吳雪君，譚國(guó)飛，徐志勝，王 楓，熊愛(ài)生

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京

210095）

木質(zhì)素是陸生植物中重要的聚合物，僅次于纖維素。木質(zhì)素主要有3種單體類(lèi)型：對(duì)－羥基苯基木質(zhì)素（P－h(huán)ydroxyphenyl lignin，H－木質(zhì)素）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（guaiacyl lignin，G－木質(zhì)素）和紫丁香基木質(zhì)素（syringyl lignin，S－木質(zhì)素）［1］。木質(zhì)素屬于酚類(lèi)高分子化合物，存在于木質(zhì)部中，不僅有利于植物運(yùn)輸水分，而且能增加細(xì)胞壁厚度，增強(qiáng)植物機(jī)械支持 力［2－3］。羥 基 肉 桂 酰 轉(zhuǎn) 移 酶（hydroxycinnamoyl－CoA）作為細(xì)胞色素P450家族的成員之一，同時(shí)具有莽草酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（shikimate hydroxycinnamoyl－transferase）和奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（quinate hydroxycinnamoyl－transferase）活 性，該酶在木質(zhì)素的生物合成進(jìn)程中研究較晚［4－5］。莽草酸／奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（shikimate／quinate hydroxycinnamoyl－transferase，HCT）是催化對(duì)－香豆酰輔酶A 生成咖啡酰輔酶A 的關(guān)鍵酶，在苯丙烷C3羥基化的上、下游起著重要的雙重調(diào)節(jié)作用［6－7］。莽草酸／奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶也是H－木質(zhì)素和G／S－木質(zhì)素合成時(shí)進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化的調(diào)控物質(zhì)。在高等植物中，P450家族成員在一些物質(zhì)的生物合成中發(fā)揮重要的作用，例如苯丙烷類(lèi)、生物堿、萜類(lèi)、生氰糖苷類(lèi)、激素等［7－8］。編碼HCT 的基因與很多其他P450基因家族成員一樣，表達(dá)受外界環(huán)境誘導(dǎo)，如：輻射、機(jī)械損傷、高溫低溫和化學(xué)誘導(dǎo)劑等［9－10］。

鴨兒芹（Cryptotaenia japonica Hassk），為傘形科（Apiaceae）鴨兒芹屬（Crypototaenia）的藥食兩用植物，嫩苗葉及葉柄可供蔬食，是一種較為重要的蔬菜［11］，已成為日本十大蔬菜之一。主產(chǎn)河北、安徽、江蘇、浙江、貴州、福建、江西、廣東、廣西、湖北、湖南等地，喜生于林下陰濕處。全草及果可入藥，有祛風(fēng)止咳、活血化瘀、消炎止癢之功效，治感冒咳嗽、肺炎、肺囊腫、淋病、疝氣、風(fēng)火牙痛等。目前，生產(chǎn)上栽培種多為引自日本的白莖（柄）鴨兒芹［12］。野生鴨兒芹在進(jìn)行夏季栽培時(shí)，往往會(huì)受到高溫的影響，導(dǎo)致食用器官木質(zhì)化，嚴(yán)重影響鴨兒芹的品質(zhì)，低溫雖然能延遲木質(zhì)素的產(chǎn)生，但影響鴨兒芹產(chǎn)量［13］。

本研究以貴州鴨兒芹為研究對(duì)象，克隆與木質(zhì)素合成相關(guān)的CjHCT 基因，并對(duì)其組織特異性及生長(zhǎng)過(guò)程中主要面臨的4種不同溫度進(jìn)行不同時(shí)間段處理，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)該基因的表達(dá)情況，為中國(guó)鴨兒芹人工栽培溫度調(diào)控提供參考。

1 材料和方法

1．1 植物材料及處理

實(shí)驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的貴州省野生鴨兒芹種子，種子催芽后，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室。取2月齡鴨兒芹植株，剪取其生長(zhǎng)健康的第4片葉片用于葉片總RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于克隆CjHCT基因。并對(duì)2月齡植株分別進(jìn)行10℃、18℃、30℃和38 ℃處理0、0．5、1、2、4、8、12和24h，提取第4片成熟真葉葉片組織和葉柄組織的RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，用于實(shí)時(shí)定量PCR。

