劉小玲，李文妍，高甜，郭小彬，杜玉娟，肖云峰,3Δ

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學(xué)處，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 新藥安全評價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.天津中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，天津 南開 300193)

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苦參素對大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的研究

劉小玲1，李文妍1，高甜2，郭小彬1，杜玉娟1，肖云峰2,3Δ

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學(xué)處，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 新藥安全評價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.天津中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，天津 南開 300193)

目的 建立大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型，觀察其病理學(xué)改變；并探討苦參素對其的影響。方法 取Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為空白對照組、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型組(以下簡稱模型組)和苦參素組。采用EAE癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)對造模后大鼠進(jìn)行評測，以觀察其行為學(xué)變化；通過病理學(xué)HE染色和Kluver & Barrera髓鞘染色，觀察腦和脊髓炎癥浸潤、血管袖套改變和脊髓脫髓鞘變化。結(jié)果 空白對照組動(dòng)物未見行為學(xué)變化和病理學(xué)改變。模型組所有動(dòng)物均出現(xiàn)行為學(xué)改變，并伴有髓鞘脫失和不同程度的腦和脊髓炎癥浸潤?？鄥⑺亟M6只大鼠未出現(xiàn)EAE行為學(xué)變化的臨床表現(xiàn)，且髓鞘結(jié)構(gòu)基本完整。結(jié)論 苦參素可以延長大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的疾病潛伏期，緩解臨床癥狀并保護(hù)神經(jīng)。

苦參素；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；病理學(xué)；多發(fā)性硬化

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是一種臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS) 脫髓鞘疾病。MS主要的發(fā)病特點(diǎn)是脫髓鞘病變和CNS炎性反應(yīng)，是個(gè)體遺傳易感和環(huán)境因素作用發(fā)生的一種自身免疫性疾病。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型是研究MS最常用的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1]。現(xiàn)階段MS的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因而并沒有理想的治療藥物出現(xiàn)。苦參素(oxymatrine)是苦參的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、升高白細(xì)胞和抗病毒作用[2]。近年也有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)苦參素具有神經(jīng)保護(hù)作用[3]。本研究立足于此，采用豚鼠全脊髓勻漿制備大鼠EAE模型，探討苦參素對EAE的作用，并觀察大鼠行為學(xué)變化和CNS的病理學(xué)改變，試圖為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:豚鼠，普通級，6 只，雄性，體質(zhì)量(500±50)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2010-0002。

Wistar大鼠，清潔級，30只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蒙)2002-0001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及受試物:苦參素注射液(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批號130419204)；皮內(nèi)注射用卡介苗(上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，批號201303012-2)；水合氯醛(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號20131220)；完全弗氏佐劑(Sigma，批號9007-81-2)；碘伏(山東利爾康消毒科技有限公司，批號20130807)；生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司，批號D131121062)；無水乙醇(天津市化學(xué)試劑一廠，批號130706)；二甲苯(沈陽市華東試劑廠，批號121226)；石蠟(上海華靈康復(fù)器械廠，批號20130321)；甲醛(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號20130408)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：封閉式全自動(dòng)組織脫水機(jī)(Leica，型號ASP200)；切片機(jī)(Leica，型號RM2235)；自動(dòng)染色機(jī)(Leica，型號XL)；分體式組織包埋機(jī)(Leica，型號EG 1150H)；烘片機(jī)、攤片機(jī)(Leica，型號HI1210)；熒光倒置顯微鏡(Leica，型號DM3000)；病理圖像分析儀(Leica，型號QWIN)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境適應(yīng)與飼喂：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按等級分環(huán)境飼養(yǎng)，大鼠分雌雄飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，每盒飼養(yǎng)5只；豚鼠飼養(yǎng)于普通環(huán)境中，每籠飼養(yǎng)2只。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均喂以內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)維持飼料，自由攝水，室溫19 ℃～25 ℃，濕度40%～60%。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始試驗(yàn)。

1.2.2 豚鼠全脊髓勻漿(guinea pigs spinal cord homogenate, GPSCH)抗原乳劑的制備[4]：豚鼠稱重后，腹腔注射10%的水合氯醛3 mL/kg，麻醉后，固定于解剖板上。備皮、消毒、暴露心臟后，用生理鹽水經(jīng)主動(dòng)脈灌注預(yù)冷的生理鹽水至肝臟變白。迅速剝離整條脊柱，無菌除去脊膜，稱重后放入無菌勻漿管內(nèi)，加入等體積預(yù)冷的生理鹽水，于冰浴中勻漿，制成50%(m/v)的GPSCH。

