徐偉良，陳德經，劉宇，魏泓，劉青

(1.陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工學院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000；3.第三軍醫(yī)大學 基礎部實驗動物學教研室，重慶 400038)

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大鯢皮膚黏液糖蛋白的提取純化及抗肺癌活性研究

徐偉良1，陳德經2Δ，劉宇3，魏泓3，劉青1

(1.陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工學院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000；3.第三軍醫(yī)大學 基礎部實驗動物學教研室，重慶 400038)

目的 研究大鯢皮膚黏液糖蛋白提取純化工藝以及體外對人肺癌細胞A549活性的影響。方法 利用堿提取和DEAE-52離子交換層析與Sephadex G-100凝膠層析分離純化大鯢黏液糖蛋白；并采用MTT比色法體外檢測大鯢黏液糖蛋白對人肺癌細胞A549的抑制率。結果 黏液糖蛋白中的總糖含量為4.23%，經SDS-PAGE電泳檢測，糖蛋白的分子量在30 kDa左右，為單一純品。隨糖蛋白純品濃度從1、10、20、40 μg/mL逐漸增加，糖蛋白對A549細胞的抑制率逐漸增大；當糖蛋白濃度為40 μg/mL，作用24 h時，對A549細胞的抑制率可達85.66%，作用48 h時，可達92.32%。與陽性對照紫杉醇相比，大鯢皮膚黏液糖蛋白對人肺癌細胞A549有顯著的抑制作用。結論 大鯢黏液糖蛋白對人肺癌細胞具有明顯的抑制作用，可為抗肺癌藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

大鯢；皮膚黏液；糖蛋白；純化；MTT法；抗肺癌

大鯢(AndriasdavidianusBlanchard)為大型兩棲、有尾目、隱鰓鯢科[1]。大鯢皮膚腺體主要有黏液腺和顆粒腺2種，黏液腺體細胞可釋放粘糖蛋白，與水結合后成為黏液，覆蓋在上皮游離面，形成了一道天然的防護屏障[2-3]。曲敏等[4-6]從大鯢體表黏液獲得了一種黏液低聚糖肽，并證明了該糖肽具有抗氧化、抗疲勞及對小鼠急性肝損傷有一定的保護作用。大鯢皮膚顆粒腺能夠分泌具有特殊性氣味的白色粘稠狀黏液，其成分是含有豐富的功能，復雜多樣的生物活性分子。王利鋒等[7]從大鯢皮膚黏液中分離純化出了一種小分子的抗菌肽，并證明其具有很好的廣譜抗菌作用；郭文韜等[8]對大鯢皮膚分泌物的水溶組分進行體外抗腫瘤活性檢測，實驗表明分泌物可溶組分對小鼠腹水瘤細胞和人宮頸癌細胞有一定的抑制作用，但具體何種活性成分對抑制腫瘤細胞生長起作用目前還不清楚。糖蛋白是一類由糖和蛋白質以共價鍵連接而成的共價復合物[9]，參與調節(jié)細胞的生長、分化、受精以及免疫等生命活動遍及始末，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫調節(jié)等作用[10-12]。

目前，體外抗腫瘤藥物篩選的方法很多，主要有MTT比色法、同位素滲入法、流式細胞儀法、生物熒光法以及SRB 法等[13-14]，其中MTT比色法是一種檢測細胞生存和增殖狀態(tài)的方法，具有簡單、快速、精確等優(yōu)點。本實驗通過柱色譜法對大鯢皮膚黏液糖蛋白進行分離、純化，并利用MTT比色法對所得糖蛋白純品進行體外抗肺癌A549細胞活性檢測，以期為大鯢黏液糖蛋白抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 大鯢皮膚黏液凍干粉(實驗室自制)；成熟大鯢(陜西漢源生物科技有限公司；人肺癌細胞系A549(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)；紫杉醇(大連美侖生物科技有限公司)；DEAE-52纖維素(北京慧德易生物科技有限公司)；Sephadex G-100、MW3500透析袋、胰蛋白酶、二甲基亞砜、MTT溶液(Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青生物工程研究所)；PBS緩沖液、氯仿、正丁醇、蒽酮均為分析純。

