儲(chǔ)倩雯，李偉秋，魯詩(shī)史，黃丹梅，張艷美Δ

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理教研室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分析細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；3. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥劑科，廣東 汕頭 515041)

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利用低氧/厭氧工作站建立H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的探討

儲(chǔ)倩雯1，李偉秋2，魯詩(shī)史3，黃丹梅1，張艷美1Δ

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理教研室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分析細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；3. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥劑科，廣東 汕頭 515041)

目的 利用低氧/厭氧工作站，結(jié)合不同的缺氧條件，探討建立H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型的最佳方法。方法 缺氧時(shí)將H9c2細(xì)胞置于低氧/厭氧工作站中，分別以完全培養(yǎng)基，無(wú)糖培養(yǎng)基和酸性缺氧液培養(yǎng)1、2、4、6、8 h，缺氧后換用完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中按常規(guī)條件培養(yǎng)1 h。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生存率，倒置顯微鏡下觀察H9c2細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，缺氧時(shí)以完全培養(yǎng)基和無(wú)糖培養(yǎng)基處理的H9c2細(xì)胞H/R后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量和細(xì)胞存活率隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯改變，且倒置顯微鏡下未觀察到明顯的形態(tài)變化。缺氧時(shí)以酸性缺氧液處理的H9c2細(xì)胞，隨H/R時(shí)程的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量不斷增加(P<0.01)，且細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.01)，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞H:1 h/R:1 h后開(kāi)始出現(xiàn)部分細(xì)胞皺縮，少量壞死細(xì)胞漂浮，隨時(shí)間延長(zhǎng)損傷加重；缺氧8 h后，細(xì)胞皺縮成圓形，大量壞死細(xì)胞漂浮，復(fù)氧1 h后可見(jiàn)細(xì)胞膜表面不平滑，復(fù)氧液中仍有少量壞死細(xì)胞漂浮。結(jié)論 采用低氧/厭氧工作站，并結(jié)合酸性缺氧液，可成功建立重現(xiàn)性非常好的H9c2細(xì)胞H/R模型。

低氧/厭氧工作站；H9c2細(xì)胞；缺氧復(fù)氧模型

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)損傷是心臟缺血性疾病和心臟外科手術(shù)后常見(jiàn)的一種病理生理現(xiàn)象。體外心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型一直被廣泛應(yīng)用于心臟I/R損傷的研究，對(duì)于探討I/R損傷的分子機(jī)制具有重要的意義。但國(guó)內(nèi)外建立的H/R細(xì)胞模型沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前常用的方法主要有：混合氣體培養(yǎng)法、模擬缺氧/再灌注液培養(yǎng)法、氮?dú)怙柡团囵B(yǎng)基法、液體石蠟覆蓋法等單純物理性模型[1]。而化學(xué)模型建立方法主要是利用氧清除劑二亞硫酸鈉和氯化鈷[2-3]。這些方法都存在一些缺點(diǎn)，如操作復(fù)雜，無(wú)法準(zhǔn)確地控制缺氧過(guò)程的氧分壓，缺氧條件的重復(fù)性差等。探尋一個(gè)穩(wěn)定，可靠，便于操作的H/R損傷的細(xì)胞模型，將為研究心臟I/R損傷提供一個(gè)可靠的平臺(tái)。來(lái)源于大鼠胚胎期心室的H9c2細(xì)胞株被用于本實(shí)驗(yàn)中，該細(xì)胞株保持著心肌細(xì)胞的多種特性，被廣泛應(yīng)用于心臟疾病的體外研究中。本研究利用新購(gòu)置的低氧/厭氧工作站，結(jié)合不同的缺氧培養(yǎng)條件，以心肌I/R最重要的病理生理改變之一—活性氧(reactive oxygen species，ROS)[4]作為評(píng)判模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)，探討建立H9c2細(xì)胞H/R模型的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 H9c2細(xì)胞 (ATCC公司，美國(guó))、胎牛血清(Biowest公司，法國(guó))、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，2′，7′-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma公司，美國(guó))，噻唑藍(lán)(MTT)(Amersco公司，美國(guó))。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。低氧/厭氧工作站Invivo2 400(Ruskinn公司，英國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)，倒置相差顯微鏡(Nilkon公司，日本)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國(guó))，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國(guó))，低溫高速離心機(jī)(Heraeus公司，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)：將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中(同時(shí)含有100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2天換液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)消化傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及H/R模型建立：將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、完全培養(yǎng)基處理H/R模型組、無(wú)糖培養(yǎng)基處理H/R模型組以及酸性缺氧液處理H/R模型組，除對(duì)照組外，各不同缺氧液處理的H/R模型組分別設(shè)定5個(gè)H/R時(shí)程(H:1 h/R:1 h，H:2 h/R:1 h，H:4 h/R:1 h，H:6 h/R:1 h，H:8 h/R:1 h)。

