陳東亞,李舸遠(yuǎn),俞萍,呂中明,楊明晶,梁婕Δ

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心 毒理與功能評(píng)價(jià)所，江蘇 南京 210009；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院化學(xué)室，江蘇 南京 210008)

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復(fù)方鹿角膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO和淋巴細(xì)胞增殖的影響

陳東亞1,李舸遠(yuǎn)2,俞萍1,呂中明1,楊明晶1,梁婕1Δ

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心 毒理與功能評(píng)價(jià)所，江蘇 南京 210009；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院化學(xué)室，江蘇 南京 210008)

目的 研究復(fù)方鹿角膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO分泌、淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法 ICR小鼠隨機(jī)分為4組，實(shí)驗(yàn)組小鼠分別灌胃給予233、467、1400 mg/kg的復(fù)方鹿角膠囊，對(duì)照組以等容積純凈水灌胃，1次/天，連續(xù)30 d。處死動(dòng)物，Griess法測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞NO含量；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定由刀豆蛋白 (concanavalin A，Con A)活化的淋巴細(xì)胞增殖周期；熒光染色法測(cè)定經(jīng)ConA和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化的淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)果 與溶劑對(duì)照組相比，233、467、1400 mg/kg劑量組均促進(jìn)經(jīng)LPS活化的腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO(P<0.01)；467、1400 mg/kg劑量組比溶劑對(duì)照組有更多的淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期(P<0.05)；經(jīng)ConA刺激8 min，各劑量組Ca2+濃度均高于對(duì)照組，其中233、1400 mg/kg劑量組小鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)LPS刺激1、4、8 min，各劑量組Ca2+濃度均高于對(duì)照組，其中233 mg/kg劑量組淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其以1 min時(shí)效果最為明顯(P<0.01)。結(jié)論 復(fù)方鹿角膠囊能促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO，促進(jìn)活化的淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期及淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)力。

復(fù)方鹿角膠囊；巨噬細(xì)胞；NO；淋巴細(xì)胞；Ca2+

傳統(tǒng)中藥材丹參、赤芍、白芷能提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)活性的研究常見報(bào)道[1-3]，鹿角含有豐富的活性物質(zhì)并具有廣泛的藥理活性，目前可見報(bào)道其可以預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗衰老和疏通乳腺[4-6]，本實(shí)驗(yàn)使用的復(fù)方鹿角膠囊的主要成分為鹿角粉，配以丹參提取物、赤芍提取物和白芷提取物，其是否具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力目前未見報(bào)道。機(jī)體淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)中重要的參與細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)從復(fù)方鹿角膠囊對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO、對(duì)淋巴細(xì)胞增殖周期和Ca2+的影響這個(gè)角度出發(fā)，探討其是否具有提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)活性并為保健食品增強(qiáng)免疫力功能檢測(cè)新方法的探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)ICR小鼠(雌性，5～6周齡，18～22 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002號(hào)]；全部動(dòng)物均給予滅菌鼠飼料和滅菌水，滅菌鼠飼料來源及合格證號(hào)：蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技服務(wù)有限公司，蘇E飼生字(2009)05032號(hào)。

1.1.2 主要試劑和儀器復(fù)方鹿角膠囊由某保健品企業(yè)提供；刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)、碘化丙碇(propidium iodide，PI)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Fluo-4/AM購(gòu)自日本DoJinDo公司；Griess試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；RPMI1640完全培養(yǎng)基，Hank’s液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；無(wú)支原體新生小牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；流式細(xì)胞儀為BD Accuri?C6購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：雌性小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。實(shí)驗(yàn)設(shè)為溶劑對(duì)照組，低劑量組(233 mg/kg)，中劑量組(467 mg/kg)，高劑量組(1400 mg/kg)，經(jīng)口灌胃給予小鼠，灌胃容積為20 mL/kg，溶劑對(duì)照組以等容積純凈水灌胃，連續(xù)灌胃30 d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在LPS刺激后NO的分泌情況的檢測(cè)：頸髓脫臼處死小鼠，腹腔注射5 mL RPMI1640完全培養(yǎng)基，輕揉腹部2 min，吸取腹腔內(nèi)含有巨噬細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，每孔1 mL細(xì)胞懸液接種于24孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜，此時(shí)巨噬細(xì)胞貼于孔底，輕輕吸除培養(yǎng)液后，再用RPMI1640完全培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，加入終濃度為10 μg/mL的LPS刺激24 h，按照Griess試劑盒說明書操作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測(cè)試驗(yàn)孔的OD值。

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞的制備：頸髓脫臼處死小鼠，無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10 min(1500 r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于1 mL的完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)。

