王希彪，牟春堂，郝小燕，狄生偉，崔世泉，童縣偉，楊慶山

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱150030）

杜民雜交豬基因雜合度與繁殖性狀關(guān)系研究

王希彪，牟春堂，郝小燕，狄生偉，崔世泉，童縣偉，楊慶山

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱150030）

利用25個微衛(wèi)星標記對3個世代杜民雜交豬進行基因雜合度遺傳學檢測，統(tǒng)計產(chǎn)仔數(shù)、初生重、初生窩重、21日齡重以及21日齡窩重等繁殖性狀。通過基因雜合度與繁殖性狀間相關(guān)分析，結(jié)果表明，隨著選育世代增加，群體平均雜合度呈逐代降低趨勢；3個世代群體平均雜合度變化趨勢與各個繁殖性狀變化趨勢基本一致；基因雜合度與產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重間呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.615和0.640。由此可見，選育群體基因雜合度的變化對產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重等繁殖性狀有顯著影響。

杜民雜交豬；微衛(wèi)星標記；雜合度；繁殖性狀

經(jīng)濟雜交在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應用，但雜種優(yōu)勢作用機制和雜種優(yōu)勢預測進展緩慢[1]。DNA分子標記的發(fā)展，為動物雜種優(yōu)勢研究及預測開辟了新途徑。微衛(wèi)星分子標記是DNA分子標記典型代表，從分子水平上評價動物雜種優(yōu)勢方法具有更高可靠性[2]。

基因雜合度是指在整個基因組上雜合型基因座位所占比例，是反應群體或個體遺傳雜合程度重要參數(shù)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，基因雜合度與近交衰退呈負相關(guān)，基因雜合度與動物多性狀存在相關(guān)關(guān)系[4-6]。本研究利用微衛(wèi)星標記檢測不同世代杜民雜交群體基因雜合度，分析其與繁殖性狀關(guān)系，旨在探討基因雜合度變化對繁殖性能影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬耳組織采集

試驗群體選自黑龍江省蘭西縣民豬保種基地，其中包括杜民（DM）60頭、杜民橫交一世代（DM1）88頭、杜民二世代（DM2）67頭。采集耳組織，將收集到的耳組織放入裝有75%乙醇1.5 mL離心管中，置于-20℃冰箱中保存。

1.1.2 豬繁殖性能測定

本試驗測定的繁殖性能主要有各世代初產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)、仔豬初生重、初生窩重、21日齡重、21日齡窩重，從分娩開始逐一跟蹤仔豬測定、記錄繁殖性狀數(shù)據(jù)。

1.1.3 試驗所需試劑

試驗試劑主要有三羥甲基氨基甲烷、Tris飽和酚、蛋白酶K（Proteinase K）、DL2000 Marker、dNTPs、Taq酶、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、PBR322 Marker、甲醛、硝酸銀、乙醇、乙酸等，試劑均為分析純等級。

1.1.4 主要儀器設備

梯度PCR儀（Biometra公司）、KQ-700E型超聲波清洗器、HZS-H型水浴振蕩器、高壓滅菌鍋、JY600C型電泳儀、DYY-8B型電泳儀、WD-9405B型水平搖床、電熱恒溫鼓風干燥箱、電子天平、UV-凝膠成像系統(tǒng)、D30-分光光度計。

1.2 方法

1.2.1DNA提取與檢測

按常規(guī)酚氯仿抽提法提取耳組織DNA[7]，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度計法分別檢測DNA濃度，將濃度合格的DNA稀釋到200 ng·μL-1，-20℃條件下保存。

1.2.2 微衛(wèi)星標記座位選擇

本試驗在選擇微衛(wèi)星標記座位時，參考相關(guān)研究結(jié)果[8-9]，從FAO-ISAG選取25個微衛(wèi)星標記座位，分布于1～17號及X染色體，等位基因數(shù)在2～8（部分基因座位及其引物見表1）。

1.2.3PCR反應條件及擴增程序

PCR反應體系（10 μL）：包括ddH2O 6.4 μL、10×buffer 1 μL、dNTPs 2.5 μmol·L-10.8 μL、上下游引物各0.3 μL、Taq酶（5 U·μL-1）0.2 μL、DNA模板1 μL。

PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53.2～63.8℃退火30 s，72℃延伸30 s，30～35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，最后將擴增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 基因分型

將PCR擴增產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1%TBE，電泳時電壓為185 V，選用PBR322為DNA Marker，電泳分離后凝膠經(jīng)過銀染顯色后，用掃描儀照相，最后根據(jù)凝膠上顯示的條帶人工分型，參照烏蘭分型方法[10]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

基因分型以后，用POPGENE 32軟件計算群體基因雜合度、等位基因數(shù)，PIC-CALC軟件計算多態(tài)信息含量（PIC），用最小顯著差異法（LSD）多重比較，分析繁殖性狀數(shù)據(jù)間差異顯著性，用SPSS Statistics 17.0的correlate過程進行基因雜合度與繁殖性狀間相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)

