袁志峰,許國華,任莉

(1.景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院 骨科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.上海長征醫(yī)院 脊柱外科，上海 200003；3.浙江省立同德醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 310012)

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曲古抑菌素對骨髓間充質(zhì)干細胞特化干預的體外研究

袁志峰1,許國華2,任莉3

(1.景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院 骨科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.上海長征醫(yī)院 脊柱外科，上海 200003；3.浙江省立同德醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 310012)

目的 探討曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)特化為成骨細胞的影響。方法 采用全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化大鼠MSCs，進行形態(tài)學觀察；選擇第3代MSCs定向誘導分化為成骨細胞，根據(jù)給藥濃度不同分為TSA低劑量組(0.1 μmol/L)、中劑量組(1 μmol/L)、高劑量組(10 μmol/L)，同時設立空白對照組。MTT法觀察各組對MSCs的增殖作用并繪制細胞生長曲線，檢測TSA對MSCs誘導分化為成骨細胞過程中堿性磷酸酶(alkaliphosphatase，ALP)活性的影響；RT-PCR法檢測TSA對核心結(jié)合因子α-1(corebinding factor α1，Cbfα1)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)mRNA表達水平的影響。結(jié)果 MSCs生長曲線的測定結(jié)果顯示，各組細胞生長曲線趨勢相似，與對照組相比，TSA低劑量組的生長曲線沒有顯著性變化，TSA中劑量及高劑量均顯著促進MSCs增殖(P<0.05)。與對照組相比，TSA低劑量組、中劑量組、高劑量組對MSCs誘導分化為成骨細胞過程中的第4、5、6 E均可顯著提高ALP活性(P<0.05)。與空白組相比，TSA各劑量組可以顯著提高Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達水平(P<0.05)。結(jié)論 TSA可顯著促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞特化為成骨細胞，可能是通過上調(diào)Cbfα1、bFGF、IGF-1基因的表達水平實現(xiàn)。

曲古抑菌素；骨髓間充質(zhì)干細胞；核心結(jié)合因子α-1；堿性成纖維細胞生長因子；胰島素樣生長因子-1

間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)為具有多向分化潛能的干細胞，在特定的誘導條件下，具有向成骨細胞、心肌細胞以及脂肪細胞等分化的能力，對多種疾病具有治療潛能，如骨質(zhì)疏松癥、心肌梗死、神經(jīng)性疾病等[1-2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)是一種有效的特異性組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑，參與調(diào)節(jié)多種細胞活動，如細胞分化及增殖過程中[3-4]。本研究擬在采用RT-PCR法檢測TSA對核心結(jié)合因子α-1(corebinding factor α1，Cbfα1)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-Like growth factor-1，IGF-1)mRNA表達水平，觀察TSA對MSCs特化的成骨細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，5周齡，體質(zhì)量100～120 g，動物室溫度(25±2) ℃，相對濕度(45±5)%，實驗期間大鼠自由飲水和進食，雌雄不限。由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，合格證號為：SCXK(桂)2009-0002。

1.2 試劑及儀器 L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone公司)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗血酸、TSA、鏈霉素青霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(均購自Sigma)；PNPP顯色劑、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(均購自Wako公司)；聚合酶鏈引物設計、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒(均購自TaKaRa公司)。實時熒光定量PCR儀(購自ABI公司)；CO2培養(yǎng)箱(購自Shellab公司)；倒置相差顯微鏡(購自Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 MSCs的原代分離、培養(yǎng)、傳代：取5周齡SD大鼠，脫頸椎處死動物，75%的酒精浸泡10 min消毒，于超凈工作臺中分離脛骨及股骨，PBS反復沖洗3次。切取骨兩端，露出骨髓腔，用含有青霉素及鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，反復吹打，得到骨髓單細胞混懸液，1000 r/min低溫快速離心5 min，棄上清。用含有青霉素及鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀細胞，以細胞濃度為1×109個/L接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的第3天首次換液，以后每3 d換液1次。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底至細胞融合為單層細胞，密度約為80%左右時，用0.25%胰酶進行消化，按照1:2的比例進行傳代培養(yǎng)[5]。

1.3.2 MSCs形態(tài)學觀察：細胞培養(yǎng)的每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化及生長狀況并拍照保存。

1.3.3 藥物處理及實驗分組：TSA溶于磷酸鹽緩沖液(pH7.4)和二甲基亞砜中，置于-20 ℃冰箱保存。實驗共分為4組：TSA低劑量組(0.1 μmol/L)、中劑量組(1 μmol/L)、高劑量組(10 μmol/L)，同時設立空白對照組(僅含磷酸鹽緩沖液和二甲基亞砜)。