1．2 方 法

1．2．1 鴨兒芹CjHCT 基因克隆 利用RNA simple Total RNA Kit（北京Tiangen公司）試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)的步驟提取鴨兒芹總RNA：利用Prime Script RT reagent Kit（大連TaKaRa公司）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

以毛白楊HCT 基因（登錄號(hào)XM＿006368430．1）［14］和擬南芥HCT 基因（登錄號(hào)NM＿124270．3）［15］為參考序列，將兩條參考序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，用Premier 5．0軟件在兩條參考基因序列較一致區(qū)域，開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）外設(shè)計(jì)上游引物CjHCTF（5′－ATACTTTCTCCACCTACTTTCACC－3′）和 下 游 引 物CjHCTR（5′－GTGCGTGTCTTCAAATGTCATAC－3′）。PCR 克 隆 反 應(yīng) 條件為94 ℃預(yù)變性4min，然后94℃變性30s，54℃退火60s，72 ℃延伸1．5min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物?；厥蘸蟮腜CR 產(chǎn)物連接到pMD19－T 載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。隨后進(jìn)行質(zhì)粒的酶切與鑒定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。

1．2．2 序列分析 將克隆得到的CjHCT 基因，利用BioXM 2．6軟件對(duì)其可閱讀框長(zhǎng)度進(jìn)行預(yù)測(cè)，并翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。利用NCBI 網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST 程序，進(jìn)行CjHCT基因和氨基酸序列的同源性分析；采用DNAMAN軟件對(duì)CjHCT 基因和氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和酸堿氨基酸統(tǒng)計(jì)等分析；用MEGA5 軟件繪制進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行編輯成圖［16］；用 ExPASy 的SWISS－MODEL WORKSPACE（http：／／swiss－model．expasy．org）程序預(yù)測(cè)CjHCT 蛋白三維結(jié)構(gòu)。

1．2．3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)和基因表達(dá)分析 實(shí)時(shí)定量PCR 采用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKa－Ra公司），按照操作說(shuō)明進(jìn)行。相對(duì)定量使用參照基因的ΔCT法，表達(dá)差異等于2－ΔCT，ΔCT＝CT目標(biāo)基因－CTactin。相對(duì)定量是基于處理和對(duì)照之間目標(biāo)基因?qū)⒖蓟虮磉_(dá)量的比較。采用iQTM5software和iQTM5Real－time PCR System 完成熒光定量PCR。根據(jù)克隆到的CjHCT 基因序列，設(shè)計(jì)熒光定量檢測(cè)引物，上游引物CjHCTBDF（5′－CGTCGGAATCTGTGGAACGCTAA－3′）和下游引物CjHCTBDR（5′－CCTCCCAGCCATAGGATAGAACG－3′）。用鴨兒芹actin基因作為內(nèi)參基因，其引物為actinF（5′－CTGCAAAGAGCAGCTCTTCTGTGGA－3′）和actinR（5′－TGTAAGTTGTCTCGTGGATTCCTGC－3′）［13］，目 標(biāo) 基 因與actin基因一起擴(kuò)增。基因表達(dá)情況及分析采用Microsoft Excel 2007和IBM SPASS 20．0進(jìn)行［13］。

2 結(jié)果與分析

2．1 鴨兒芹CjHCT 基因的克隆

以鴨兒芹cDNA 為模板進(jìn)行克隆，得到一條約1 400bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1），將克隆得到的第1～3泳道目的基因條帶的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，3個(gè)泳道獲得的CjHCT 基因序列結(jié)果一樣，長(zhǎng)度均為1 410bp。通過(guò)預(yù)測(cè)，其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 290 bp，可編碼429個(gè)氨基酸（圖2）。進(jìn)一步分析顯示，其中酸性氨基酸為72個(gè)，堿性氨基酸為54個(gè)，蛋白分子質(zhì)量為47．58kD，等電點(diǎn)為6．67。通過(guò)對(duì)其蛋白質(zhì)親水／蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)可知，該蛋白質(zhì)親水性區(qū)域多于疏水性區(qū)域，該蛋白質(zhì)可能屬于親水性蛋白質(zhì)。

