顧鴻,田維毅,梅穎

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)針灸教研室，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，貴州 貴陽 550002；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院 中藥教研室，貴州 貴陽 550002)

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當(dāng)歸補(bǔ)血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響研究

顧鴻1,田維毅2,梅穎3

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)針灸教研室，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，貴州 貴陽 550002；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院 中藥教研室，貴州 貴陽 550002)

目的 研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響。方法 將50只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組：正常組、陽性對照組、藥物高、中、低劑量組。后肢注射嗎啡建立小鼠嗎啡成癮模型。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測量5組小鼠的紅細(xì)胞膜微粘度(erythrocyte membrane micro-viscosity，EM-MV)、紅細(xì)胞變形指數(shù)(erythrocyte deformation index，EDI)；采用郭氏法測定紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(red blood cell-immune complex rosette，RBC-ICR)、紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(red blood cell-C3b receptor rosette，RBC-C3bRR)；并觀察5組紅細(xì)胞免疫黏附促進(jìn)因子(red blood cell regulator factor enhance rate，RFER)和紅細(xì)胞免疫黏附抑制因子(red blood cell immune adherence inhibitor factor，RFIR)變化水平。結(jié)果 陽性對照組EM-MV均顯著高于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)，陽性對照組EDI顯著低于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)。藥物中劑量組和低劑量組較陽性對照組明顯RBC-ICR降低(P<0.05)，RBC-C3bRR顯著高于陽性對照組(P<0.05)；藥物中劑量組和低劑量組RFER水平顯著高于陽性對照組，RFIR顯著降低RFER(P<0.05)。結(jié)論 低劑量組和高劑量組當(dāng)歸補(bǔ)血湯提高嗎啡戒斷小鼠的紅細(xì)胞免疫功能，改善戒斷的癥狀，促進(jìn)機(jī)體的快速康復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯；嗎啡戒斷；紅細(xì)胞免疫

近年來，阿片藥物的依賴和濫用已成為全球性問題，受到社會的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[1]，當(dāng)內(nèi)源性阿片受體被腦啡肽、強(qiáng)啡肽等阿片類藥物占據(jù)時(shí)，機(jī)體就會產(chǎn)生欣快感，這也是引起藥物成癮的生理學(xué)基礎(chǔ)。由于阿片類依賴史細(xì)胞的一種適應(yīng)反應(yīng)，長期服用阿片類藥物會提高中樞抑制的敏感性，正常服用藥物會使敏感性處于潛伏狀態(tài)。當(dāng)斷藥時(shí)即表現(xiàn)出反跳性高興奮狀態(tài)，如豎尾、激惹等戒斷癥狀。大量研究顯示[1-2]藥物濫用人群的細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能均受到嚴(yán)重?fù)p害?；A(chǔ)研究顯示[3-4]，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(red blood cell-immune complex rosette，RBC-ICR)會受到阿片類藥物的毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低紅細(xì)胞膜的流動性，引起細(xì)胞膜上C3b受體數(shù)量降低，最終使機(jī)體的免疫功能下降。因此大量學(xué)者開始關(guān)注如何提高阿片類藥物戒斷后機(jī)體的免疫功能。當(dāng)歸補(bǔ)血湯源于李東桓的《內(nèi)傷辨惑論》，全方由當(dāng)歸、黃芪組成，常用于治療氣血虛弱之證，是經(jīng)典補(bǔ)血的方劑，它可以促進(jìn)生血的物質(zhì)形成，還能顯著改善血液的生理功能，臨床上已經(jīng)廣泛用于治療免疫功能低下等疾病。本研究觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對嗎啡戒斷小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇50只昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g(合格證號：scxk(黔)2002-0001)，由貴陽中醫(yī)學(xué)院動物中心提供。本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

1.2 藥品與試劑 當(dāng)歸補(bǔ)血湯(自制，濃度為1.0 g/mL)，置于4 ℃冰箱中保存待用。鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠，國藥準(zhǔn)字H20013351)；鹽酸納洛酮(北京四環(huán)制藥，H20055758)。

1.3 主要儀器 血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(成都貝斯達(dá)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)；生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠，批號H20055758)。