缺氧時(shí)各H/R組分別換用完全培養(yǎng)基、無(wú)糖培養(yǎng)基和酸性缺氧液，置于低氧/厭氧工作站中(1%O2，5%CO2，94%N2，37 ℃)，缺氧結(jié)束后均換用完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)1 h。對(duì)照組則于復(fù)氧前換用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的酸性缺氧液配方為NaCl：8.0064 g，KCl：0.8946 g，MgCl2：0.0467 g，CaCl2：0.0999 g，HEPES：0.953 g，Na lactate：3.735 mL，加水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至6.2[5]。在超凈臺(tái)內(nèi)用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：將H9c2細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種于96板中，8孔/組，取平均值作為一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)24 h后，按上述實(shí)驗(yàn)分組及模型建立方法處理細(xì)胞。待復(fù)氧結(jié)束后，吸干培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含10%MTT(5 mg/mL)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。吸干培養(yǎng)基，每孔加入200 μL的DMSO，震搖15 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度：將H9c2細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，按上述實(shí)驗(yàn)分組及模型建立方法處理細(xì)胞。復(fù)氧結(jié)束后，倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，每皿加0.125%胰酶消化1 min，棄胰酶，各加1 mL含血清DMEM中止消化，收集細(xì)胞于1.5 mL 離心管中；離心，棄上清，用無(wú)血清DMEM清洗一次，各加入1 mL含10 μM DCFH-DA熒光探針的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中(37 ℃，5%CO2)避光孵育30 min，每5 min上下顛倒震蕩一次。用PBS清洗3次，每管加入500 μL PBS重懸。于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，以其平均熒光強(qiáng)度(mean flourscence indensity，MFI)反映各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化：待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，按上述實(shí)驗(yàn)分組及模型建立方法處理細(xì)胞。分別在缺氧和復(fù)氧結(jié)束后，倒置顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，分別記錄對(duì)照組，完全培養(yǎng)基、無(wú)糖培養(yǎng)基以及酸性缺氧液處理下的細(xì)胞 H:8 h/R:1 h組的形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，完全培養(yǎng)基和無(wú)糖培養(yǎng)基處理的各時(shí)程H/R組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酸性缺氧液處理的H/R模型組的細(xì)胞存活率隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。見(jiàn)表1。

表1 MTT法測(cè)定不同缺氧液處理的細(xì)胞的存活率變化Tab.1 The cell viability was detected by MTT assay under different hypoxic solution(±s，n=4)

*P<0.01，與對(duì)照相比，compared with control group；#P<0.05，與H:1 h/R:1 h相比，compared with H:1 h/R:1 h group；ΔP<0.05，與H:2 h/R:1 h相比，compared with H:2 h/R:1 h group

2.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平 各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化如表2所示。以對(duì)照組ROS的MFI為1，完全培養(yǎng)基處理的各時(shí)程H/R組細(xì)胞內(nèi)ROS的MFI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以對(duì)照組ROS的MFI為1，無(wú)糖培養(yǎng)基處理的各時(shí)程H/R組細(xì)胞H:4 h/R:1 h 與H:1 h/R:1 h 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H:4 h/R:1 h與H:1 h/R:1 h相比，ROS水平增加約1.50倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以對(duì)照組ROS的MFI為1，各酸性缺氧液處理的H/R模型組的MFI與對(duì)照組相比，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，即細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.0001)，H:4/R:1 h起，細(xì)胞內(nèi)ROS水平已是對(duì)照組的約2.57倍，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈遞增趨勢(shì)，H:8 h/R:1 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平是對(duì)照組的3.31倍。說(shuō)明低氧/厭氧工作站結(jié)合使用酸性缺氧液可使細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加。見(jiàn)表2，圖2。

表2 流式細(xì)胞儀法測(cè)定不同缺氧液處理的細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化Tab. 2 The level of ROS was measured by flow cytometry under different hypoxic solution (±s，n=4)