2．2 鴨兒芹與其他植物CjHCT氨基酸序列比較

圖1 鴨兒芹CjHCT 基因的克隆M．DL2000；1～3．PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．1 PCR amplification of CjHCTgene fromC．japonica Hassk M．DL2000；1－3．Products of PCR

將獲得的CjHCT 翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，與胡蘿卜（Daucus carota，GenBank登錄號(hào)KR559236）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana，GenBank 登 錄 號(hào)ABH04595．1）和 番 茄（Solanum lycopersicum，Gen－Bank登錄號(hào)XP＿004235891．1）HCT氨基酸序列進(jìn)行比較。四者HCT 基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度不同，編碼氨基酸長(zhǎng)度也不相同（圖3）。其中傘形科鴨兒芹和胡蘿卜HCT 基因均編碼429個(gè)氨基酸，擬南芥HCT 基因編碼433個(gè)氨基酸，番茄HCT 基因編碼435個(gè)氨基酸。四者氨基酸序列一致性高達(dá)89．77%，其中鴨兒芹HCT氨基酸與胡蘿卜的一致性為96．06%，而鴨兒芹HCT氨基酸與番茄一致性為79．57%，與擬南芥一致性為75．49%。說(shuō)明同屬于傘形科的胡蘿卜與鴨兒芹HCT 氨基酸進(jìn)化關(guān)系較近。鴨兒芹CjHCT蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析利用SWISS－MODEL，以中?？Х菻CT（PDB ID：4g2m．1）為模型對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列同源建模，預(yù)測(cè)了該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4）顯示，鴨兒芹CjHCT蛋白結(jié)構(gòu)序列與中?？Х菻CT有85．31%的一致性。

圖2 鴨兒芹CjHCT 基因序列及編碼氨基酸序列＊表示終止密碼子Fig．2 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of CjHCTfromC．japonica Hassk＊represents the stop codon

圖3 不同植物和鴨兒芹CjHCT 氨基酸序列比對(duì)Fig．3 Alignment of amino acid sequences of HCT fromC．japonica Hassk and other plants

2．3 CjHCT的進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步研究CjHCT 進(jìn)化的關(guān)系，將鴨兒芹CjHCT 氨基酸序列與其它25種植物的HCT 氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖5）。結(jié)果表明：同為傘形科的胡蘿卜與鴨兒芹進(jìn)化關(guān)系較近，不同科植物中的CjHCT 氨基酸進(jìn)化較保守，如豆科的大豆、蝶豆、紅車(chē)軸草、鷹嘴豆和銀合歡在同一分支上，茄科的番茄、馬鈴薯、絨毛煙草和普通煙草在同一個(gè)分支上。

圖4 利用SWISS－MODEL對(duì)鴨兒芹CjHCT 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig．4 Tertiary structure prediction of the CjHCT fromC．japonica Hassk by SWISS－MODEL

2．4 CjHCT 基因在不同組織中的表達(dá)分析

分別取鴨兒芹植株的根、葉柄、葉、花組織，通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)CjHCT 基因在不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CjHCT 基因在鴨兒芹根中表達(dá)量最高，其次為葉柄，葉和花中表達(dá)量最低（圖6）。根中的表達(dá)量分別為葉和花的7．826和7．706倍，葉柄中表達(dá)量分別為葉和花的4．496和4．429倍。

2．5 鴨兒芹CjHCT 基因在不同溫度下的表達(dá)

為了研究溫度對(duì)鴨兒芹產(chǎn)生的影響，取其2月齡健壯幼苗于不同溫度下分別處理不同時(shí)間，熒光定量PCR 檢測(cè)CjHCT 基因在葉片和葉柄中的相對(duì)表達(dá)量（以0h為對(duì)照，表達(dá)量設(shè)為1）。