1.4 小鼠嗎啡依賴模型的建立 將各組小鼠籠中喂養(yǎng)4 d后，腹腔皮下注射鹽酸嗎啡，首日劑量10 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3天40 mg/kg，第4天60 mg/kg，第5天80 mg/kg。最后1次注射嗎啡后3 h，采用鹽酸納洛酮催癮，若小鼠出現(xiàn)成癮癥狀如豎尾、不停走動、流涎且達(dá)到戒斷癥狀的評分標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)定造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將50例小鼠隨機(jī)分為5組：正常組、陽性對照組、藥物高、中和低劑量組，每組10只。正常組：皮下注射與嗎啡等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)注射5 d，1周后股動脈取血0.5 mL。藥物高劑量組：最后1次注射嗎啡24 h后，灌胃給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯20 mg/kg；連續(xù)給藥7 d，1周后同正常組方法取血。藥物中劑量組灌胃給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯10 mg/kg，其余同藥物高劑量組。藥物低劑量組灌胃給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯5 mg/kg，其余同藥物高、中劑量組。陽性對照組：后肢注射鹽酸嗎啡，首日劑量10 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3天40 mg/kg，第4天60 mg/kg，第5天80 mg/kg。最后1次注射嗎啡后3 h，采用鹽酸納洛酮催癮，1周后同正常組方法取血。將各組血樣分裝入離心管(1 mL/支)中，3500 r/min，離心10min后取上清液于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo) ①采用熒光偏振法測定EM-MV，檢測方法：取1.0 mg蛋白的紅細(xì)胞膜，用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)為熒光探針測定熒光強(qiáng)度(I)，當(dāng)DPH進(jìn)入膜脂層的中烴鏈區(qū)后期介質(zhì)粘度顯著增加，導(dǎo)致順反式異構(gòu)化轉(zhuǎn)化受到抑制，當(dāng)成為全反型時(shí)可以發(fā)出熒光。微粘度越小，紅細(xì)胞膜流動性越大。采用激光衍射法測定TK；②采用郭氏法測定(RBC-CIC)、RBC-C3bRR，具體方法：取試管, 先加待測紅細(xì)胞懸液500 μL，然后加補(bǔ)體致敏酵母菌懸液500 μL， 37 ℃水浴30 min，取出后輕輕搖勻,，涂片、固定、染色、計(jì)數(shù)、換算同RBC-C3b受體花環(huán)實(shí)驗(yàn)，其百分率作為紅細(xì)胞膜上吸附免疫復(fù)合物量的指標(biāo)。C3b實(shí)驗(yàn)：取1支小試管,先加待測紅細(xì)胞懸液50 μL，然后加補(bǔ)體致敏酵母菌懸液50 μL，搖勻37 ℃ 水浴30 min，取出后輕輕搖勻，加生理鹽水100 μL, 再加0. 25%戊二醛50 μL，再搖勻，取50 μL水平涂片。吹干后用姬姆薩-瑞氏染液染色1 min,，再加少許的瑞氏緩沖液染10 min，用自來水沖洗。最后在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞中的酵母菌的花環(huán)數(shù)，并換算成百分率，作為RBC-C3b受體活性的指標(biāo)；③觀察四組RFER(RFER)和RFIR(RFIR)變化水平。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠EM-MV和變形性對比 陽性對照組EM-MV均顯著高于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細(xì)胞膜的流動性，低劑量組和高劑量組當(dāng)歸補(bǔ)血湯可有有效提高紅細(xì)胞膜流動性。陽性對照組TK顯著低于正常組、藥物中劑量組和低劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細(xì)胞的變形性，低、中劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯可有效改善藥物依賴引起的紅細(xì)胞變形性降低；而高劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯對紅細(xì)胞膜的流動性和變形性改善程度不明顯，見表1、圖1-5。

表1 5組小鼠EM-MV和TK比較Tab.1 Comparison of level of EM-MV andTK of five ±s)

△P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

圖1 各組紅細(xì)胞變形情況1.正常組；2.陽性對照組；3.藥物低劑量組；4.藥物中劑量組；5藥物高劑量組Fig.1 Changes in erythrocyte deformability of each group

2.2 5組RBC-ICR和RBC-C3bRR比較 陽性對照組小鼠RBC-ICR顯著升高，與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藥物中劑量組和低劑量組較陽性對照組顯著降低(P<0.05)。陽性對照組RBC-C3bRR較正常組顯著降低(P<0.05)，藥物中劑量組和藥物低劑量組與陽性對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而藥物1組免疫復(fù)合物花環(huán)率和RBC-C3bRR與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 5組小鼠RBC-ICR和RBC-C3bRR比較Tab.2 Comparison of level of RFER and RFIR of five ±s)

△P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

2.3 5組小鼠RFER和RFIR變化水平比較 陽性對照組小鼠RFER明顯降低，RFIR顯著升高，與正常組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性對照組相比，藥物中劑量組和低劑量組RFER水平顯著升高，RFIR顯著降低(P<0.05)；藥物高劑量組RFER和RFIR水平與陽性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 5組小鼠RFER和RFIR變化水平比較Tab.3 Comparison of level of RFER and RFIR of five ±s)