*P<0.01，與對(duì)照相比，compared with control group；#P<0.05，與H:1 h/R:1 h相比，compared with H:1 h/R:1 h group；ΔP<0.05，與H:2 h/R:1 h相比，compared with H:2 h/R:1 h group

圖2 酸性缺氧液處理的細(xì)胞內(nèi) ROS水平變化的流式細(xì)胞儀原圖Fig.2 ROS level detected by flow cytometry under acidic hypoxic solution

2.3 倒置熒光顯微下觀察細(xì)胞形態(tài)變化 對(duì)照組細(xì)胞，呈梭形，折光率好，細(xì)胞膜表面光滑。缺氧時(shí)以完全培養(yǎng)基和無(wú)糖培養(yǎng)基處理的細(xì)胞H:8 h/R:1 h后，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變。以酸性缺氧液處理的細(xì)胞缺氧1 h后，部分細(xì)胞皺縮，體積變小，有少量壞死細(xì)胞漂浮，換復(fù)氧液的過(guò)程中漂浮的壞死細(xì)胞隨缺氧液一起被棄去，復(fù)氧1 h后，又見(jiàn)少量壞死細(xì)胞漂浮。隨著缺氧的時(shí)間延長(zhǎng)，皺縮的細(xì)胞、漂浮的壞死細(xì)胞逐漸增多。缺氧8 h后，可見(jiàn)大部分細(xì)胞均皺縮成圓形，復(fù)氧1 h后可見(jiàn)細(xì)胞體積相對(duì)于缺氧前更小，部分壞死細(xì)胞漂浮，細(xì)胞膜表面不光滑。見(jiàn)圖3。

圖3 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞H/R后形態(tài)變化(×100)A：對(duì)照組，B：完全培養(yǎng)基處理下的細(xì)胞H:8 h/R:1 h組，C：無(wú)糖培養(yǎng)基處理下的細(xì)胞H:8 h/R:1 h組，D：酸性缺氧液處理下的細(xì)胞 H:8 h/R:1 h組Fig.3 The cellular morphology under inverted microscope after H/R(×100)A：control group，B：H:8 h/R:1 h group treated by complete medium，C：H:8 h/R:1 h group treated by glucose-free DMEM，D：H:8 h/R:1 h group treated by acidic hypoxic solution

3 討論

低氧/厭氧工作站是本實(shí)驗(yàn)室新近購(gòu)置的一臺(tái)貴重儀器，其可以精確控制氧分壓，精確度達(dá)0.1%，同時(shí)可準(zhǔn)確控制二氧化碳濃度、溫度、濕度、pH值等參數(shù)，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單。在心肌I/R的體外研究中，大多使用自制缺氧盒[6]，厭氧袋[7]等，利用其構(gòu)建細(xì)胞H/R模型時(shí)O2濃度，CO2濃度難以精確控制，低氧/厭氧工作站可以解決上述問(wèn)題，降低裸手操作過(guò)程中造成的實(shí)驗(yàn)誤差，使H/R模型更加穩(wěn)定。由于低氧/厭氧工作站更廣泛應(yīng)用于為厭氧菌提供厭氧氣體環(huán)境，利用該設(shè)備制作H/R模型時(shí)，是否需要配合其他實(shí)驗(yàn)條件，尚不清楚。

I/R的機(jī)制目前尚未完全闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為I/R發(fā)生的基礎(chǔ)是能量代謝障礙[8]。在構(gòu)建H/R損傷模型時(shí)常常采用斷氧及斷糖兩種方式，后者包括使用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基[9]、無(wú)糖Hanks液[10]，缺血緩沖液[11]等。研究表明，細(xì)胞內(nèi)的糖代謝途徑很大程度上受供氧的影響，缺氧時(shí)，細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行糖酵解生成乳酸，導(dǎo)致酸中毒。缺血后細(xì)胞外鉀離子積聚，F(xiàn)errier的研究顯示心肌梗死階段細(xì)胞外平均鉀離子濃度水平在10 mM左右[12]。本研究中的酸性缺氧液的配制綜合了以上因素，加入乳酸，調(diào)pH至6.2，提供一個(gè)酸性環(huán)境，另外，使用12 mM KCl，為細(xì)胞提供一個(gè)高鉀的環(huán)境[13]，更真實(shí)地模擬在體組織細(xì)胞I/R時(shí)的微環(huán)境。