圖5 不同植物HCT 進(jìn)化樹(shù)標(biāo)尺代表遺傳距離Fig．5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the HCT from different plants species The scale bar represents genetic distance

葉片檢測(cè)結(jié)果表明（圖7），在0．5h時(shí)，10 ℃時(shí)表達(dá)量下調(diào)，而18 ℃、30 ℃和38 ℃處理表達(dá)量較高，其中30 ℃處理表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他處理，提高達(dá)到24．89倍，而10 ℃、18 ℃、38 ℃處理下表達(dá)量 比對(duì)照分別提高0．26、3．33、9．04倍。在1h時(shí)，18 ℃處理表達(dá)量下調(diào)，而在30 ℃和38 ℃處理下表達(dá)量較高，38 ℃處理表達(dá)量最高。在2～4h時(shí)，18 ℃和38 ℃處理表達(dá)量相似，而且10 ℃和30 ℃處理的表達(dá)量均高于前兩者，30 ℃處理表達(dá)量最高。而在8～12h時(shí)，30 ℃和38 ℃處 理 表 達(dá) 量 下 調(diào)，30 ℃處理表達(dá)量最低。但在12h時(shí)，所有處理的表達(dá)量都高于8h處理。在24h時(shí)，38 ℃處理表達(dá)量最低，10 ℃、18 ℃和30 ℃處 理 下 表 達(dá) 量 都 高 于38 ℃處理。在10 ℃和18 ℃處理下CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量在12h時(shí)達(dá)到峰值，且18 ℃處理表達(dá)量較低。在10 ℃和18 ℃處理下CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量在24h時(shí)降低。在30 ℃與38 ℃處理下CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量在0．5h時(shí)達(dá)到峰值，且30 ℃下表達(dá)量較高。

圖6 鴨兒芹不同組織中CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)不同大小寫(xiě)字母分別表示0．01和0．05水平差異顯著性Fig．6 Relative expression levels of CjHCTgene in different tissues of C．japonica Hassk Values with different normal and capital letters mean significant difference at 0．05and 0．01levels

圖7 不同溫度處理下鴨兒芹葉片中CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)水平同一溫度處理不同大小寫(xiě)字母分別表示0．01和0．05水平差異顯著性；下同F(xiàn)ig．7 Relative expression analysis of CjHCTgene in C．japonica Hassk leaves with different temperature treatments Values with different normal and capital letter mean significant difference at 0．05and 0．01level under the same temperature treatment．The same as below

葉柄檢測(cè)結(jié)果表明（圖8），10 ℃處理表達(dá)量全部下調(diào)，且在4～24h時(shí)表達(dá)量較為相近，2h處理表達(dá)量為該溫度下所有處理表達(dá)量峰值，與對(duì)照相比無(wú)極顯著性差異。18 ℃處理表達(dá)量全部上調(diào)，且在0～4h時(shí)表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在1h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照相比已有極顯著性差異。30 ℃和38 ℃處理在0．5h時(shí)表達(dá)量均上調(diào)且有極顯著性差異，其中38℃比30℃處理表達(dá)量更高，分別提高3．02和2．44倍；在1h時(shí)，38 ℃和30 ℃處理表達(dá)量相似；在2h 時(shí)，前者表達(dá)量最高，提高到3．55倍。在18 ℃處理下，CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量在4h時(shí)達(dá)到峰值；在30℃處理下，CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量在0．5h 時(shí)達(dá)到峰值；在38 ℃處理下，CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量在2h 時(shí)達(dá)到峰值，且0．5h時(shí)表達(dá)量高于30℃處理下CjHCT 基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 討 論