1.2 主要實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱、酶標儀、倒置顯微鏡(Thermo公司)；722G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；自制凝膠層析系統(tǒng)[包括8823B紫外檢測器、TBE-300A色譜工作站、TBP-50A恒流泵(均為上海同田生化技術公司)、BS-100A自動收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)、凝膠(1.6 cm×60 cm)層析柱(北京慧德易科技有限責任公司)]。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鯢皮膚黏液糖蛋白的提取與測定

① 堿提法提取糖蛋白：準確稱量5 g大鯢皮膚黏液凍干粉，以0.4 mol/L NaOH溶液在料液比為1︰25，45 ℃溫度下，提取2 h[15]；將提取液以4000 r/min，離心15 min，上清液加入無水乙醇至終濃度為76%，調pH至7.0左右，于4 ℃冰箱中靜置醇沉8 h；離心去除上清液，糖蛋白沉淀用無水乙醇洗滌3次，進行真空干燥。利用Sevage法脫蛋白，離心去除變性蛋白，重復數(shù)次，至無變性蛋白質析出為止。再經透析，濃縮，真空冷凍干燥，得糖蛋白粗品，并利用公式1計算得率：

粗糖蛋白得率%=糖蛋白粗品質量/黏液干粉稱重量×100%(公式 1)。

② 糖蛋白中總糖含量的測定——蒽酮硫酸法：取0.1 g大鯢糖蛋白粗品定容至50 mL容量瓶中，取1 mL黏液糖蛋白溶液于試管中，采用蒽酮硫酸法同樣步驟進行操作，于620 nm處進行比色測定OD值[16-17]。利用公式2計算總糖含量：

總糖含量(%)=(樣品濃度×稀釋倍數(shù)×樣品體積)/糖蛋白試樣質量×100% (公式 2)。

1.3.2 大鯢皮膚黏液糖蛋白的分離純化

① DEAE-52離子交換層析：根據(jù)DEAE-52離子交換樹脂性質和實際情況確定層析條件為：糖蛋白進樣濃度為2～3 mg/mL，進樣體積為1 mL，流速為0.5 mL/min，用0、0.05、0.2、0.4 mol/L的NaCl溶液進行分段洗脫。根據(jù)實驗室自制的凝膠層析設備，在280 nm處實時監(jiān)測樣品洗脫狀態(tài)，并以每管5 mL收集樣品，用硫酸蒽酮法跟蹤檢測620 nm處多糖吸收值，同時以收集的管數(shù)為橫坐標，吸光值(620 nm)為縱坐標繪制DEAE-52纖維素色譜柱洗脫曲線[18]。合并相同組分，減壓濃縮，用透析袋(MW3500)透析24 h，以去除NaCl和小分子雜質，最后將透析液真空冷凍干燥，得到初步純化的糖蛋白樣品。

② Sephadex G-100凝膠柱層析：經DEAE-52纖維素初步純化的糖蛋白用葡聚糖凝膠Sephadex G-100進一步分離純化，上樣糖蛋白濃度為2 mg/mL，上樣量為柱體積的3%，用流速為0.5 mL/min的去離子水洗脫，每隔5 mL收集一管。用硫酸蒽酮法跟蹤檢測(620 nm處吸收值)，合并相同組分，減壓濃縮，真空冷凍干燥，得糖蛋白純品[19]。

1.3.3 SDS-PAGE蛋白電泳鑒定：將純化的大鯢黏液糖蛋白樣品經分離膠、濃縮膠濃度分別為15%和5%的聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳估算糖蛋白樣品的分子量。

1.3.4 糖蛋白體外抗肺癌活性實驗

① 大鯢皮膚黏液糖蛋白的處理：將Sephadex G-100層析純化得到的糖蛋白純品用PBS緩沖液溶解，調整pH至7.0，經0.22 μm過膜除菌，通過蒽酮比色法測定其總糖濃度，并配制成1、10、20、40 μg/mL梯度的樣品，-20 ℃保存待用。

② A549肺癌細胞株的培養(yǎng)：培養(yǎng)液為含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，將A549細胞從液氮罐中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中快速溶解，并移入培養(yǎng)皿內(培養(yǎng)皿內先加入培養(yǎng)液)，在37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2d換液，傳代培養(yǎng)[20]。