1.2.4 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響：取1.2.3中獲取的脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，每孔1 mL加入24孔培養(yǎng)板，每孔加75 μLConA(相當(dāng)于7.5 μg/mL)，于72 h收集細(xì)胞，1500 r/min離心15 min，細(xì)胞沉淀用70%冰乙醇固定，4 ℃冰箱放置12 h以上。固定后的細(xì)胞用Hank’s液洗2遍，加入500 μL PI染液(50 μg/mL)，混勻后于4 ℃避光放置1 h，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，計(jì)數(shù)8000個(gè)淋巴細(xì)胞，重復(fù)4次。

1.2.5 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響：取1.2.3中獲取的脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，同一細(xì)胞懸液分別加入24孔板的2個(gè)孔，每孔1 mL，每孔加入5 μL Fluo 4-AM染液(相當(dāng)于5 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min，用Hank’s液洗滌細(xì)胞(2500r/min，10 min)3遍，1 mLHank’s液重懸細(xì)胞，分別加入終質(zhì)量濃度4.5 μg/mLConA，20 μg/mL LPS，在加入有絲分裂原前4 min，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度F值，激發(fā)波長(zhǎng)494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)516 nm，加入有絲分裂原后在1、4、8 min分別測(cè)定F值，然后加10%Tritonx-100，劑量為10 μL/孔，以破壞細(xì)胞膜測(cè)定最大熒光值(Fmax)，再加300mmol/LEGTA，每孔200 μL，絡(luò)合全部的Ca2+以測(cè)定最小熒光值(Fmin)；另外用1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照測(cè)定自身熒光值。Ca2+濃度的計(jì)算公式為：[Ca2+]i=Kd(F-Fmin/Fmax-F),Kd為染料與Ca2+的解離常數(shù)，Kd=360 nmol/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 獲取的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)用FlowJo7.6.1軟件分析，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)LPS刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO分泌的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=144.28x-8.3219，R2=0.9992，其中x為吸光值，y為NO含量( μmol/L),將實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的吸光值代入該方程，得到相應(yīng)的NO量?？梢妱┝拷M的NO濃度高于溶劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)LPS刺激后腹腔巨噬細(xì)胞NO分泌的影響±s，n=6)Tab.1 Effects of Compound Antler capsule on NO secretion of mice macrophages stimulated by LPS for ±s，n=6)

*P<0.01，與對(duì)照組相比，compared with control group

2.2 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響 淋巴細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定，得圖1結(jié)果，圖形結(jié)果經(jīng)FlowJo軟件分析表明，ConA刺激72h后，劑量組與溶劑對(duì)照組相比，更多的淋巴細(xì)胞進(jìn)入S、G2/M期，其中467 mg/kg劑量組有(22.07±1.89)%的細(xì)胞進(jìn)入G2/M期(P<0.05)，1400 mg/kg劑量組有(22.78±3.36)%的細(xì)胞進(jìn)入S期(P<0.05)，見表2。

組別細(xì)胞周期百分比(%)G0/G1SG2/M對(duì)照組+ConA63.86±1.30 16.51±2.11 17.97±1.93 233mg/kg劑量組+ConA61.95±1.5717.59±0.6218.48±0.82467mg/kg劑量組+ConA59.45±4.2116.62±1.9822.07±1.89*1400mg/kg劑量組+ConA57.67±3.93*22.78±3.36*18.53±1.38

*P<0.05，與對(duì)照組相比，compared with control group

2.3 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響 經(jīng)Fluo 4-AM染色，結(jié)果顯示各劑量組在加有絲分裂原刺激前4 min，劑量組淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度高于溶劑對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，加ConA8 min后，233、1400 mg/kg劑量組胞內(nèi)Ca2+濃度高于溶劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3，加LPS后1 min起，233 mg/kg劑量組的Ca2+濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)ConA激活的小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響±s，n=6)Tab.3 Effects of Compound Antler capsule on[Ca2+]i of activated mice spleen lymphocytes by ±s，n=6)

*P<0.05，與對(duì)照組相比，compared with control group

表4 復(fù)方鹿角膠囊對(duì)LPS激活的小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響Tab.4 Effects of Compound Antler capsule on[Ca2+]i of activated mice spleen lymphocytes by ±s，n=6)

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比，compared with control group

3 討論

增強(qiáng)免疫力功能近年來一直是保健食品研究的熱點(diǎn)，每年都有大量的保健食品提出申報(bào)具有該功能。本實(shí)驗(yàn)室每年承擔(dān)著大量保健食品的安全性及功能評(píng)價(jià)工作，本研究在常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目以外，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討了該保健食品增強(qiáng)免疫力的功能的可能機(jī)制，也為增強(qiáng)免疫力功能檢測(cè)新方法的探索提供參考。