1.3.4 MSCs生長曲線的測定：將生長狀態(tài)良好的第2代MSCs以密度為5×103個接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、CO2飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按上述TSA劑量分別加入各組中每天取1板進行MTT檢測，連續(xù)1周。MTT檢測時應用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度值，選擇波長為492 nm。按照檢測結(jié)果，以光吸收值為縱坐標，以細胞生長天數(shù)為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.3.5 MSCs體外定向誘導分化為成骨細胞：MSCs培養(yǎng)到第3代，以1×109個/L的濃度接種于6孔培養(yǎng)板上，待細胞貼壁生長至密度為80%左右時，各孔加入成骨細胞誘導劑：1 mmol/L地塞米松、1 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mmol/L抗血酸，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入誘導液后每3 d換液1次，并設不加誘導劑的MSCs孔作為對照組，每組設8個復孔。

1.3.6 成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性測定：在各組MSCs誘導分化給藥過程的第4、5、6天時，用PBS洗滌細胞2次，用0.04 g/L的蛋白酶E進行消化，并收集細胞。進行細胞內(nèi)ALP活性的測定，測定時用的9×10-2mol/L PNPP，其中反應液的pH值為10.3，置于37 ℃反應30 min，加0.1mol/L NaOH終止液終止反應，于400 nm處測定吸光度，同時用考馬斯亮藍法檢測細胞蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 RT-PCR法檢測TSA對成骨細胞Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達水平的影響：MSCs體外定向誘導分化為成骨細胞后，按上述TSA劑量分組給藥，給藥后共培養(yǎng)5 d進行RT-PCR檢測試驗。具體步驟：①細胞中總RNA提取，采用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度法測定總RNA濃度，選擇A260/A280在1.8～2.0間的樣；②反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有樣的總RNA的濃度調(diào)整至500 mg/L，取2 μL進行逆轉(zhuǎn)錄。所有操作嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒步驟進行，將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆茫虎跴CR反應擴增反應，體系為20 μL，包括：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL；正向引物(10 μmol/L) 0.8 μL；反向引物(10 μmol/L) 0.8 μL；ROX 參比染料(50×) 0.4 μL；cDNA模版2 μL；dH2O 6 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，進行40個循環(huán)。每個循環(huán)的延伸末收集熒光信號軟件自動計算出待測樣本中管家基因和目的基因的準確含量，采用2-△△Ct計算相對表達量。所有引物由上海生工公司設計合成，見表1。

表1 各引物序列Tab.1 The primer sequence

2 結(jié)果

2.1 MSCs細胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下可見MSCs為圓形，大小不一，培養(yǎng)24 h后，開始貼壁，呈圓形，梭形，或多角形；5 d后，可見放射狀排列的細胞群，多為梭形，胞漿豐富，胞核大，核仁清晰。見圖1。

圖1 MSCs細胞形態(tài)觀察圖(×1000)Fig.1 MSCs cell morphological observation(×1000)

2.2 MSCs生長曲線的測定 各組細胞生長曲線趨勢相似，在MSCs接種給藥第1、2天為細胞潛伏適應期，而3～6 d曲線呈直線上升，則為MSCs的對數(shù)生長期。第7天后曲線上升趨勢逐漸變得平緩，MSCs增殖速度明顯減慢，進入平臺期。與對照組相比，TSA低劑量組的生長曲線沒有顯著性變化，TSA中劑量及高劑量均有顯著升高MSCs生長曲線的趨勢，有效增強了MSCs的擴增能力(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同組的MSCs生長曲線*P<0.05，與空白對照組比較Fig.2 Comparison of growth curve of MSCs in each group*P<0.05，compared with control group

2.3 成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)測定細胞活性 與對照組相比，TSA低劑量組(0.1 μmol/L)、中劑量組(1 μmol/L)、高劑量組(10 μmol/L)對MSCs誘導分化為成骨細胞過程中的第4、5、6天均可顯著提高ALP活性(P<0.05)。見表2。

組別TSA濃度4d5d6d空白組—2.218±0.3213.076±0.2223.339±0.105TSA低劑量組0.1μmol/L2.552±0.255*3.181±0.128*3.588±0.133*TSA中劑量組1μmol/L2.887±0.312**3.322±0.125**3.712±0.128**TSA高劑量組10μmol/L3.081±0.343**3.574±0.211**3.978±0.213**

*P<0.05，**P<0.01，與空白對照組比較，compared with control group

2.4 RT-PCR法檢測TSA對成骨細胞Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達水平的影響 RT-PCR法檢測TSA對成骨細胞影響，結(jié)果表明，與空白組相比，TSA各劑量組可以顯著提高Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

組別TSA濃度Cbfα1bFGFIGF-1空白組—2.786±0.3442.776±0.2532.329±0.176TSA低劑量組0.1μmol/L3.187±0.322*3.081±0.229*2.581±0.123*TSA中劑量組1μmol/L3.552±0.275**3.322±0.175**2.752±0.118**TSA高劑量組10μmol/L3.778±0.341**3.573±0.247**2.978±0.242**