*P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

3 討論

目前已經(jīng)證實(shí)[5]，紅細(xì)胞是機(jī)體血液循環(huán)中的重要免疫細(xì)胞。紅細(xì)胞不僅可以作為氧和二氧化碳的載體，還能特異性的識別、殺滅或清除血液循環(huán)中的免疫復(fù)合物。目前研究證實(shí)[6]，紅細(xì)胞免疫在嗎啡戒斷后的免疫低下中起著重要的作用，其中最重要的是β內(nèi)啡肽。β內(nèi)啡肽對紅細(xì)胞免疫功能起到雙向調(diào)節(jié)作用，少量β內(nèi)啡肽可以提高紅細(xì)胞的免疫功能；當(dāng)β內(nèi)啡肽水平大量增加時(shí)，就會抑制紅細(xì)胞免疫功能，且這種作用可以被納洛酮阻斷[7-8]。這說明β內(nèi)啡肽是通過與細(xì)胞膜表面的阿片受體結(jié)合而起到免疫調(diào)節(jié)作用。

紅細(xì)胞具有運(yùn)載 O2和 CO2，維持能量代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能，又具有識別、黏附、殺傷抗原、清除血循環(huán)中的免疫復(fù)合物，免疫黏附細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，參與機(jī)體免疫調(diào)控，并有完整的自我調(diào)控系統(tǒng)。中醫(yī)認(rèn)為，氣血是構(gòu)成生命的基本物質(zhì)。當(dāng)氣血不足時(shí)會引起機(jī)體免疫功能低下，通過補(bǔ)益氣血可以有效提高機(jī)體對疾病的抵抗能力。本研究對嗎啡戒斷的小鼠給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對照組EM-MV均顯著高于正常組、藥物中劑量組和藥物低劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細(xì)胞膜的流動性，低、中劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯可有效提高紅細(xì)胞膜流動性。陽性對照組TK顯著低于正常組、藥物高劑量組和藥物中劑量組(P<0.05)，說明藥物依賴可以降低紅細(xì)胞的變形性，低、中劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯可有效改善藥物依賴引起的紅細(xì)胞變形性降低；而高劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯對紅細(xì)胞膜的流動性和變形性改善程度不明顯。這證實(shí)合適劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以有效改善紅細(xì)胞的功能，對紅細(xì)胞免疫功能有一定的促進(jìn)作用，而隨著劑量增大，這種促進(jìn)作用增加的趨勢并不明顯。藥物中劑量組和低劑量組較陽性對照組免疫復(fù)合物花環(huán)率顯著降低(P<0.05)，C3b受體花環(huán)率顯著高于陽性對照組(P<0.05)；藥物中劑量組和低劑量組RFER水平顯著高于陽性對照組，RFIR顯著降低(P<0.05)，這證實(shí)了5 mg/kg和10 mg/kg當(dāng)歸補(bǔ)血湯可有效增強(qiáng)紅細(xì)胞對免疫復(fù)合物的清除能力，改善紅細(xì)胞的免疫功能。而當(dāng)劑量繼續(xù)增大至20 mg/kg時(shí)，上述指標(biāo)改善程度并無提高趨勢。

綜上所述，低、中劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯提高嗎啡戒斷小鼠的紅細(xì)胞免疫功能，改善戒斷的癥狀，促進(jìn)機(jī)體的快速康復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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(編校：王冬梅)

Effect of Danggui Buxue Decoction on red cell immune function in mice with morphine abstinence syndrome

GU Hong1,TIAN Wei-yi2,MEI-Ying3

(1.Teaching and Research Section of Experimental Acupuncture, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 2. Teaching and Research Section of immunology, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 3. Department of Chinese Materia Medica, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China)

ObjectiveTo study the effect of Danggui Buxue Decoction on red cell immune function in mice with morphine abstinence syndrome.Methods50 mice were randomly divided into normal group,positive control group, high, medium, low dose group,Hindlimb injection of morphine in morphine dependent mice model was established. Erythrocyte membrane were measured in five groups of mice micro viscosity, erythrocyte deformation index; Determination of red cell immune complex rosette rate using the method (CIC), red cell C3b receptor rosette rate; and to observe the five group of regulator factor enhance rate (RFER) and immune adherence inhibitor factor (RFIR) levels.ResultsErythrocyte membrane microviscosity in model group were significantly higher than those in normal group, medium group and low group (P<0.05),red cell deformability index was lower than that of normal group, drug medium group and drug group low (P<0.05).Drug high group and medium group，immune complex rosette rate lower than in model group(P<0.05), C3b receptor rosette rate was significantly higher than that in the model group (P<0.05).ConclusionLow dose group and high dose group Danggui Buxue Decoction raises the red cell immune function in morphine withdrawal mice, improves the withdrawal symptoms, rapids rehabilitation of the body, has good clinical value.

Danggui Buxue Decoction;morphine withdrawal;red cell immun

貴州省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目([2007]1039)

顧鴻，女，碩士，講師，研究方向：中醫(yī)針灸戒毒，E-mail：guhong1212@163.com。

R245.81

A

1005-1678(2015)03-0051-03