③ A549肺癌細胞的接種：將指數(shù)生長期的A549細胞用0.25%胰酶消化液消化脫壁，吹打細胞培養(yǎng)液使其形成單細胞懸液。然后取200 μL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(6孔重復)中，使細胞約為5000～10000/孔，過夜培養(yǎng)[21-22]。經培養(yǎng)時間后，棄去原培養(yǎng)液，實驗組加入新配制的含有不同濃度的大鯢皮膚黏液糖蛋白溶液100 μL；陽性對照組為1 mg/mL的紫杉醇試劑，陰性對照組加入等量的細胞培養(yǎng)液；在37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h。

④ A549肺癌細胞生長抑制測定：細胞經培養(yǎng)實驗要求時間后，加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入裂解液二甲基亞砜100 μL，37 ℃震蕩溫育30 min；于波長為570 nm的酶標儀上，測定各孔的吸光度值。并通過公式3計算A549肺癌細胞的生長抑制率：

細胞抑制率IR(%)：=[1-(實驗組A值)/(對照組A值)]×100%(公式3)

實驗重復3次以上，結果基本一致，再以其中1次實驗值為準，繪制曲線。

2 結果

2.1 大鯢皮膚黏液糖蛋白中總糖含量 經計算堿提取糖蛋白的得率為3.85%，通過蒽酮比色法測定堿提取糖蛋白中總糖含量為4.23%。

2.2 大鯢皮膚黏液糖蛋白純化結果

2.2.1 大鯢黏液糖蛋白的DEAE-52離子交換層析：通過陰離子交換樹脂DEAE-52對黏液糖蛋白進行分離純化，見圖1、2。由圖1可知，當以0.2 mol/L的NaCl溶液洗脫時，在280 nm處實時監(jiān)測可得到單一的對稱峰，經硫酸蒽酮法實時跟蹤檢測(620 nm處吸收值)每管的收集液樣品的A值表明(見圖2)，在洗脫峰處，也有明顯的多糖吸收峰。故可以初步判定該部分是含糖蛋白的溶液，收集合并這一組份，經濃縮，透析，冷凍干燥，得到大鯢黏液糖蛋白初步純化組分。

圖1 DEAE-52洗脫樣品蛋白質吸收峰Fig.1 DEAE-52 samples of elution protein absorption peak

圖2 DEAE-52洗脫樣品多糖吸收峰Fig.2 DEAE-52 samples of elution polysaccharide absorption peak

2.2.2 大鯢黏液糖蛋白的Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析：經DEAE-52離子交換層析得到的糖蛋白樣品，經Sephadex G-100凝膠色譜再次對黏液糖蛋白初步純化組分進一步分離純化，其結果見圖3、4。由圖3可知，經去離子水洗脫，在280 nm處實時監(jiān)測得到一個單一組分吸收峰，并經蒽酮比色法檢測表明(見圖4)，在樣品出峰處又出現(xiàn)了多糖和蛋白的重疊峰，故可以證明純化的峰值樣品應是單一糖蛋白組分，將該組分收集，減壓濃縮，冷凍干燥，即得到精制大鯢黏液糖蛋白純品。

圖3 Sephadex G-100洗脫樣品蛋白質吸收峰Fig.3 Sephadex G-100 protein elution sample absorption peak

圖4 Sephadex G-100洗脫樣品多糖吸收峰Fig.4 Sephadex G-100 samples of elution polysaccharide absorption peak

2.3 SDS-PAGE電泳測定糖蛋白分子量 采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法來驗證糖蛋白的分子量，見圖5。由圖5可知，通過堿提取、DEAE-52離子交換層析、Sephadex G-100層析純化的糖蛋白樣品純度不斷提高，當經Sephadex G-100層析純化后，SDS蛋白電泳檢測到在分子量為30000 Da處有一條清晰的蛋白條帶。因此可證明所得精制糖蛋白的分子量約為30 kDa。

