吳天山,肖開提·伊布拉因Δ,阿爾帕提·買買提,李相成

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診外科，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 南京 210029)

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GM-CSF分泌型肝癌疫苗對(duì)移植性肝癌小鼠CTL殺傷活性的作用機(jī)制

吳天山1,肖開提·伊布拉因1Δ,阿爾帕提·買買提1,李相成2

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急診外科，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 南京 210029)

目的 研究粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)分泌型肝癌疫苗對(duì)移植性肝癌小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性的作用機(jī)制。方法 本實(shí)驗(yàn)建立3個(gè)組別：肝癌疫苗組(A組)，肝癌組(B組)及PBS對(duì)照組(C組)。在小鼠體內(nèi)注入H 22肝癌細(xì)胞構(gòu)建移植性肝癌組，同時(shí)建立GM-CSF分泌型肝癌疫苗組及PBS對(duì)照組；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每組小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)分子的表達(dá)水平；采用MTT方法檢測(cè)各組脾細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷活性；采用Western blot方法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和γ-干擾素(γ-interferon，γ-INF)的表達(dá)水平。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與肝癌組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗可顯著地增加小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)(P<0.01)；MTT結(jié)果表明，與肝癌組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗可顯著地增加脾細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷活性(P<0.01)；Western blot結(jié)果表明，與肝癌組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗組可顯著下調(diào)TNF-α和γ-INF蛋白的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 GM-CSF分泌型肝癌細(xì)胞疫苗可顯著地抑制H22肝癌細(xì)胞H22的活性，其作用機(jī)制可能是通過活化CD8+T細(xì)胞的表達(dá)和提高脾細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷活性，降低TNF-α和γ-INF蛋白的表達(dá)。

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；移植型肝癌；分泌型肝癌疫苗；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

腫瘤疫苗是腫瘤治療的模式之一，相關(guān)的治療方法包括體細(xì)胞療法、放射靶向治療法、細(xì)胞因子治療法等[1]。以往研究表明[1-2]，腫瘤疫苗的抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過激活體內(nèi)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，發(fā)揮其治療腫瘤的作用。佐劑在腫瘤疫苗中發(fā)揮著提高免疫原性的作用。在以腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的主動(dòng)免疫療法中，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)佐劑的主動(dòng)免疫療法是當(dāng)前研究的熱門課題之一[2]。以往臨床試驗(yàn)研究表明，GM-CSF的疫苗免疫佐劑在前列腺癌、腎癌、惡性黑色素瘤等多種癌癥治療中也發(fā)揮一定的抗腫瘤療效[3-5]。因此，本文旨在研究GM-CSF分泌型肝癌疫苗對(duì)移植型肝癌小鼠的肝細(xì)胞細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性作用的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雌性ICR小鼠60只，5周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SYXK(皖)2006-02。本試驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：GM-CSF 分泌型細(xì)胞(每支0.4 mL，含3×106個(gè)細(xì)胞)購(gòu)于康乃欣檢驗(yàn)試劑生物技術(shù)有限公司；H22小鼠肝癌細(xì)胞株(每支0.1 mL，含有3×106個(gè)細(xì)胞)購(gòu)于science cell公司。

1.1.3 主要試劑：MTT、原代腫瘤細(xì)胞處理試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司，批號(hào)：NYA0598)；胎牛血清(HyClone公司，批號(hào)：NM0877)；鼠抗β-actin、鼠抗TNF-α抗體、鼠抗γ-INF抗體(Santa Cruz，批號(hào)：#L0610)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(中山金橋，批號(hào)：107015)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H 22肝癌細(xì)胞，調(diào)整成1×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，采用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)H 22肝癌細(xì)胞，將其置于培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。密切觀察，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3～5 d傳代1次。