CjHCT 基因在植物木質(zhì)素合成中具有重要作用［17－20］。木質(zhì)素的合成過(guò)程需要受到多個(gè)基因的調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。當(dāng)該過(guò)程中某個(gè)酶的表達(dá)活性降低時(shí)，其他酶的表達(dá)活性也會(huì)受到影響［21－22］。木質(zhì)素3種單體的合成均起始于莽草酸代謝中生成的苯丙氨酸（phenylalanine），苯丙氨酸通過(guò)苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）生成反式肉桂酸（trans－cinnamic acid）。此外，在該生物合成進(jìn)程中，對(duì)－香豆酰輔酶A 在羥基肉桂酸轉(zhuǎn)移酶（HCT）和肉桂酸－3－羥化酶（C3H）的催化下，最終合成咖啡酰輔酶A（caffeoyl CoA）?？Х弱］o酶A 在O－甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）和阿魏酸－5－羥化酶（F5H）的作用下，依次生成阿魏酰輔酶A（feruloy－l CoA）和5－羥 基 阿 魏 酰 輔 酶A（5－h(huán)ydroxyferuloy－l CoA）。5－CoA苯環(huán)上5位的羥基被OMT家族的COMT 或CCoAOMT 甲基化后，經(jīng)肉桂酰輔酶A 還原酶（CCR）和肉桂醇脫氫酶（CAD）的催化后形成木質(zhì)素的直接單體［23］。例如，研究表明轉(zhuǎn)基因煙草中PAL 表達(dá)活性降低后，木質(zhì)素的含量也隨之降低，但是該煙草的正常生長(zhǎng)發(fā)育被抑制［24］。如果以植物能夠進(jìn)行正常生長(zhǎng)為條件，以降低木質(zhì)素含量，提高S／G（紫丁香基木質(zhì)素／愈創(chuàng)木基木質(zhì)素）比值等為衡量標(biāo)準(zhǔn)，那么C4 H、HCT、CCoAOMT、F5 H 和CAD 等都是可用的理想基因。例如在苜蓿中 利 用 反 義RNA 技 術(shù) 抑 制C3 H、C4 H 和COMT的表達(dá)會(huì)使木質(zhì)素的含量明顯降低，提高單體比值［25］。還有一種被稱(chēng)為O－甲基轉(zhuǎn)移酶的物質(zhì)，即咖啡酰輔酶A－3－O－甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAoMT），當(dāng)采用反義RNA 技術(shù)抑制煙草CcoAOMT 活性時(shí)，會(huì)使木質(zhì)素的含量降低并且改變其組分成分。例如紫丁香基木質(zhì)素會(huì)有所增加［26－27］。Sewalt又對(duì)抑制PAL 或C4 H 表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了進(jìn)一步的研究并加以比較，結(jié)果表明在煙草中反義轉(zhuǎn)入PC4 HCCoAOMT 基因，能有效降低木質(zhì)素的含量［28－29］。

人工栽培鴨兒芹的目的是為了采摘其嫩葉和葉柄，延緩鴨兒芹木質(zhì)素的合成有利于提高鴨兒芹品質(zhì)。在葉柄處理較低溫度（10 ℃和18 ℃）時(shí)基因表達(dá)量比較高溫度（30 ℃和38 ℃）時(shí)基因表達(dá)量更低更慢，根據(jù)苜蓿中的研究可以推測(cè)出，較低溫度處理時(shí)鴨兒芹中木質(zhì)素含量可能減少［1］。該實(shí)驗(yàn)意義在于初步研究低溫栽培鴨兒芹能抑制其體內(nèi)CjHCT基因的表達(dá)，與鴨兒芹為冷涼性蔬菜的結(jié)論一致［11］。鴨兒芹栽培過(guò)程中，高溫促進(jìn)鴨兒芹的生長(zhǎng)發(fā)育，且較易導(dǎo)致鴨兒芹木質(zhì)化程度提前出現(xiàn)，同時(shí)溫度過(guò)高，也會(huì)阻礙鴨兒芹生長(zhǎng)發(fā)育，低溫雖然延遲木質(zhì)素的合成，也會(huì)出現(xiàn)鴨兒芹生長(zhǎng)發(fā)育不良，產(chǎn)量低等現(xiàn)象［23］。因此還需要進(jìn)一步研究溫度對(duì)鴨兒芹生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為人工種植鴨兒芹溫度控制提供借鑒。

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