圖5 大鯢黏液糖蛋白的SDS-PAGE電泳圖1.堿提糖蛋白；2.DEAE-52層析糖蛋白；3.Sephadex G-100層析糖蛋白；M.標準分子量蛋白Fig.5 SDS-PAGE electrophoretogram of Salamander mucus glycoprotein 1.Alkali mention glycoprotein;2.DEAE-52 chromatography glycoprotein;3.Sephadex G-100 chromatography glycoprotein;M.Marker

2.4 黏液糖蛋白對A549肺癌細胞的抑制作用 大鯢黏液糖蛋白對A549肺癌細胞增殖抑制作用情況，見表1。由表1實驗結果進行對數(shù)回歸分析可知，隨糖蛋白純品濃度從1、10、20、40 μg/mL的增加，糖蛋白對A549細胞的抑制率逐漸增大；當糖蛋白濃度為40 μg/mL，作用24 h時，對A549細胞的抑制率可達85.66%，作用48 h時，可達92.32%。大鯢黏液糖蛋白對A549細胞的抑制作用在一定濃度范圍內有時間依賴性,與陽性對照紫杉醇相比較，對A549細胞增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 糖蛋白樣品對A549細胞增殖抑制的量效關系±s，n=3)Tab.1 Concentration-response relationship of glycoprotein samples on A549 cell proliferation ±s，n=3)

*P<0.05，與陽性對照組相比，compared with positive control group

3 討論

大鯢皮膚黏液含有的豐富的藥理活性成分，是天然藥用資源開發(fā)的寶庫。本實驗通過柱色譜法對大鯢皮膚黏液糖蛋白樣品進行分離純化，最終得到一種分子量約為30 kDa單一組分的糖蛋白。

將所得黏液糖蛋白樣品利用MTT比色法對A549肺癌細胞的活性檢測表明，黏液糖蛋白具有良好的抗肺癌活性的作用。隨樣品濃度從1、10、20、40 μg/mL的增加，黏液糖蛋白對A549細胞的增殖抑制作用明顯增大，其增殖抑制作用與陽性對照組比較差異顯著(P<0.05)，且大鯢黏液糖蛋白對A549細胞的抑制作用，在一定濃度范圍內有時間依賴性。大鯢黏液糖蛋白的抗肺癌細胞作用，可為抗肺癌藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Extraction and purification of giant salamander skin mucous glycoprotein and study its anti-cancer activity of lung cancer

XU Wei-liang1, CHEN De-jing2Δ, LIU Yu3, WEI Hong3, LIU Qing1

(1.The School of Biological Science & Engineering, Shanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China; 2.Shaanxi Provincial Bio-resource Key Laboratory, Shanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China; 3.Department of Laboratory Animals of Basic Medical, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

ObjectiveTo study the appearance of skin mucous glycoprotein in vitro on the activity of human lung cancer cells A549.MethodsUsed alkali extraction and DEAE-52 ion exchange chromatography and Sephadex G-100 gel chromatography purification salamander mucous glycoprotein; Salamander mucous glycoprotein inhibition of human lung cancer cells A549 was detected by MTT colorimetric method in vitro.ResultsIt showed that the total sugar content in the appearance of mucus was 4.23%, the relatively pure glycoprotein component, by SDS protein electrophoresis tests, it contained a single glycoprotein component, its molecular weight was about 30 kDa.With glycoprotein pure concentration increased from 1,10,20,40 μg/mL, the glycoprotein inhibition rate of A549 cells increased; when the glycoprotein concentration was 40 μg/mL, for 24 h action, the inhibition rate of A549 cells was up to 85.66 %, while the role of 48 h, the inhibition rate of A549 cells was up to 92.32%.Inhibition effect of mucus glycoprotein on A549 cell compared with positive control drug, had significant difference.ConclusionSalamander mucus glycoproteins of human lung cancer cells has obvious inhibitory effect, can provide theoretical basis for the development of lung cancer drug resistance.

giant salamander; mucus; glycoprotein; purification; MTT method; anti-lung cancer

陜西省中小企業(yè)科技創(chuàng)新項目(2014CXZJ36)

徐偉良，男，碩士，研究方向：應用生物化學，E-mail: xwlgra@126.com；陳德經，通訊作者，男，碩士，副教授，碩士生導師，研究方向：食品生物技術，E-mail：cdjslg@126.com。

TQ461

A

1005-1678(2015)08-0044-04