1.2.2 GM-CSF 分泌型肝癌疫苗的制備：首先將H22肝癌細(xì)胞株進(jìn)行高溫滅活處理，再將其和具有GM-CSF分泌功能的細(xì)胞混合(2者的比例為5:3)，當(dāng)GM-CSF分泌量大于 2 μg/(106個(gè)細(xì)胞·24 h)時(shí)，將其分裝凍存，溶化后每份取1 mL的105/ mL處理后的H22肝癌細(xì)胞接種于小鼠淋巴區(qū)。

1.2.3 肝癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型的建立：將小鼠肝癌細(xì)胞株H 22按照3×106個(gè)細(xì)胞/只注入小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)傳代8 d后取出腹水，PBS洗滌3遍，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106/mL，取細(xì)胞混懸液1 mL接種于小鼠右前肢皮下。待接種7天后，進(jìn)行皮下免疫治療，接種主動(dòng)免疫制劑1支(每支0.1 mL)。將上述肝癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型隨機(jī)分為3組(每組8只)：A組為H 22-GM-CSF組：接種GM-CSF分泌型H 22肝癌疫苗，0.1 mL的H22肝癌細(xì)胞與30 μL的GM-CSF分泌細(xì)胞的融合液混合后注射小鼠體內(nèi)；B組為H22肝癌細(xì)胞組：接種H22肝癌細(xì)胞疫苗，每只小鼠注射H22肝癌細(xì)胞0.1 mL；C組為PBS陰性對(duì)照組：接種PBS，每只小鼠注射0.1 mL PBS。每周免疫注射1次，總共注射3次。

1.2.4 外周血中CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)的檢測(cè)：分別于每組免疫前和免疫后7 d處死小鼠，采取腹主動(dòng)脈法取荷瘤鼠外周血液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)分子的表達(dá)水平。

1.2.5 小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)：將免疫前和免疫結(jié)束后的小鼠分別處死后，提取其相應(yīng)的脾細(xì)胞，制備成適當(dāng)?shù)男?yīng)細(xì)胞混懸液，將上述效應(yīng)細(xì)胞與H 22肝癌細(xì)胞(靶細(xì)胞)混合后，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)刺激，觀察效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。采用MTT方法進(jìn)行檢測(cè)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠H 22肝癌細(xì)胞配成(1×107個(gè)/mL)的混懸液接種于96孔板中，每孔加入100 μL的細(xì)胞混懸液，設(shè)立靶細(xì)胞對(duì)照組、效應(yīng)細(xì)胞組和空白對(duì)照組。加藥結(jié)束后將其置于培養(yǎng)箱孵育5 h。作用結(jié)束后，每孔加入MTT溶液后置于37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h，用針頭吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜震蕩溶解甲瓚，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度490 nm(absorbance，A)值，計(jì)算脾細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷活性，計(jì)算公式：殺傷活性(%)=[1-(效/靶混合細(xì)胞的平均A值-效應(yīng)細(xì)胞的平均A值)/對(duì)照孔的平均A值]×100%。

1.2.6 Western blot檢測(cè)TNF-α和γ-INF蛋白的表達(dá)：分別于免疫前和免疫后7 d處死小鼠，采取腹主動(dòng)脈法收集荷瘤鼠外周血液，收集外周血中CD8+T細(xì)胞后，加入含PMSF的蛋白裂解液150 μL，吹打后置于冰上裂解。離心(5 000 r/min)取上清液即為細(xì)胞總蛋白。采用DAB試劑盒(Sigma)檢測(cè)蛋白含量。采用5% SDS-PAGE 電泳分離蛋白樣品；利用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完畢后，取出 PVDF 膜，采用PBST清洗3次，每次10 min；加入5%BSA封閉液室溫封閉1 h；加入一抗(1:1000)4 ℃冰箱孵育過夜；再用PBST洗膜3次，每次10 min；加入相應(yīng)的二抗(1:2000)，室溫孵育1 h；PBST漂洗3次，每次10 min，采用ECL發(fā)光試劑盒(Bioword)檢測(cè)蛋白表達(dá)，曝光，顯影，定影。經(jīng)Adobe Photoshop 6.0(Adobe Systems，San Jose，CA)分析蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)分子的表達(dá)水平(熒光抗體CD8-FITC標(biāo)記細(xì)胞表面抗體)，每組CD8+T細(xì)胞亞群所占比例結(jié)果表明，免疫后，A組外周血中的CD8+T細(xì)胞的含量明顯高于B組、C組(均P<0.01)，見表1。