*P<0.05，**P<0.01，與空白對照組比較，compared with control group

3 討論

MSCs作為成骨細胞的祖細胞，其分化成為成骨細胞的能力直接影響著骨質(zhì)疏松或者骨折的愈合能力，因此近年來關于促進其分化為成骨細胞的藥物得到了醫(yī)藥界的廣泛關注，也是骨科領域的研究熱點。TSA最初作為抗真菌藥物被人們所認識，并很快得到了廣泛的應用[6]。但最近研究還發(fā)現(xiàn)TSA是一種有效的、并特異性作用于組蛋白去乙?；?，它選擇性抑制Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白去乙酰化酶，但對Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶并無抑制作用[7-8]。TSA作為組蛋白去乙酰化酶的抑制劑，是通過阻斷組蛋白去乙?；傅淖饔猛?，發(fā)揮其對去乙酰化的抑制功能，從而起到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活過程的乙?；c去乙酰化動態(tài)平衡作用[9-10]，目前較多研究將其用于各種腫瘤疾病的治療過程中。近期研究發(fā)現(xiàn)TSA參與到調(diào)節(jié)多種不同的細胞活動中，如細胞分化和細胞增殖[11]。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，TSA顯著提高成骨細胞堿性磷酸酶活性，RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，TSA各劑量可以顯著提高成骨細胞中Cbfα1、bFGF及IGF-1mRNA的表達水平，而這些細胞因子與成骨細胞分化有著密切的聯(lián)系。Cbfα1為脊椎動物成骨細胞分化的關鍵調(diào)節(jié)因子，通過與成骨細胞上的特異順式作用元件結(jié)合從而激活骨鈣素的表達水平，調(diào)節(jié)著大多數(shù)關鍵成骨細胞基因的表達水平，控制分化成骨細胞的成骨速率以及調(diào)節(jié)骨鈣素基因(EK5)表達，從而在成骨細胞分化過程中起到至關重要的作用[12-13]。bFGF通過多種信號通路調(diào)控成骨細胞的數(shù)量及其活動，對骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[14]。IGF-1是評價治療骨質(zhì)疏松癥藥物的重要指標，它可促進成骨細胞的增殖和骨基質(zhì)的合成，是骨中含量豐富的細胞因子。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，與對照組相比，TSA可顯著促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞特化為成骨細胞，可能是通過上調(diào)Cbfα1、bFGF、IGF-1基因的表達水平而實現(xiàn)的，提示TSA可開發(fā)為治療骨質(zhì)疏松癥以及促進骨愈合的新藥，但其具體作用機制還有待進一步研究。

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(編校：吳茜 王儼儼)

Intervention effects of trichostatin A on specilization of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

YUAN Zhi-feng1,XU Guo-hua2,REN Li3

(1.Department of Orthopedics, The First People’s Hospital of Jingdezhen City, Jingdezhen 333000, China；2 .Department of Spine Surgery, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai 200003, China; 3. Department of Orthopedics, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

ObjectiveTo explore the intervention effects of trichostatin A (TSA) on specialization of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs).MethodsThe rat MSCs were isolated,cultured and purified by the whole bone marrow adherent method in vitro, with morphological observation. The third generation of MSCs were selected, directional induced to osteoblasts, and divided into the TSA low dose group (0.1 μmol/L), middle dose group (1 μmol/L), the high dose group (10 μmol/L) according to different drug concentrations, seting up blank control group at the same time. MSCs proliferation and cell growth curve of each group were drawn by MMT, the activity of alkaliphosphatase (ALP) was detected, and the levels of corebinding factor α1 (Cbfα1), basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-like growth factors-1 (IGF-1) mRNA were detected by RT-PCR. Results The trend of MSCs growth curves in each groups were similar, compared with control group, the growth curve of TSA low dose group had no significant change, the TSA middle dose and high dose significantly promoted the proliferation of MSCs (P<0.05). Compared with control group, ALP activity of TSA low-, middle- and high-dose group were significantly higher at 4th,5th,6th(P<0.05). The expression levels of Cbfα1, bFGF and IGF-1mRNA were significantly higher than those of control group, respectively (P<0.05).ConclusionTSA can significantly promote the rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblast, which is possibly associated with up-regulation of Cbfα1, bFGF and IGF-1mRNA level.

trichostatin A;MSCs;corebinding factor α1;basic fibroblast growth factor;insulin-like growth factor-1

2011年浙江省衛(wèi)生科技計劃項目(2011KYA030)

袁志峰，男，主任醫(yī)師，學士，研究方向：骨科臨床及基礎，E-mail：gzf13979850246@163.com。

R34

A

1005-1678(2015)03-0039-03