丁 偉，周 蔥，劉 超，何家軒，賈 兵，朱立武

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥230036）

赤霉素（gibberellins acid，GA）是一類存在于植物整個(gè)生命周期的內(nèi)源激素，調(diào)控植物的生長發(fā)育過程。GA 可促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長，誘導(dǎo)開花，打破植物休眠，促進(jìn)雌花分化，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)生長素IAA水平從而促進(jìn)養(yǎng)分積累，促進(jìn)某些梨樹座果和單性結(jié)實(shí)，延緩葉片衰老等［1－2］。GA2－氧化酶（GA2－oxidase，GA2ox）是GA 合成過程中關(guān)鍵調(diào)控酶，以2－酮戊二酸和氧分子為底物、Fe2＋和抗壞血酸為輔助因子的雙加氧酶，在GA 合成過程中，將活性GA 氧化為無活性GA，維持著植物體內(nèi)生物活性GA 和無活性GA 的平衡，受GA 正反饋調(diào)節(jié)［3－4］。

DELLA蛋白是一類C 端非常保守、N 端含有Asp－Glu－Leu－Leu－Ala結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族。DELLA 蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，與某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用，抑制赤霉素效應(yīng)，間接或直接調(diào)節(jié)GA 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［5］。Fu等［6－9］發(fā)現(xiàn)DELLA 蛋白對赤霉素、茉莉酸、脫落酸、乙烯和生長素等多種激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程都有抑制作用，抑制植物的發(fā)育；Achard等［10］研究擬南芥DELLA 蛋白在植物激素處理和逆境脅迫下的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DELLA 蛋白可以實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)植物生長以響應(yīng)外界環(huán)境變化，以此提高植物的抗逆性。

GID1（gibberellin insensitive dwarf）是一種GA 受體，定位于細(xì)胞核內(nèi)，是一種可溶性受體［11］。GID1與活性GA 結(jié)合形成GA－GID1二聚體，二聚體上N端構(gòu)象發(fā)生改變，易于同DELLA 蛋白連接，形成GA－GID1－DELLA三聚體，然后SCF 聚合體標(biāo)記該三聚合體，誘導(dǎo)泛素26S蛋白酶體降解DELLA 蛋白，解除DELLA 蛋白對基因轉(zhuǎn)錄的阻遏作用，產(chǎn)生“赤霉素效應(yīng)”［12－14］。

‘碭山酥梨’種植面積約占中國梨栽培面積的1／4，其主產(chǎn)區(qū)在西北和黃河故道地區(qū)。該地區(qū)梨園缺鐵現(xiàn)象嚴(yán)重影響了梨品質(zhì)和產(chǎn)量的提高［15－16］。Romheld等［17］研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵脅迫導(dǎo)致向日葵根系的IAA 含量顯著提高，Li等［18］用IBA 或IAA 處理正常供鐵植物，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)類似植物的高鐵還原酶的活性。Romera［19］將乙烯合成前體ACC 加入缺鐵植株后，顯著促進(jìn)高鐵還原酶活性和根毛發(fā)育。Graziano［20］則研究了NO 對植物缺鐵的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)NO 能促進(jìn)缺鐵條件下植株的各種缺鐵響應(yīng)，但是不能誘導(dǎo)正常供鐵植株產(chǎn)生缺鐵相關(guān)的反應(yīng)。

關(guān)于缺鐵條件下GA 含量變化及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)研究目前尚未見報(bào)道。試驗(yàn)以‘碭山酥梨’組織培養(yǎng)試管苗葉片為試材，測定不同程度缺鐵脅迫下葉片內(nèi)源GA 含量；采用RT－PCR 技術(shù)，分析GA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因GA2ox、受體蛋白GID1的4個(gè)等位基因和DELLA 蛋白4個(gè)等位基因相對表達(dá)量變化；研究缺鐵脅迫下梨葉片GA 水平和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的關(guān)系，探討GA 及其轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在梨樹缺鐵脅迫下的作用。

1 材料和方法

1．1 材 料

參考Pestana M 設(shè)計(jì)［21］，將‘碭山酥梨’組培生根苗移植至MS培養(yǎng)基，其中不含鐵元素，F(xiàn)e2＋濃度另設(shè)4個(gè)處理水平。Fe40：添加40μmol／L Fe－EDTA；Fe20：添加20μmol／L Fe－EDTA；Fe10：添加10μmol／L Fe－EDTA；Fe0：不添加Fe－EDTA。處理的苗木置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度（白天／夜晚）25℃／20℃，光照時(shí)間每天15h，光照度2 100lx，相對濕度70%，培養(yǎng)28d后，F(xiàn)e40葉片表現(xiàn)正常，F(xiàn)e20葉片黃化不明顯，F(xiàn)e10 葉邊緣出現(xiàn)明顯的失綠，F(xiàn)e0葉片黃化嚴(yán)重，呈黃白色（圖1）。將不同處理葉片用液氮處理后，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?2］。