表1 免疫前后各組小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)的檢測(cè)±s)Tab.1 Detection of CD8+T cell immunity of mice in peripheral blood before and after ±s)

**P<0.01，與B組相比，compared with B group；##P<0.01，與C組相比，compared with C group

2.2 MTT法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞細(xì)胞殺傷活性 每組小鼠分別于免疫前及免疫后7 d處死，收集各組小鼠的脾細(xì)胞制備效應(yīng)細(xì)胞的混懸液，以小鼠肝細(xì)胞H22(靶細(xì)胞)重復(fù)刺激后，觀察各組效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性。如圖所示，與B和C組相比，A組效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性顯著性增加(P<0.01)；而B組與C組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 MTT法檢測(cè)小鼠的CTL的殺傷活性(n=3)A組：H 22-GM-CSF組；B組：H 22肝癌細(xì)胞組；C組：PBS組**P<0.01，與B組相比；##P<0.01，與C組相比Fig.1 The cytotoxicity of CTL examined by MTT assay in each group(n=3)A group：H 22-GM-CSF group； B group：H 22 hematoma cells group； C group：PBS group**P<0.01，compared with B group；##P<0.01，compared with C group

2.3 Western blot檢測(cè)TNF-α和γ-INF蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與B組和C組相比，A組的TNF-α和γ-INF蛋白的表達(dá)均有顯著性下調(diào)，見圖2。

圖2 Western blot法檢測(cè)小鼠的CTL中TNF-α，γ-INF的蛋白表達(dá)水平(n=3)A組：H 22-GM-CSF組；B組：H 22肝癌細(xì)胞組；C組：PBS組**P<0.01，與B組相比；##P<0.01，與C組相比Fig.2 The expression of TNF-α，γ-INF in CTL examined by Western blot assay in each group(n=3)A group：H 22-GM-CSF group； B group：H 22 hematoma cells group；C group：PBS group**P<0.01，compared with B group；##P<0.01，compared with C group

3 討論

腫瘤疫苗是目前腫瘤治療的較為新穎的方法之一。以往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤疫苗的缺點(diǎn)是由于腫瘤抗原的免疫原性表達(dá)較弱，因此機(jī)體免疫系統(tǒng)不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞竟而針對(duì)性的殺死腫瘤組織[6]。目前，由于免疫輔助劑和藥物緩蝕劑的聯(lián)合應(yīng)用，免疫抗原的表達(dá)水平和主動(dòng)免疫反應(yīng)明顯提高。GM-CSF作為腫瘤疫苗免疫佐劑，具有刺激造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞分化和成熟的功能，此外，GM-CSF還具有增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，對(duì)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有趨化作用，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的分化和成熟[7-9]。因此，GM-CSF已在黑色素瘤、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的臨床試驗(yàn)中發(fā)揮顯著的療效[10-12]。肝癌的治療方法較多，目前公認(rèn)的最有效方法是外科切除，但其具有潛在的復(fù)發(fā)率，因此尋找更為安全的治療方法顯得尤為重要。因此，本文在此探究GM-CSF為免疫佐劑治療肝癌，為肝癌的治療提供更多的理論支持。