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要成員之一，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中起著吞噬、抗原提呈和分泌多種活性介質(zhì)的作用。巨噬細(xì)胞通過反應(yīng)性氮中間物作用系統(tǒng)產(chǎn)生NO，從而發(fā)揮殺滅微生物及癌細(xì)胞的作用，隨著NO的增加，巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬功能[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方鹿角膠囊使活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO濃度高于溶劑對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明該膠囊能提高巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，儲(chǔ)存著大量的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞的增殖能力直接反映了機(jī)體免疫力水平。在《保健食品評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中，增強(qiáng)免疫力功能檢測(cè)項(xiàng)目中有一項(xiàng)就是檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞的增殖需要經(jīng)過一系列的環(huán)節(jié)，如DNA復(fù)制、有絲分裂等細(xì)胞周期才能增殖，因此細(xì)胞是否增殖與細(xì)胞周期分布密切相關(guān)[10]。T淋巴細(xì)胞在相關(guān)淋巴因子和周期相關(guān)蛋白的作用下從G0/G1靜息期過渡到S期，最后進(jìn)入G2/M分裂期，增殖周期的變化，能直接反映機(jī)體免疫功能[11]。本實(shí)驗(yàn)采用PI染色，流式細(xì)胞術(shù)觀察復(fù)方鹿角膠囊對(duì)淋巴周期的影響，發(fā)現(xiàn)該膠囊能促進(jìn)淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，起到促淋巴細(xì)胞增殖的作用。

Ca2+是細(xì)胞增殖活化過程中必不可少的離子，淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為淋巴細(xì)胞激活、增殖過程中的信使分子，在傳遞抗原等外界分子的刺激、啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及其后續(xù)過程中起著重要作用[12]。ConA和LPS能分別激活T、B淋巴細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[13-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方鹿角膠囊能增加靜息淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并能進(jìn)一步增加經(jīng)ConA和LPS活化的淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。這表明復(fù)方鹿角膠囊對(duì)活化淋巴細(xì)胞有促進(jìn)作用。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果中LPS刺激的低劑量組Ca2+濃度在1 min左右即有明顯升高，ConA刺激組低劑量和高劑量組在1 min左右Ca2+濃度卻有所下降，4 min開始升高，這可能與激活不同的鈣離子通道有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

以上實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)方鹿角膠囊能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，機(jī)制為通過升高淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期，G2/M期，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，該膠囊還能提高巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO能力，從而提高機(jī)體巨噬細(xì)胞吞噬能力。筆者認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果結(jié)合《保健食品評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中的檢測(cè)項(xiàng)目，能更全面的反映保健食品是否具有增強(qiáng)免疫力功能。

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(編校：譚玲)

Effects of Compound Antler capsule on NO secretion of macrophages and proliferation of T lymphocytes in mouse

CHEN Dong-ya1,LI Ge-yuan2,YU Ping1,LV Zhong-ming1,YANG Ming-jing1,LIANG Jie1

(1.Institute of Toxicology and Functional Assessment, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China; 2.Chemical Formula, Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China)

ObjectiveTo explore the effects of Compound Antler capsule on the NO secretion of macrophages, cell cycle and[Ca2+]iof mouse T lymphocytes.MethodsICR mice were randomly divided into 4 groups: experimental groups were respectively given Compound Antler capsule 233, 467, 1400 mg/kg via intragastric administration once a day and the control group were given the same volume of water for 30 days.NO concentration of mouse peritoneal macrophages was measured by Griess assay.The cell cycle distribution of activated mouse spleen lymphocytes was measured by flow cytometry.Fluorescent probe Fluo 4-AM was used to mark Ca2+in lymphocytes, and the changes of its fluorescence intensity were observed with the multiscan spectrum.ResultsThe result showed that NO concentration in experimental groups was higher than that in control group (P<0.01).More activated spleen lymphocytes of 467, 1400 mg/kg dose groups were entried into S and G2/M phase than control group (P<0.05).After activated by ConA for 8 min, the intracellular[Ca2+]iin mouse spleen lymphocytes of 233, 1400 mg/kg dose group was higher than that of control group, respectively (P<0.05).After activated by LPS for 1, 4, 8 min, the[Ca2+]iin mouse spleen lymphocytes of 233 mg/kg dose group was higher than that of control group, especially at 1 min(P<0.01).ConclusionCompound Antler capsule can improve NO secretion of macrophages and facilitate the entry of mouse spleen lymphocytes from the G0/G1 into the S phase.It also can increase the[Ca2+]iof activated lymphocytes to promote their proliferation.Thus Compound Antler capsule can improve the immune regulating ability.

Compound Antler capsule; macrophages; NO; lymphocytes; Ca2+

陳東亞，女，碩士，主管技師，研究方向：保健食品安全性及功能評(píng)價(jià)，E-mail：yadd522@163.com；梁婕，通訊作者，女，碩士，主管醫(yī)師，研究方向：保健食品安全性及功能評(píng)價(jià)，E-mail：70641911@qq.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)03-0018-03