謝揚(yáng)，王靜，耿艷梅，曲妍霏，張志，王廣樹(shù)

(吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

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鴉蔥總黃酮抗乙型肝炎病毒的體外實(shí)驗(yàn)研究

謝揚(yáng)，王靜，耿艷梅，曲妍霏，張志，王廣樹(shù)Δ

(吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 探討鴉蔥總黃酮對(duì)乙型肝炎病毒的體外抑制作用。方法 通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(MTT)法觀察鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的影響；采用酶聯(lián)免疫吸咐(ELISA)法檢測(cè)分析鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)的抑制作用；采用熒光定量PCR法檢測(cè)鴉蔥總黃酮對(duì)乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的影響。結(jié)果 鴉蔥總黃酮對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為0.603 mg/mL；鴉蔥總黃酮高中低3個(gè)無(wú)毒劑量(0.062、0.125、0.250 mg/mL)均能明顯降低HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的含量和HBV-DNA數(shù)量，最大抑制率分別為89%、33%及43%。結(jié)論 鴉蔥總黃酮具有顯著的抗乙型肝炎病毒作用。

鴉蔥；黃酮；乙型肝炎病毒

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康及生命安全的常見(jiàn)重大疾病。其發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，自身免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂，部分患者最終發(fā)展為肝硬化、肝癌，且預(yù)后極差[1-3]。全世界有3.5～4.0億乙型肝炎病毒感染者[4]，其中，每年有近100萬(wàn)患者死于HBV感染引起的肝硬化和肝癌[5-6]。在我國(guó)有1.2億多HBV感染者，約占全球感染總數(shù)的1/3，居世界首位，其中慢性乙型肝炎患者3000萬(wàn)例，我國(guó)每年有近30萬(wàn)患者死于因乙肝誘發(fā)的相關(guān)疾病[7-10]。乙肝給患者家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，引發(fā)一系列社會(huì)問(wèn)題，是我國(guó)現(xiàn)階段最為突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此，尋找和研究既具有抗病毒又具有保肝作用的有效天然藥物，對(duì)慢性乙肝的治療具有十分重要的臨床意義。前期本研究課題組已證實(shí)了鴉蔥總黃酮的保肝作用[11]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體外抑制HBV藥物篩選體系HepG2.2.15細(xì)胞，觀察鴉蔥總黃酮對(duì)細(xì)胞分泌HbsAg、 HbeAg和HBV DNA的影響，探討鴉蔥總黃酮的抗乙肝病毒作用，為鴉蔥總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料：鴉蔥藥材采自于吉林省四平地區(qū)，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張靜敏教授鑒定為鴉蔥ScorzoneraaustriacaWild。

1.1.2 細(xì)胞株：HepG2.2.15細(xì)胞株，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供。

1.1.3 主要藥品及試劑：D101型大孔樹(shù)脂、D4020型大孔樹(shù)脂(天津農(nóng)藥股份有限公司樹(shù)脂分公司)；四季青胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)；高糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco USA)；G418、MTT(Sigma公司)；雙抗(青鏈霉素，Hyclone公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒、HbeAg ELISA檢測(cè)試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒(上海浩源生物科技有限公司)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器：TGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱、無(wú)菌超凈臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；37XB倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器五廠)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；EZbead System-32核酸提取儀(Texas Biogene，Inc.)。

1. 2 方法

1.2.1 鴉蔥總黃酮(total flavonoids inScorzoneraaustriacaWild，TFSA)的制備[11]：鴉蔥全草，用70%的乙醇浸泡，減壓回收乙醇，然后上D-101大孔樹(shù)脂色譜柱，用水、60%的乙醇溶液洗脫，收集60%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，干燥，得鴉蔥粗制黃酮提取物。將粗制總黃酮上樣到D4020大孔樹(shù)脂色譜柱上，依次用水、5%乙醇、10%乙醇、30%乙醇洗脫，薄層色譜板檢測(cè)，收集含有黃酮部分的洗脫液，減壓濃縮，干燥，得到精制鴉蔥總黃酮。

1.2.2 鴉蔥總黃酮的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：用胰酶消化HepG2.2.15細(xì)胞，輕輕吹打分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按每孔0.1 mL分種于96孔板，置37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后每孔加含不同濃度鴉蔥總黃酮培養(yǎng)維持液0.1 mL，每個(gè)濃度6孔。鴉蔥總黃酮實(shí)驗(yàn)原液以含10%胎牛血清、380 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液作系列倍比稀釋，配制成1.000、0.500、0.250、0.125、0.062 mg/mL 5個(gè)濃度鴉蔥總黃酮培養(yǎng)維持液。另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，每孔加0.1mL不含藥液的細(xì)胞培養(yǎng)液。將96孔板置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3d后，輕輕吸除培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按Sargent JM等[12]建立的MTT法測(cè)定鴉蔥總黃酮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)毒性濃度(TC50)：向前述細(xì)胞加入400 μg/mL MTT 0.1 mL/孔，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，再每孔加入100% DMSO 0.1 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)密閉孵育約10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。TC50細(xì)胞破壞率(%)=(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-給藥實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。按照Reed-Meuench法[13]計(jì)算藥物的TC50=Antilog[B+(50%-<50%破壞率)/(>50%-<50%破壞率)×C]；A=log>50%藥物濃度，B=log<50%藥物濃度，C=A-B。