將該勻漿與含6 mg/mL卡介苗的等體積完全弗氏佐劑一同注入消毒過的玻璃注射器，通過三通連接另一消毒過的玻璃注射器。勻漿液在冰浴條件下反復(fù)在2個(gè)注射器內(nèi)抽吸500次，制成穩(wěn)定的油包水型抗原乳劑。

1.2.3 分組、造模及給藥

分組：將30只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組和苦參素組，每組10只。

EAE模型的建立[5]：分別于模型組和苦參素組大鼠雙后肢足墊皮內(nèi)和肩背部皮下各注射抗原乳劑0.2 mL和0.1 mL，空白對照組大鼠雙后肢足墊皮內(nèi)和肩背部皮下注射生理鹽水0.2 mL和0.1 mL。

給藥：模型組：自免疫當(dāng)日起，腹腔注射生理鹽水6.7 mL/kg，每天1次，連續(xù)16d；苦參素組：自免疫當(dāng)日起，腹腔注射苦參素注射液100 mg/kg(相當(dāng)于臨床等效量)，每天1次，連續(xù)16d；空白對照組：自實(shí)驗(yàn)當(dāng)日起，腹腔注射生理鹽水6.7 mL/kg，每天1次，連續(xù)16d。

1.2.4 臨床EAE癥狀評分：從免疫當(dāng)天起，每天對大鼠進(jìn)行稱重，上午、下午2次對其精神狀況和活動(dòng)情況等行為學(xué)指征進(jìn)行觀察，并進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)采用國際通用的Correar 6分[6]評分法：0分：無明顯異常；1分：動(dòng)物尾部無力；2分：后肢無力；3分：后肢癱瘓；4分：前、后肢均癱瘓；5分：瀕死或死亡。將評分達(dá)到或超過1分者視為EAE發(fā)病大鼠。

1.2.5 病理學(xué)檢查

取材：大鼠稱重后，腹腔注射10%的水合氯醛3 mL/kg，麻醉后，固定于解剖板上。備皮、消毒、暴露心臟后，用生理鹽水經(jīng)主動(dòng)脈灌注預(yù)冷的生理鹽水至肝臟變白，迅速取出腦和脊髓。用中性緩沖福爾馬林溶液固定48 h，然后放于70 %酒精保存。分別取腦干、小腦、腰膨大及頸髓做石蠟切片，進(jìn)行HE染色和Kluver&Barrera 髓鞘染色。

病理學(xué)評分：參照Yin JX 5分[7]評分標(biāo)準(zhǔn)。0分：無炎癥；1分：血管和脊膜周圍有炎癥浸潤；2分：腦或脊髓內(nèi)部存在輕微炎癥浸潤(1～10/片) ；3分：腦或脊髓內(nèi)部存在中度炎癥浸潤(11～100/片) ；4分：腦或脊髓內(nèi)部存在重度的炎癥浸潤(>100/片) 。

2 結(jié)果

2.1 臨床EAE癥狀評分 空白對照組平均評分為0分，體重持續(xù)增長，未見異常。模型組免疫后第8天出現(xiàn)鼠尾下垂、張力降低等行為學(xué)異常現(xiàn)象，潛伏期為(9.42±1.07)d，第14天癥狀最嚴(yán)重，2只死亡，臨床癥狀評分為(4.84±0.65)分。苦參素組免疫后第13天，相繼有4只大鼠出現(xiàn)鼠尾張力降低等現(xiàn)象?？鄥⑺亟M與模型組比較潛伏期延長，發(fā)病率下降，評分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 苦參素對EAE行為學(xué)的影響±s)Tab.1 Influence of EAE behavior by ±s)

*P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.2 炎癥細(xì)胞改變 通過HE染色，發(fā)現(xiàn)空白對照組無炎癥浸潤等現(xiàn)象。模型組大鼠均有不同程度的多發(fā)性炎癥浸潤，且呈“袖套狀”特征，浸潤程度最強(qiáng)為腦干。苦參素組較模型組炎癥浸潤顯著減輕，其病灶數(shù)和“袖套狀”均顯著低于模型組，在小腦、腦干和腰髓的炎癥浸潤細(xì)胞顯著減輕(P<0.05)。見表2和圖1，圖1為腦干組織。

表2 苦參素對EAE腦和脊髓炎癥浸潤的影響±s，分)Tab.2 The influence on EAE inflammatory infiltration of brain and spinal cord by ±s,score)

*P<0.05，與模型組比較，compared with model group

圖1 各組炎癥細(xì)胞改變(HE，×400)Fig.1 Inflammatory cell changes in each group(HE，×400)