本試驗中，選用25個微衛(wèi)星標記座位均表現(xiàn)出多態(tài)性，每個座位上檢測到的等位基因數(shù)2～8個。SW24座位上檢測出8個等位基因，SW830座位上檢測到2個等位基因。DM群體中共檢測出114個等位基因，每個座位平均4.56個等位基因，平均有效等位基因數(shù)為3.2927；DM1群體中共檢測出106個等位基因，每個座位平均4.24個等位基因，平均有效等位基因數(shù)為3.0405；DM2群體中共檢測出105個等位基因，每個座位平均4.2個等位基因，平均有效等位基因數(shù)為3.2924。每個世代中檢測到的等位基因頻率為0.0238～0.9359，其中大部分等位基因頻率均大于0.05。

2.2 雜合度及多態(tài)信息含量

通過1～17號及X染色體上25個微衛(wèi)星標記座位的平均雜合度估計群體基因雜合度，結(jié)果顯示，隨杜民雜交豬選育世代遞增，基因雜合度呈逐代降低趨勢（見圖1），群體平均基因雜合度從0.6703（DM）降低至0.6238（DM2）。3個世代杜民雜交群體的多態(tài)信息含量（PIC）均＞0.5，呈現(xiàn)高度多態(tài)（見表2）[11]。

2.3 基因雜合度與繁殖性狀變化

3個世代杜民豬（DM、DM1、DM2）產(chǎn)仔數(shù)、初生重、初生窩重、21日齡重、21日齡窩重等繁殖性狀數(shù)據(jù)如表3所示，3個世代中DM繁殖性能表現(xiàn)最好，各個繁殖性狀表現(xiàn)上均高于DM1和DM2，所有繁殖性狀值均顯著高于DM2（P＜0.05）；DM與DM1相比，除產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重，其他繁殖性狀間差異均未達到顯著水平（P＞0.05）。

由表2和3可知，各繁殖性狀DM、DM1、DM2間變化與群體基因雜合度變化趨勢基本一致。

圖1 基因雜合度變化趨勢Fig.1Change trend of genetic heterozygosity

表2 基因雜合度與多態(tài)信息含量變化Table 2Change of genetic heterozygosity and PIC

2.4 基因雜合度與繁殖性狀間相關(guān)性分析

通過對杜民豬基因雜合度與繁殖性狀間相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，基因雜合度與產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重之間存在正相關(guān)關(guān)系，而與初生重、21日齡重、21日齡窩重相關(guān)不顯著（見表4）。

表3 不同世代繁殖性能變化Table 3Changes of performance in different generations

表4 基因雜合度與繁殖性狀間相關(guān)關(guān)系Table 4Correlation index between heterozygosity and reproductive traits

3 討論與結(jié)論

陳幼春認為，隨機抽樣時品種內(nèi)樣本含量高于60，試驗結(jié)果可靠性可達95%以上[12]；閆路娜等研究發(fā)現(xiàn)，等位基因及各位點平均等位基因數(shù)受到樣本量顯著影響，多態(tài)性越高，影響越大。當?shù)任换蝾l率在0.03時，采用樣本量需50頭，等位基因頻率在0.05時，采用樣本量30頭[13]；Nei指出，使用大量標記時，小樣本量也可接受[14]。另外，Barker建議遺傳分析時，微衛(wèi)星標記座位的等位基因要在4個以上，有效等位基因在2個以上[15]；Botstein提出當多態(tài)信息含量（PIC）＞0.5時，群體呈現(xiàn)高度多態(tài)，PIC值越大，微衛(wèi)星標記檢測準確性越高[11]。本研究中，DM、DM1、DM2選用的樣本量均多于60頭，各世代杜民豬等位基因頻率均高于0.05，絕大部分標記座位等位基因均達到4個以上，平均有效等位基因均在2個以上，且群體平均PIC均＞0.5，呈高度多態(tài)。因此，本研究結(jié)果具有較高準確性。

Li等以杜洛克和地方品種為研究對象，得到豬群基因雜合度為0.31～0.66[16]；Zhang等以幾個地方品種為研究對象，得到基因雜合度范圍為0.44～0.87，平均多態(tài)信息含量為0.39～0.86[17]，這與本研究檢測結(jié)果一致。另外，本研究測得各世代杜民豬基因雜合度雖呈逐代降低趨勢，但相鄰兩個世代間群體平均雜合度差異并未達到顯著水平（P＞0.05），這可能是杜民豬群體規(guī)模較小、選育強度小所致。

對基因雜合度與肉質(zhì)性狀、胴體性狀、生長性狀之間關(guān)系多有報道，但對基因雜合度與繁殖性狀之間關(guān)系鮮有研究[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，基因雜合度對豬的產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重有顯著影響，這可能是因為雜合子頻率增加抑制或者減弱，對產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重有不良影響基因的作用。

試驗結(jié)果表明，杜民雜交選育群體遺傳變異性較大，具有很大選擇潛力；選育群體基因雜合度變化對豬產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重等繁殖性狀有顯著影響。

[1]鐘金城,陳智華.雜種優(yōu)勢理論研究的回顧與展望[J].黃牛雜志,1996,22(4)：4-6.