1.2.3 培養(yǎng)細(xì)胞上清液中HbsAg、HbeAg、HBV-DNA的檢測(cè)：按照1.2.2項(xiàng)下，將HepG2.2.15細(xì)胞接種于96孔板中，分為5個(gè)組，細(xì)胞對(duì)照組、低劑量鴉蔥總黃酮組(0.062 mg/mL)、中劑量鴉蔥總黃酮組(0.125 mg/mL)、高劑量鴉蔥總黃酮組(0.250 mg/mL)、拉米夫定陽(yáng)性藥組(0.1 mg/mL)。每3 d更換一次培養(yǎng)液，同時(shí)收集各組3、6、9 d后培養(yǎng)板中細(xì)胞上清液。按照 ELISA試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀讀取各組OD450值，計(jì)算鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg的抗原表達(dá)抑制率。按乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)各組病毒數(shù)量，計(jì)算鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中3、6、9d的HBV-DNA病毒抑制率。

2 結(jié)果

2.1 鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用 MTT染色法結(jié)果顯示：在0.250 mg/mL及以下濃度下對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無(wú)毒性作用。鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的TC50為0.603 mg/mL。見(jiàn)表1。

2.2 鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的影響 ELISA結(jié)果顯示：0.250 mg/ mL鴉蔥總黃酮處理HepG2.2.15細(xì)胞9 d，對(duì)HBsAg的抑制率為89%，處理HepG2.2.15細(xì)胞bd對(duì)HBeAg的抑制率為33%。見(jiàn)表2、表3。熒光定量PCR結(jié)果顯示：0.125 mg/mL鴉蔥總黃酮處理HepG2.2H15細(xì)胞3 d對(duì)HBV-DNA的抑制率為43%。見(jiàn)表4。

表2 鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of TFSA on HBsAg secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，與對(duì)照組比較，compared with control group

表3 鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用Tab.3 Inhibitory effect of TFSA on HBeAg secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，與對(duì)照組比較，compared with control group

表4 鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV-DNA的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of TFSA on HBV-DNA secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，與對(duì)照組比較，compared with control group

3 討論

HepG2.2.15細(xì)胞株系以重組載體pDolTHBV-1(含2個(gè)HBV頭對(duì)尾二聚體，以尾對(duì)尾方向串聯(lián))轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)G418篩選后獲得的一個(gè)表達(dá)高水平HBsAg、HBeAg的細(xì)胞克隆[14]，由美國(guó)The Mount Sinai Medical Center 于1986年建立[16]，并且已成功地應(yīng)用于抗HBV藥物的篩選[16-17]，作為抗HBV作用的指標(biāo)，被中國(guó)衛(wèi)生部收載于治療肝炎的《中藥新藥藥效學(xué)研究指南》[18]。乙型肝炎感染的血清標(biāo)志物包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg, 特別是HBV DNA水平的監(jiān)測(cè)已成為抗HBV治療的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用HepG2.2.15細(xì)胞作為細(xì)胞模型，以HBV DNA、HBsAg、HBeAg為指標(biāo)，研究鴉蔥總黃酮的抗乙肝病毒作用。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)MTT染色法，檢測(cè)鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TC50為0.603 mg/mL，在0.250 mg/mL及以下濃度下對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。然后在無(wú)毒濃度下進(jìn)行藥物干預(yù)培養(yǎng)。利用HBsAg、HBeAg ELISA試劑盒，檢測(cè)鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HbeAg的抑制作用。結(jié)果表明，鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg有顯著的抑制作用(P<0.01)，且抑制率隨著鴉蔥總黃酮濃度的升高而增大，呈良好的劑量依賴關(guān)系。熒光定量PCR法結(jié)果表明，鴉蔥總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清培養(yǎng)液中HBV-DNA的含量有顯著降低體用(P<0.01)，其中0.125 mg/mL濃度的鴉蔥總黃酮干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)第3天后抑制率最大，達(dá)到43%，說(shuō)明鴉蔥總黃酮具有抗乙肝病毒作用。因此鴉蔥總黃酮有望成為治療慢性乙型肝炎候選藥物。本研究為開(kāi)發(fā)抗乙肝病毒藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編校：吳茜)

Experimental studies on inhibitory effects of total flavonoids inScorzoneraaustriacawild on hepatitis B virus in vitro

XIE Yang, WANG Jing, GENG Yan-mei, QU Yan-fei, ZHANG Zhi, WANG Guang-shuΔ

(School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo investigate anti-HBV effect of total flavonoids inScorzoneraaustriacawild (TFSA) in vitro.MethodsMTT assay was used to observe the effect of TFSA on HepG2.2.15 cells，ELISA assay was used to detect the inhibition on HBsAg and HBeAg secretion from HepG2.2.15 cells and RTFQ-PCR assay was used to detect the inhibition rates of HBV-DNA.ResultsThe TC50of TFSA on HepG2.2.15 cells was 0.603 mg/mL. TFSA significantly reduced the content of HBsAg and HBeAg and the numbers of HBV-DNA in the HepG2.2.15 cell cultural supernatants under nontoxic concentrations (0.062, 0.125, 0.250 mg/mL), and the maximal inhibitory rate was 89%, 33% and 43%, respectively.ConclusionTFSA have anti-HBV effects in vitro.

Scorzoneraaustriacawild; flavonoids; hepatitis B virus

國(guó)家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制(2013ZX09103002-007)

謝揚(yáng)，女，碩士，研究方向：中草藥有效成分的研究，E-mail：13514486691@163.com；王廣樹(shù)，通訊作者，男，博士、教授、博士生導(dǎo)師，研究方向：中草藥有效成分的研究，E-mail：wgs@jlu.edu.cn。

R944.9

A

1005-1678(2015)08-0041-04