陳勇

(貴州省黔東南州食品藥品檢驗所，貴州 凱里 556003)

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八正膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳勇

(貴州省黔東南州食品藥品檢驗所，貴州 凱里 556003)

目的 建立八正膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 用薄層色譜法鑒別大黃素和大黃酚，并用高效液相色譜法測定樣品中大黃素、大黃酚的含量測定。結(jié)果 薄層色譜斑點清晰，且空白無干擾；大黃素結(jié)果表明，大黃素進(jìn)樣量在0.0267～0. 4272 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，Y=1425.7X+2.1521(r=0.9998)；大黃酚進(jìn)樣量在0.0417～0.6677 μg，Y=5×106X-8566.2(r=0.9999)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。加樣平均回收率分別為97.35%、98.39%；RSD分別為1.7%、0.4%。結(jié)論 建立的方法簡便，重復(fù)性好，可用于八正膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

八正膠囊；大黃素；大黃酚；薄層鑒別；含量測定

八正膠囊源于宋朝《太平惠民和劑局方》中的八正散，由扁蓄、滑石、瞿麥、梔子、車前子、大黃、川木通、甘草八味中藥經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)加工而成，具有清熱、通淋和利尿功效。臨床上用于治療泌尿系統(tǒng)感染性疾病[1]。其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中大黃以及梔子的薄層鑒別均較復(fù)雜，且含量測定項只有梔子[2]，為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，確保臨床療效。本實驗對梔子薄層方法的改進(jìn)，增加了大黃的含量測定，從而進(jìn)一步完善八正膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Agillent 1100高效液相色譜儀(美國Agillent公司)；色譜柱：菲羅門 C18(4.6×250 mm，5 μm)， 迪馬C18(4.6×250 mm，5 μm)；梅特勒BP210S百萬分之一電子天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司)；硅膠G、H薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 藥品與試劑 梔子苷(批號：110749-201405，供含量測定用)；大黃素(批號：110756-201410)，大黃酚(批號：110757-201407)，對照品及對照藥材均購于中國藥品生物制品檢定研究所。八正膠囊由某制藥公司生產(chǎn)，批號：091109、1002006、1005012。甲醇(購自上海振興化工一廠，色譜純)，乙腈(購自山東禹王有限公司化工分公司，色譜純)，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.3 薄層鑒別

1.3.1 大黃:取樣品0.5 g內(nèi)容物+10 mL水+1 mL鹽酸，置水浴上通過15 mL乙醚回流提取30 min，共2次，合并乙醚液(酸液備用)，并蒸干，加1 mL三氯甲烷使殘渣溶解，濾液作為供試品溶液。另精密稱取1 g大黃對照藥材，加水煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至10 mL，同法制成大黃對照藥材溶液。參照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗：分別取5 μL上述2種溶液點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，通過石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15︰5︰1)的上層溶液進(jìn)行展開，取出后晾干，并于紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.3.2 梔子：取1 g本品內(nèi)容物，經(jīng)研細(xì)后加30 mL乙酸乙酯，通過超聲處理20 min，并進(jìn)行濾過，濾液蒸干，加1 mL三氯甲烷使殘渣溶解，濾液作為供試品溶液。依據(jù)處方制成缺梔子陰性供試品溶液，取梔子苷對照品和甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為梔子對照品溶液。參照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，分別取5～10 μL上述3種溶液點于同一硅膠G薄層板上，通過乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(6︰4︰0.5︰0.5)展開[3]，取出后晾干，噴加10%硫酸乙醇溶液，并加熱至斑點顯色清晰。

1.4 含量測定

1.4.1 色譜條件：檢測波長和流動相的選擇：經(jīng)紫外-可見分光光度計掃描大黃素和大黃酚在256 nm處均有較大吸收，且藥典2010年版中藥材大黃的含量測定波長為254 nm[4]，為了盡量接近藥典標(biāo)準(zhǔn)，因此本實驗以254 nm作為檢測波長。流動相參照2010年版藥典中(新清寧片)中大黃含量測定流動相，對供試品及對照品的分離度均較好，因此最終確定為乙腈-甲醇-0.1%磷酸(42︰23︰35)。

1.4.2 對照品溶液的制備：精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加甲醇混合并分別制成溶液，每份分別為含大黃素10 μg/mL和大黃酚16 μg/mL的溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備

① 精密稱取裝量差異項下的本品(約0.5 g)，經(jīng)研細(xì)后置具塞錐形瓶中，加甲醇-鹽酸(10︰1)[5]的混合溶液25 mL，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流30 min，若瓶壁有黏附物，須超聲處理去除，再稱定重量，補加甲醇至原有重量，并搖勻濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置5 mL量瓶中，加2%的氫氧化鈉溶液 1 mL， 加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用于測定總大黃酚和總大黃素的含量。