體內(nèi)的I/R并非單一的病理?yè)p傷，是多種機(jī)制參與的復(fù)合過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)選用完全培養(yǎng)基、無(wú)糖培養(yǎng)基和酸性缺氧液作為缺氧液，配合低氧/厭氧工作站，探討建立H/R模型的最佳方法。研究表明，I/R或H/R過(guò)程中會(huì)伴隨著大量自由基的產(chǎn)生，生成的自由基會(huì)經(jīng)過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[14]。而作為最主要的自由基之一-ROS是目前公認(rèn)的I/R損傷的一個(gè)重要的病理生理改變[15]。故本研究在確定H/R損傷模型是否構(gòu)建成功時(shí)，選用ROS濃度是否激增作為評(píng)判指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)在不同H/R時(shí)程下，缺氧時(shí)以完全培養(yǎng)基處理的H9c2細(xì)胞，復(fù)氧結(jié)束后ROS水平無(wú)差別，以無(wú)糖培養(yǎng)基處理的H9c2細(xì)胞，在設(shè)定的缺氧時(shí)程內(nèi)，ROS濃度最高僅約為對(duì)照組的1.5倍，而以酸性缺氧液處理的H9c2細(xì)胞，ROS水平隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，H:8 h/R:1 h組ROS濃度為對(duì)照組的3.31倍。且細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以完全培養(yǎng)基以及無(wú)糖培養(yǎng)基處理的H9c2細(xì)胞，H/R后細(xì)胞存活率無(wú)明顯下降，而以酸性缺氧液處理的H9c2細(xì)胞，隨缺氧時(shí)程的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率不斷下降，H:1 h/R:1 h組細(xì)胞存活率約為77%，在H:8 h/R:1 h后細(xì)胞存活率約為40%，以上結(jié)果表明低氧/厭氧工作站結(jié)合酸性缺氧液能建立重現(xiàn)性非常好的H9c2細(xì)胞H/R模型。

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(編校：譚玲)

Establishment of a hypoxia/reoxygenation model of H9c2 cell using hypoxia/anoxic workstation

CHU Qian-wen1, LI Wei-qiu2, LU Shi-shi3, HUANG Dan-mei1, ZHANG Yan-mei1Δ

(1.Department of Pharmacy, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China; 2.Analytical Cytology Laboratory, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China; 3.Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China)

ObjectiveTo investigate optimal method of establishing hypoxia/reoxygenation(H/R) model of H9c2 cell by using hypoxia/anoxic workstation under different conditions in hypoxia.MethodsH9c2 cell was placed into hypoxia/anoxic workstation and simultaneously cultured with complete medium, glucose-free DMEM and acidic hypoxic solution for 1,2,4,6 and 8 h respectively, and then reoxygenated with complete medium for 1 h in normoxic incubator. The level of ROS was measured by flow cytometry. The cell viability was detected by MTT assay. The cellular morphology was observed by inverted microscope.ResultsWith the extension of cell hypoxia time, there were no significant differences in the ROS level and cell viability in complete medium- and glucose-free DMEM-treated H/R groups compared with control group(P<0.05). There was no obvious morphologic change observed with inverted microscope, either. Nevertheless, when H9c2 cells were treated with acidic hypoxic solution in hypoxia, the ROS level continuously increased and the cell viability decreased with the extension of cell hypoxia time(P<0.01). Since H:1 h/R:1 h, some of the cells shrunk and a few necrotic cells floated in the media under the inverted microscope, and the damage was aggravated with the extension of hypoxia time. After the cells were exposed in hypoxia for 8 h, they wrinkled to be round and a large number of floating necrotic cells were observed. When the cells were reoxygenated for 1 h, the cytomembrane was not smooth and there were still a few necrotic cells floating in culture dish.ConclusionThe H9c2 cell H/R model with good repeatability can be established successfully by using hypoxia/anoxic workstation combining with acidic hypoxic solution.

hypoxia/anoxic workstation; H9c2 cell; hypoxia/reoxygenation model

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473215和81072633)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030313448)；中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金

儲(chǔ)倩雯，女，碩士在讀，研究方向：心血管藥理，E-mail:1521105227@qq.com；張艷美，通信作者，女，博士，教授，研究方向：心血管藥理，E-mail：ymzhang@stu.edu.cn。

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1005-1678(2015)11-0011-04