<0.05，**P<0.01，與正常對照組相比，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，與單次大劑量組相比，compared with single high dose group .

給藥后單次大劑量組和多次小劑量組的攝食量均比兩個對照組有顯著增加(P<0.01)。在第1周時，單次大劑量組的攝食量大于多次小劑量組(P<0.01)；隨著建模時間延長，多次小劑量組的攝食量逐漸增加，第2周和第3周時2個模型組的攝食量間已差異無統(tǒng)計學意義，到第4周時，多次小劑量組的攝食量明顯高于單次大劑量組(P<0.01)。上述結(jié)果表明，兩種方法誘導的糖尿病小鼠均出現(xiàn)了多食的癥狀。見表2。

表2 各組小鼠建模前后攝食量 ±s，g)Tab. 2 Food intake of each group of mice before and after ±s，g)

*P<0.05，**P<0.01，與正常對照組相比，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，與單次大劑量組相比，compared with single high dose group .

2.3 不同建模方法對小鼠體質(zhì)量的影響 建模前各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，但在實驗期間對照組小鼠的體質(zhì)量逐漸增加，而模型組小鼠的體質(zhì)量卻逐漸下降，2個模型組的體質(zhì)量明顯低于兩個對照組(P<0.01)，而單次大劑量和多次小劑量組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。實驗還發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠中血糖水平恢復正常者比同組糖尿病小鼠的體質(zhì)量略有增加。見表3。

表3 各組小鼠建模前后體質(zhì)量±s，g)Tab. 3 Body weight of each group of mice before and after modeling ±s，g)

*P<0.05，**P<0.01，與正常對照組相比，compared with normal control group

2.4 不同建模方法對小鼠空腹血糖的影響 小鼠血糖高低直接體現(xiàn)建模成功與否。建模前各組小鼠空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義，但在注射STZ后，單次大劑量組和多次小劑量組小鼠的平均空腹血糖與兩個對照組相比都顯著升高(P<0.01)。第1周時，單次大劑量組小鼠空腹血糖高于多次小劑量組，但兩者之間的差異無統(tǒng)計學意義。隨著實驗的進行，單次大劑量組中個別小鼠的空腹血糖值有所下降，最終恢復到正常值；而多次小劑量組的小鼠空腹血糖值穩(wěn)定升高，最終達到一個較高的水平，其平均空腹血糖值明顯高于單次大劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠建模前后空腹血糖值Tab. 4 Fasting blood glucose level of each group of mice before and after modeling ±s，mmol/L)

*P<0.05，**P<0.01，與正常對照組相比，compared with normal control group；#P<0.05，與單次大劑量組相比，compared with single high dose group.

2.5 不同建模方法對模型成功率的影響 STZ注射1周后，單次大劑量組死亡2只，成模9只；其死亡率為13.33%，成模率為60%。多次小劑量組在1周后的死亡數(shù)為0，成模率為53.33%。隨著實驗的進行，單次大劑量組死亡鼠增多，個別小鼠的血糖值逐漸降低至正常血糖水平，因而平均血糖值呈下降趨勢(見表4)，至實驗結(jié)束時其成模率為60%，死亡率為33.33%。與之相反，多次小劑量組小鼠的血糖逐漸增高，其成模率隨實驗進行呈上升趨勢，第4周時的成模率為80%，死亡率為20%。見表5。

表5 各組成模鼠和死亡鼠的數(shù)量(只)Tab.5 Number of successful modeled mice and number of died mice in each group(number)

3 討論

糖尿病是一種全球性疾病，近年來，由于諸多因素的影響，糖尿病的全球發(fā)病率迅速上升，嚴重威脅著人類健康。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會估算，到2030年，全世界糖尿病患者將由2010年的2.85億上升至4.38億[15]。因此，對糖尿病的發(fā)病機制、預防與治療等研究已不容忽視。為了克服人體研究的局限性，構(gòu)建理想且可靠的糖尿病動物模型已成為研究糖尿病發(fā)病機制、并發(fā)癥以及研制新型治療藥物的重要手段。

盡管目前已有不少用小鼠建立糖尿病模型的報道，但這些研究絕大多數(shù)都是采用C57BL/6J小鼠建模，也有以ICR[5，16-17]、BALB/C[16，18]和CD-1[3]小鼠為實驗對象的研究，利用昆明小鼠建模的報道較少，對于適合昆明小鼠的STZ劑量、給藥方式、成模率等關(guān)系研究也不夠深入。昆明小鼠是我國最常用的實驗動物之一，價格便宜，適用性廣。因此，利用STZ誘導昆明小鼠糖尿病模型非常值得研究。