2.3 神經(jīng)髓鞘改變 通過Kluver & Barrera髓鞘染色，發(fā)現(xiàn)空白對照組無髓鞘脫失等改變。而模型組均有不同程度的髓鞘脫失，大多與炎癥浸潤區(qū)域伴行?？鄥⑺亟M髓鞘脫失現(xiàn)象明顯弱于模型組，但也存在小片脫失現(xiàn)象。詳見圖2。

圖2 各組神經(jīng)髓鞘改變(HE，×400)Fig.2 Nerve myelin changes in each group(HE，×400)

3 討論

苦參素廣泛存在于苦參、廣豆根等豆科植物中，是氧化苦參堿和極少量其他生物堿的混合物。在一定情況下，氧化苦參堿可以與苦參堿相互轉(zhuǎn)化，抑制自身免疫反應(yīng)[9-11]。研究表明，苦參素可以降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而抑制CNS炎癥細(xì)胞浸潤[12-13]，因而推測苦參素對EAE有治療作用。

MS的主要特點(diǎn)是CNS白質(zhì)脫髓鞘病變，近百年來，臨床一直將其作為一種獨(dú)立的疾病進(jìn)行治療。因其高發(fā)病率、漫長病程和青壯年易患而受到全世界的重視。臨床認(rèn)為其發(fā)病主要與患者自身免疫有關(guān)[7]，但是確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。與此同時(shí)，臨床一直沒有一種完全治愈這種疾病的方法，而使它成為了近些年研究的熱門領(lǐng)域之一。EAE模型一直被公認(rèn)為是MS的經(jīng)典模型，被用于MS的病因研究[8]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EAE免疫建立后，給予苦參素干預(yù)，大鼠出現(xiàn)尾下垂、張力降低等行為學(xué)異常現(xiàn)象的潛伏期較模型對照組顯著延長(P<0.05)，免疫后第13天，出現(xiàn)行為學(xué)異?，F(xiàn)象；且發(fā)病動(dòng)物數(shù)量顯著減少(P<0.05)，苦參素組有4只動(dòng)物出現(xiàn)了行為學(xué)異?，F(xiàn)象，EAE癥狀評分也只有(3.07±0.84)分，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。通過HE染色，發(fā)現(xiàn)苦參素組較模型組炎癥浸潤顯著減輕，其病灶數(shù)和“袖套狀”均顯著低于模型組，在小腦、腦干和腰髓的炎癥浸潤細(xì)胞顯著減輕(P<0.05)。Kluver & Barrera 髓鞘染色發(fā)現(xiàn)苦參素組髓鞘脫失現(xiàn)象明顯弱于模型組，但也存在小片脫失現(xiàn)象。由以上結(jié)果初步證實(shí)，苦參素可以顯著降低大鼠EAE的發(fā)病率，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥浸潤，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，并防止髓鞘脫失。

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(編校：譚玲)

Study on experimental autoimmune encephalomyelitis with oxymatrine on rats model

LIU Xiao-ling1, LI Wen-yan1, GAO Tian2, GUO Xiao-bin1, DU Yu-juan1, XIAO Yun-feng2,3Δ

(1.Department of Pharmacy, Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010017, China; 2.Evaluation Center for New Drug Safety of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China; 3.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)

ObjectiveTo establish experimental autoimmune cerebral spinal cord inflammation (EAE) model rats, and observe the pathological changes and effect of oxymatrine on EAE model.Methods30 rats were randomly divided into control group,EAE (model group)group and oxymatrine group.The EAE symptom score was used to evaluate the rats after the model, and to observe the changes of its behavior.By HE staining and Kluver & Barrera myelin dyeing to observe the inflammation of the brain and spinal cord demyelinating changes.ResultsThe animals in control group had no change in behavior and pathological.In model group,all animals occured behavioral changes, accompanied by varying degrees of demyelination and inflammatory infiltration of the brain and spinal cord.In oxymatrine group,6 rats did not appear EAE clinical manifestations and behavioral change, and the myelin structure was intact.ConclusionOxymatrine can extend the incubation period experimental autoimmune encephalomyelitis in rats of the disease, relieve symptoms and protect nerve.

oxymatrine; experimental autoimmune encephalomyelitis; pathology; multiple sclerosis

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(2012ms1215)；內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(201302052)

劉小玲，女，學(xué)士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥理學(xué)、藥理學(xué),E-mail：nyliuxiaoling@163.com；肖云峰，通訊作者，男，博士在讀，助理研究員，研究方向：藥理學(xué)、毒理學(xué)，E-mail：xiaoyunfeng0472@126.com。

R361

A

1005-1678(2015)06-0022-03