② 精密稱取裝量差異項下的本品(約0.5 g)，經(jīng)研細(xì)后置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理去除30 min，冷卻后稱定重量，補加甲醇至原有重量，并搖勻濾過，取續(xù)濾液，用于測定游離大黃酚和游離大黃素的含量。

1.5 方法

1.5.1 專屬性考察：取缺大黃陰性對照，照1.4.2項下制備方法制成陰性對照溶液，進(jìn)樣分析。

1.5.2 線性關(guān)系考察：精密稱取大黃素對照品0.01068 g，放入100 mL量瓶中，并加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，逐級稀釋，分別配制成濃度為0.00267、0.00534、0.01068、0.02136、0.04272 mg/mL的溶液，分別進(jìn)樣10 μL， 測定。

精密稱取大黃酚對照品0.01676 g(含量按99.6%計算)，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，逐級稀釋，分別配制成濃度為0.00417、0.00835、0.01669、0.03339、0.06677 mg/mL的溶液，分別進(jìn)樣10 μL， 測定。

1.5.3 精密度試驗：以大黃素、大黃酚混合對照品溶液(0.01068、0.01669 mg/mL)連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，測定峰面積。

1.5.4 重復(fù)性試驗：取上述同一批樣品(批號110101)，按1.4.3項下①的方法進(jìn)行制備，共6份，分別測定其總大黃素和總大黃酚總量。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗：按前文所述方法制備供試品溶液，精密進(jìn)樣10 μL，測定大黃素、大黃酚峰面積，在0、2、4、8 h測定1次。

1.5.6 加樣回收率試驗：分別精密量取大黃素、大黃酚對照品甲醇溶液(濃度為0.1068、0.1669 mg/mL)1.0及1.2 mL置6個具塞錐形瓶中，揮干溶劑，再精密量取已測定含量的樣品(同重復(fù)性試驗樣品，其中大黃素、大黃酚含量為0.58、0.79 mg/g) 6份， 分別加入上述具塞錐形瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)正文擬訂的大黃HPLC含量測定供試品制備方法①方法操作，測定大黃素、大黃酚含量，并按下式計算加樣回收率。

分別精密量取大黃素、大黃酚對照品甲醇溶液(濃度為0.1068、0.1669 mg/mL)1.0及0.5 mL置6個具塞錐形瓶中，揮干溶劑，再精密量取已測定含量的樣品(同重復(fù)性試驗樣品，其中大黃素、大黃酚含量為0.36、0.37 mg/g) 6份，分別加入上述具塞錐形瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)正文擬訂的大黃HPLC含量測定供試品制備方法②方法操作，測定大黃素、大黃酚含量，并按下式計算加樣回收率。

1.5.7 方法耐用性考察：采用不同牌號儀器，不同牌號、規(guī)格的色譜柱，按標(biāo)準(zhǔn)正文擬訂的方法，分別測定樣品中總的以及游離大黃素和大黃酚的含量。

1.5.8 樣品含量測定：按前文擬訂的方法，測定收集到的八正膠囊樣品中總大黃素和總大黃酚總量以及游離大黃素和游離大黃酚總量。

2 結(jié)果

2.1 薄層鑒別 在供試品色譜中，與對照藥材色譜位置相對應(yīng)，顯相同顏色的熒光斑點；色譜斑點清晰、分離度良好，陰性對照無干擾，見圖1；在供試品色譜中，與對照藥材色譜位置相對應(yīng)，顯相同顏色的斑點。色譜斑點清晰、分離度良好，陰性對照無干擾。見圖2。

圖1 八正膠囊中大黃的TLC圖1.陰性對照(缺大黃) 2.八正膠囊(批號0911009) 3.八正膠囊(批號1002006) 4.八正膠囊(批號1005012) 5.大黃對照藥材Fig.1 Thin layer chromatography of rhubarb in bazheng capsule

新方法操作的薄層板 為按原標(biāo)準(zhǔn)操作的薄層板圖2 八正膠囊中梔子的TLC圖1.陰性對照(缺梔子) 2.八正膠囊(批號1002006) 3.八正膠囊(批號0911009) 4.八正膠囊(批號1005012) 5.梔子苷對照品Fig.2 Thin layer chromatography of gardenia in bazheng capsule

2.2 專屬性考察 結(jié)果陰性對照色譜中，在大黃素、大黃酚對照品相同保留時間處無色譜峰，陰性對照無干擾。見圖3，圖4。

圖3 八正膠囊陰性對照溶液的HPLC圖Fig.3 High performance liquid chromatogram of negayive control solution of bazheng capsule

圖4 大黃素、大黃酚對照品的HPLC圖Fig.4 High performance liquid chromatogram of emodin and chrysophanol