本實驗以昆明小鼠為實驗對象，采用單次大劑量(150 mg/kg)和多次小劑量(50 mg/kg，連續(xù)5 d)腹腔注射STZ誘導T1DM，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述2種不同的STZ處理方式均能使模型組小鼠的攝食量和飲水量顯著增加，排尿量增加，體質(zhì)量顯著減少，即糖尿病的“三多一少” 癥狀非常明顯；模型組小鼠的空腹血糖水平也顯著高于正常組和陰性對照組。這些結(jié)果表明單次大劑量和多次小劑量腹腔注射STZ均能成功誘導昆明小鼠發(fā)生糖尿病。這與周燁文[12]、韋立順[13]、屈彥純[14]的實驗結(jié)果相符。周燁文[12]的研究發(fā)現(xiàn)45 mg/kg STZ連續(xù)注射5 d能較好地誘導昆明小鼠發(fā)生糖尿?。豁f立順[13]發(fā)現(xiàn)一次性腹腔注射150 mg/kg STZ可誘導83.3%的昆明小鼠發(fā)?。磺鼜┘僛14]的研究結(jié)果顯示180 mg/kg STZ一次性腹腔注射和50 mg/kg STZ連續(xù)5天注射都可成功誘發(fā)糖尿病，180 mg/kg組和50 mg/kg組在注射STZ 2周后的成模率分別為90%和80%。

本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然單次大劑量和多次小劑量STZ注射都能誘發(fā)糖尿病，但多次小劑量注射比單次大劑量注射的成模率要高，死亡率較低，且高血糖在造模后4周內(nèi)穩(wěn)定性好。150 mg/kg 和50 mg/kg組在建模1周后血糖分別為16.62和14.66 mmol/L，4周時的血糖分別為13.85和19.98 mmol/L。這些結(jié)果說明單次大劑量STZ注射可使小鼠的血糖水平快速升高但穩(wěn)定性較差，隨著實驗的進行血糖會有所下降；而多次小劑量STZ注射雖然使小鼠的血糖水平升高緩慢，但血糖可持續(xù)上升，直至維持在較高水平。

綜上所述，實驗結(jié)果表明單次大劑量和多次小劑量注射STZ的方法均能誘發(fā)小鼠T1DM。單次大劑量注射與多次小劑量注射方法相比，操作簡單，用藥量小，但對小鼠的毒性較大，死亡率較高，成模率較低，血糖水平波動幅度大，有些小鼠可逐漸恢復至正常血糖水平。而多次小劑量注射建模方法雖然用藥量大，操作麻煩，但卻具有成模率較高、死亡率較低的優(yōu)點，且血糖值一直維持在較高水平，很少見到復轉(zhuǎn)。

一般認為，單次大劑量STZ注射會造成胰島β細胞大量破壞，胰島素的分泌明顯下降，進而使血糖迅速升高，形成急性糖尿病，但此模型無胰島炎癥，與人類T1DM患者的實際病理特征差距較大[19]。而多次小劑量注射STZ可部分破壞胰島β細胞，可誘發(fā)針對胰島β細胞的自身免疫性損傷，使血糖水平漸進性升高，誘導形成遲發(fā)型T1DM，這種漸進性胰島損害能更好的模擬人類T1DM的發(fā)病機制和胰島損害[20]，建立這種動物模型可能對人類研究和治療糖尿病具有更好的幫助與指導作用。

綜合考慮本次實驗結(jié)果與前人的有關(guān)理論，多次小劑量注射STZ 50 mg/kg是較單次大劑量注射150 mg/kg更為科學而有效的建立T1DM小鼠模型的方法。

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(編校：譚玲)

Construction of type 1 diabetic KM mice model induced by single high dose and multiple low dose of streptozotocin

ZHENG Guo-ya1, LIAN Bo1, LIU Shun-mei1Δ, QI Jia1, LIU Xiao-ying1, QI Hui-min2

(1. Weifang Medical College, School of Bioscience and Technology, Weifang 261053, China; 2. Weifang Medical College, School of Pharmacy, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo explore an optimal method of producing STZ-induced type 1 diabetic KM mice model by investigating the molded rate of single high dose and multiple low dose of STZ injection.MethodsSixty KM mice were randomly divided into 4 groups(n=15), two control groups and two model groups. In the two control groups, one was blank control and the other was negative control. Mice in the blank control group treated with no injection, but mice in the negative control group were treated with injection of citric acid salt buffer. For the two model groups, one was single high-dose group, 150 mg/kg STZ was injected only once. The other was multiple low-dose group, 50 mg/kg STZ was injected for 5 consecutive days. After the last injection, daily food and water intake were tested, blood glucose level and body weight were examined once a week for 4 consecutive weeks.ResultsMice in the two model groups showed typical features of diabetes. The blood glucose levels in the two model groups were significantly higher than in the two control groups(P<0.05). For the two model groups, the molded rate of 150 mg/kg and 50 mg/kg group were 60% and 53.33% respectively at 1st week, but at the 4th week, they were 60% and 80% respectively. The mortality of these two groups at the 4th week was 33.33% and 20% respectively. Moreover, the blood glucose level in multiple low-dose group increased stably from the 2nd week to the 4th week. ConclusionThe multiple low-dose STZ injection (50 mg/kg for 5 consecutive days) is an optimal method for producing KM mice model of type 1 diabetes mellitus.

streptozotocin; type 1 diabetic model; KM mice; single high-dose; multiple low-dose

國家自然科學基金(41206129)；山東省自然科學基金(ZR2012DL13)；山東省高等學?？萍加媱濏椖?J12LM51)；濰坊醫(yī)學院科技創(chuàng)新基金(K1301009)；大學生創(chuàng)新基金(KX2015019)

鄭國亞，女，碩士在讀，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)研究，E-mail：1070933320@qq.com；劉順梅，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)研究，E-mail：liushm@wfmc.edu.cn。

R587.1

A

1005-1678(2015)12-0013-05