1．2 方 法

1．2．1 GA 含量測定 應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測法ELISA（Enzyme－Linked ImmunoSorbent Assay）測定葉片中GA 含量［23］。

圖1 不同鐵離子含量培養(yǎng)基中葉片黃化癥狀程度Fig．1 Leaf with symptom of iron－deficiency at MS medium at different iron concentrations

1．2．2 總RNA提取與GA2ox基因克隆 總RNA提取使用StarSpin Plant RNA Mini Kit試劑盒（購自Genstar公司），cDNA合成使用M－MLV RTase cDNA Synthesis Kit（購自大連寶生物工程有限公司）。通過NCBI查找GA2ox基因的同源序列，根據(jù)同源序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的特異片段回收，送到上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，獲得GA2ox基因的保守序列。根據(jù)保守序列按照TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司的3′－Full RACE Core Set with Prime ScriptTMRtase和5′－Full RACE Kit with Tap試劑盒設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30s；52℃退火45s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1．2．3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取不同程度缺鐵葉片的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得mRNA 第一鏈。根據(jù)獲得的GA2ox全長序列，以及從梨基因組數(shù)據(jù)庫中得到GID1 的4 個(gè)等位基因?yàn)镚ID11（登錄號Pbr006571．1）、GID13（登錄號Pbr041942．1）、GID15（登錄號Pbr019693．1）和GID16（登錄號Pbr029795．1），DELLA蛋白4個(gè)等位基因DELLA1（登 錄 號Pbr037895．1）、DELLA2（登 錄 號Pbr040316．1）、DELLA4（登錄號Pbr004513．1）和DELLA6（登錄號Pbr037896．1）（http：／／peargenome．njau．edu．cn：8004／default．a(chǎn)sp？d＝4＆m＝2），使用Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物（表1）。使用ABI STEPONE熒光定量PCR儀和Takara 公司SYBR?PremixExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑進(jìn)行熒光定量PCR 分析，采用20μL 反應(yīng)體系：SYBRTMPremixExTaq10μL，正、反向引物（10 μmol·L－1）各0．8μL，熒光染料0．4μL，cDNA 模板1μL，ddH2O 7．0μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品4次重復(fù)。以GAPDH基因作為內(nèi)參，使用2－△△Ct法求待測樣品相對表達(dá)量。

表1 所用引物序列Table 1 The sequences of the primers used in the experiment

1．2．4 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 17．0軟件對葉片中GA 含量、基因相對表達(dá)量差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同程度缺鐵葉片中GA 含量

各處理苗木培養(yǎng)28d后，F(xiàn)e40葉片表現(xiàn)正常，F(xiàn)e20 葉片黃化不明顯，其GA 含量分別為7．29 ng／g和8．13ng／g，兩者差異不顯著。Fe10僅葉緣出現(xiàn)明顯黃化，GA 含量顯著高于Fe40與Fe20處理；而未添加Fe－EDTA 的葉片黃化嚴(yán)重，GA 含量也顯著高于Fe10處理。由此可見，葉片內(nèi)源GA 水平受到缺鐵脅迫的影響，隨著植株缺鐵程度加重，葉片GA 含量增加（圖2）。

2．2 GA 2ox 基因的克隆

對GA 氧化酶基因GA2ox進(jìn)行克隆，首先得到保守序列，該擴(kuò)增片段大小為576bp；將此序列在NCBI上進(jìn)行BLASTn比對，結(jié)果它與西洋梨（登錄號JF441168）的GA2ox最接近，一致性達(dá)到99%。3′－RACE擴(kuò)增片段大小為536bp，比對結(jié)果與蘋果（登錄號FJ571521）的GA2ox基因一致性最大，達(dá)到97%；5′－RACE 擴(kuò)增片段大小為585bp，與蘋果（登錄號FJ571521）的GA2ox基因一致性達(dá)到99%（圖3）。

將2個(gè)片段拼接得到編碼區(qū)全長1 014bp的基因，在NCBI上比對，發(fā)現(xiàn)與西洋梨的GA2ox（登錄號JF441168）基因一致性達(dá)到99%。依據(jù)上述特征判斷，本研究獲得了‘碭山酥梨’GA2ox（登錄號KJ008976）基因完整cDNA 全長序列，共含337 個(gè)氨基酸序列。