圖5 八正膠囊樣品(總大黃素、總大黃酚)的HPLC圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of total emodin and chrysophanol in bazheng capsule

2.3 線性關(guān)系考察 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，大黃素峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按最小二乘法計算直線回歸方程，得Y=1425.7X+2.1521(r=0.9998)。結(jié)果表明，大黃素進(jìn)樣量在0.0267～0. 4272 μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖6。

圖6 大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of emodin

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，大黃酚峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按最小二乘法計算直線回歸方程，得Y=5×106X-8566.2(r=0.9999)。結(jié)果表明，大黃酚進(jìn)樣量在0.0417～0.6677 μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖7。

圖7 大黃酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of chrysophanol

2.4 精密度試驗 精密度試驗結(jié)果表明：大黃素峰面積平均值為747562，RSD為0.35%；大黃酚峰面積平均值1716662，RSD為0.28%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 重復(fù)性試驗結(jié)果表明：6次重復(fù)測定總大黃素和總大黃酚總含量為0.53 mg/粒，RSD為1.0%；游離大黃素和游離大黃酚總含量為0.24 mg/粒，RSD為1.4%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：總大黃素峰面積平均值為356.98，RSD為1.7%；總大黃酚峰面積平均值為862.83，RSD為0.2%；游離大黃素峰面積平均值為484284，RSD為0.45%，游離大黃酚峰面積平均值為699077，RSD為0.62%，表明供試品溶液至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 加樣回收率試驗結(jié)果表明：本方法回收率良好。見表1，表2。

表1 大黃素回收率試驗結(jié)果Tab.1 Recovery test of emodin

表2 大黃酚回收率試驗結(jié)果Tab.2 Recovery test of chrysophanol

2.8 方法耐用性考察結(jié)果 方法耐用性試驗結(jié)果表明：該方法耐用性良好。見表3。

表3 方法耐用性試驗結(jié)果Tab.3 Results of durability test

2.9 樣品含量測定 以生產(chǎn)的實際情況及原料藥材含量的波動，暫訂：本品每粒含大黃以總大黃酚(C15H10O4)和總大黃素(C15H10O5)的總量計，不得少于0.35 mg；以游離大黃酚(C15H10O4)和游離大黃素(C15H10O5)的總量計，不得少于0.15 mg。見表4。

表4 八正膠囊樣品含量測定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of bazheng capsule samples

3 討論

在實驗過程中做過車前子以及甘草等的薄層鑒別研究，但是車前子薄層中梔子對其干擾較明顯，陰性供試品與對照品相應(yīng)位置有梔子的斑點。甘草的薄層鑒別中陰性有干擾。這2種薄層鑒別條件有待進(jìn)一步研究。大黃的薄層新方法與原標(biāo)準(zhǔn)相比薄層圖效果相當(dāng)，但提取方法更簡單，因此采用新方法。

大黃素和大黃酚幾乎不溶于水，溶于或微溶于甲醇、乙醇[6]，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，經(jīng)試驗摸索，供試品以甲醇-鹽酸(10:1)提取大黃素及大黃酚溶出率較大，因此確定了提取方法。

[1] 楊麗娟，劉如意，任慧勛，等.八正合劑藥理作用的研究實驗[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，20(6):16.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].73-100.

[3] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：832.

[4] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：536.

[5] 李耿，溫良明，候少貞，等. RP-HPLC測定八正顆粒中大黃素、大黃酚的含量[J].中成藥，2007，29(9):附11-13.

[6] 常新全，丁麗霞．中藥活性成分分析手冊[M]．北京：學(xué)苑出版社，2002：45-14.

[7] 彭邵忠，李耿，蔡大可，等.八正丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2008,19(2)：140-145.

(編校：王冬梅)

Study on quality specification of bazheng capsule

CHEN Yong

(Institute for Food and Drug Control of Guizhou Provincial Qiandongnan, Kaili 556003, China)

ObjectiveTo improve the quality of the standard bazheng capsule.MethodsTLC was used for identification of emodin and chrysophanol content determination, and determination of samples by high performance liquid chromatography.ResultsTLC spots were clear，and the blank without interference. Emodin showed a good linear relationship at range of 0.0267～0.4272 μg,Y=1425.7X+2.1521(r=0.9998);chrysophanol showed a good linear relationship at range of 0.0417～0.6677 μg,Y=5×106X-8566.2(r=0.9999).The recovery was 97.35%,98.39%,and RSD was 1.7%,0.4%.ConclusionThe established methods are simple and with good repeatability, and can be used for the quality control of bazheng capluse.

bazheng capsules; emodin; chrysophanol;TLC; content determination

陳勇，男，學(xué)士，研究員，研究方向：肝病，E-mail:chengyong1232@163.com。

R284.1

A

1005-1678(2015)03-0179-04