以往研究表明，腫瘤的發(fā)生過程與機(jī)體免疫有著緊密的關(guān)系，細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫的主要免疫應(yīng)答之一，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答尤為重要。在T細(xì)胞抗原應(yīng)答反應(yīng)中，組織相容性復(fù)合體(MHC I)類限制性的CD8+T細(xì)胞的CTL是抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一[13]。相關(guān)研究表明，CD8+T細(xì)胞通過多種細(xì)胞因子發(fā)揮溶細(xì)胞作用，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。目前的研究表明，IL-6、INF-γ、TNF-α、穿孔素、溶細(xì)胞素、脂酶等多種細(xì)胞因子和酶在溶解靶細(xì)胞中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[14-15]。因此，本實(shí)驗(yàn)在此選擇檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的表達(dá)和相關(guān)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)，探究GM-CSF分泌型肝癌細(xì)胞疫苗對(duì)移植型肝癌的作用及其可能的作用機(jī)制。

本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：與H 22肝癌細(xì)胞組和PBS對(duì)照組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗免疫小鼠后，可顯著地提高其外周血中CD8+T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平。同時(shí)，MTT法檢測(cè)GM-CSF分泌型肝癌疫苗對(duì)CTL的殺傷作用，結(jié)果表明，與H 22肝癌細(xì)胞組和PBS對(duì)照組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗可顯著地增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用。根據(jù)以上結(jié)果，由此推測(cè)，GM-CSF分泌型肝癌疫苗通過可誘導(dǎo)自體T細(xì)胞向CTL增值和分化，發(fā)揮特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，而這種功能的發(fā)揮與直接活化效應(yīng)細(xì)胞CD8+T細(xì)胞有著密切的關(guān)系。Western blot檢測(cè)了CD8+T細(xì)胞表達(dá)的INF-γ、TNF-α細(xì)胞因子，結(jié)果表明，與H 22肝癌細(xì)胞組和PBS對(duì)照組相比，GM-CSF分泌型肝癌疫苗組可顯著地提高INF-γ、TNF-α蛋白的表達(dá)。此結(jié)果表明，GM-CSF分泌型肝癌疫苗治療肝癌的作用機(jī)制可能與下調(diào)INF-γ、TNF-α蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，GM-CSF分泌型肝癌疫苗對(duì)移植型肝癌具有顯著抑制作用；其抑制作用可能與提高細(xì)胞免疫功能有關(guān)，作用機(jī)制為提高外周血中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平、提高效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用以及降低細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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(編校：王儼儼 吳茜)

Research on mechanism of GM-CSF secreting liver cancer vaccine on CTL killing activity of transplanted liver cancer mice

WU Tian-shan1,XIAOKAITI·Yibulayin1Δ,AERPATI·Maimaiti1,LI Xiang-cheng2

(1.Department of Emergency Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China； 2.Department of Clinical Medicine, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) secreting liver cancer vaccine on killing activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) of transplanted liver cancer mice and its mechanism.MethodsThere were three groups: liver cancer vaccine group (A group), liver cancer group (B group) and PBS group (C group).The transplanted liver cancer model was builded with injection of H 22 hepatoma cells, while the GM-CSF secreting liver cancer vaccine group and PBS group was builded. GM-CSF secreting liver cancer vaccine group and PBS group were establised.The levels of CD8+T cell in peripheral blood were detected by flow cytometry.The killing activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) of spleen cells was detected by MTT method.The expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (γ-INF) were detected by Western blot.ResultsThe flow cytometry results showed that, compared with B group, the levels of CD8+T cell of A group significantly increased (P<0.01).MTT results showed that, compared with B group, the killing activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) in A group significantly increased (P<0.01).Western blot results showed that, compared with B group, the expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (γ-INF) in A group significantly decreased (P<0.01). ConclusionGM-CSF secreting liver cancer vaccine can significantly inhibit the activity of H22 cell, and its possible mechanism of action may be to activated CD8+T expression, improve cytotoxic activity of CTL of spleen cells, and reduce TNF-α and γ-INF protein expression.

GM-CSF; transplanted liver cancer; secreting liver cancer vaccine; cytotoxic T lymphocytes

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170415)

吳天山，男，學(xué)士，主治醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)傷、急腹癥，E-mail：qch1821460053@163.com；肖開提·伊布拉因，通訊作者，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)傷、急腹癥，E-mail：qch1821460054@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)03-0062-03