[2]Barker J S F.Conserving livestock breed diversity[J].Anim Genet Kesour Lnf,1999,25：33-43.

[3]Godshalk E B,Lee M,Lamkey K R.Relationship of restriction fragment length polymorphism to single-cross hybrid performance of maize[J].Theor Appl Genet,1990,80：273-280.

[4]姜勛平,熊遠著,劉桂瓊.豬個體基因雜合度對生長性狀的影響[J].遺傳學報,2003,30(5)：431-436.

[5]劉桂瓊,姜勛平,熊遠著,等.豬個體基因雜合度對肉質(zhì)的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2004,27(1)：67-70.

[6]劉桂瓊,姜勛平,熊遠著,等.豬個體基因雜合度對胴體性狀的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2003,26(1)：56-60.

[7]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,1999：9-10.

[8]曹果清,李步高,莫清珊,等.應用21個微衛(wèi)星標記分析山西白豬高產(chǎn)仔母系的遺傳多樣性[J].中國畜牧雜志,2010,46(13)：14-18.

[9]張敬虎,熊遠著.豬微衛(wèi)星標記與雜種優(yōu)勢的關(guān)聯(lián)分析和QTL定位[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學,2005：36-37.

[10]烏蘭.新疆山羊微衛(wèi)星標記多態(tài)性及其與部分經(jīng)濟性質(zhì)相關(guān)性的研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學,2012：21-22.

[11]Botstein D.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism[J].Hum Genet,1980,32：314-331.

[12]陳幼春.關(guān)于分子水平下遺傳距離檢測的模型和適宜樣本數(shù)的討論[C].第五次全國畜禽遺傳標記研討會論文集,北京, 1996：130-132.

[13]閏路娜,張德興.種群微衛(wèi)星DNA分析中樣本量對各種遺傳多樣性度量指標的影響[J].動物學報,2004,50(2)：279-290.

[14]Nei M.Estimation of average heterozygosis and genetic distance from a small number of individuals[J].Genetics,1978,89：583-590.

[15]Barker J S F.A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds[C].Proc 5th World Genet Appl Livest Prod,1994：501-508.

[16]Li S J,Yang S H,Zhao S H,Fan B,Yu M et al.Genetic diversity analyses of 10 indigenous Chinese pig populations based on 20 microsatellites[C].JournalofAnimalScience,2004,82：368-374.

[17]Zhang G X,Wang Z G,Sun F Z,Chen W S,Yang G Y et al.Genetic diversity of microsatellite loci in fifty-six Chinese native pig breeds[J].Acta genetica sinica,2003,30：225-233.

Relationship between genetic heterozygosity and reproductive traits in Du Min hybridization pigs

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WANG Xibiao,MU Chuntang,HAO Xiaoyan,DI Shengwei,CUI Shiquan,TONG Xianwei,YANG Qingshan
(School of Animal Sciences and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The polymorphism of 25 microsatellites was analyzed in three generation Du Min pigs,Average heterozygosity and other genetic parameters were calculated in each group,reproductive traits(litter size,birth weight,neonatal litter weight,21 day weight,21 day litter weight),correlation index and changing trend between microsatellite heterozygosity and reproductive traits were also calculated.The results showed that average heterozygosity was gradually decreased with the increase of generation;The variation trend of average heterozygosity was consistent with that of each reproductive trait;There was a significantly positive correlation between genetic heterozygosity and neonatal litter weight,litter size(P＜0.01),the correlation indices were 0.615 and 0.640,respectirely.It followed that the change of genetic heterozygosity of breeding population has great effect on litter size and neonatal litter weight.

Du Min pig;microsatellite maker;heterozygosity;reproductive traits

S828

A

1005-9369（2015）09-0083-04

時間2015-9-23 9：38：13[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.016.html

王希彪,牟春堂,郝小燕,等.杜民雜交豬基因雜合度與繁殖性狀關(guān)系研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(9):83-86.

Wang Xibiao,Mu Chuntang,Hao Xiaoyan,et al.Relationship between genetic heterozygosity and reproductive traits in Du Min hybridization pigs[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):83-86.(in Chinese with English abstract)

2015-01-28

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目（12541007）

王希彪（1965-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為豬的育種與生產(chǎn)。E-mail：wxibiao1967@aliyun.com