2．3 不同程度缺鐵葉片中GA 2ox 基因差異表達(dá)分析

圖2 不同缺鐵處理葉片中內(nèi)源GA 含量Fig．2 The endogenous GA content in leaves of different iron－deficiency treatment

Fe20處理的GA2ox基因相對表達(dá)量顯著高于Fe40；Fe10和未添加Fe－EDTA的GA2ox基因相對表達(dá)量與Fe40 處理無顯著差異。與正常植株相比，輕度的缺鐵脅迫會使葉片GA2ox基因表達(dá)量增加；中度或重度缺鐵時(shí)，GA2ox基因表達(dá)量并未呈現(xiàn)出顯著差異（圖4）。由此可見，缺鐵脅迫并不一定能促進(jìn)活性GA 向無活性GA 轉(zhuǎn)化。

2．4 不同程度缺鐵葉片中GA 受體GID1 等位基因表達(dá)分析

在不同程度缺鐵葉片間，GID11 和GID13 的相對表達(dá)量均達(dá)到顯著差異；而GID15 和GID16基因在Fe40和Fe20處理中相對表達(dá)量無顯著性差異，隨著缺鐵程度的加重，兩者相對表達(dá)量均顯著高于Fe40處理（圖5）。

相關(guān)分析結(jié)果顯示，GA 含量與GA 受體蛋白GID1的4個(gè)等位基因相對表達(dá)量呈正相關(guān)，相關(guān)關(guān)系均達(dá)到顯著水平，相關(guān)系數(shù)分別為0．987 6、0．987 6、0．982 4和0．983 9。

2．5 不同程度缺鐵葉片中DELLA 蛋白等位基因表達(dá)

DELLA 蛋白的4個(gè)等位基因中，僅DELLA6在不同缺鐵程度葉片間相對表達(dá)量差異不顯著。DELLA1 在Fe20 與Fe10 處理中差異不顯著；DELLA2在Fe10與Fe0、Fe40與Fe20處理中差異不顯著；而DELLA4在Fe40、Fe20和Fe10處理中相對表達(dá)量無顯著差異（圖6）。

圖3 GA2ox 基因cDNA 序列擴(kuò)增Fig．3 Amplification of cDNA sequence of GA2oxgene

圖4 不同缺鐵處理葉片中GA 2ox 基因相對表達(dá)量Fig．4 Relative expression level of GA 2ox gene in leaves with iron－deficiency at different degrees

圖5 不同缺鐵處理對葉片中GID1等位基因相對表達(dá)量的影響Fig．5 Relative expression level of GID1alleles in leaves with iron－deficiency at different degrees

圖6 缺鐵處理對葉片中DELLA 蛋白等位基因相對表達(dá)量的影響Fig．6 Effect of the different iron－deficiency on the relative expression quantity of DELLA protein gene alleles

與DELLA 蛋白的其他3 個(gè)等位基因相比，DELLA1隨著缺鐵程度加重，相對表達(dá)量逐漸增加，說明DELLA1基因?qū)θ辫F脅迫比較敏感。

3 討 論

3．1 缺鐵脅迫條件下GA 的作用及與GA 2ox 基因的關(guān)系

梨樹缺鐵癥狀首先出現(xiàn)在幼葉上，輕者葉片邊緣失綠黃化，重者整個(gè)葉片黃化，直至葉片全部變?yōu)辄S白色、出現(xiàn)褐色銹斑且葉緣枯焦，引起葉片脫落，致使枝條枯死，甚至植株死亡［24］。Zhou等［25］發(fā)現(xiàn)GA 可以延緩葉片中葉綠素降解、緩解失綠；Lers等［26］研究認(rèn)為GA 可以延緩蛋白質(zhì)和RNA 的分解，延遲葉片衰老。

GA2ox基因是調(diào)控GA 分解的關(guān)鍵酶，它可以促進(jìn)活性GA 轉(zhuǎn)化為無活性GA。但是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉片內(nèi)源GA 水平隨著植株缺鐵程度加重而增加，而GA2ox基因表達(dá)量并未隨之上升。表明缺鐵脅迫條件下，葉片中GA 的總量是增加，可能是缺鐵誘導(dǎo)了內(nèi)源GA 合成。在缺鐵脅迫下，通過外源GA的應(yīng)用是否能增加梨抗缺鐵能力有待進(jìn)一步研究。

3．2 缺鐵脅迫葉片中GA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，GID1作為GA 的受體，在重度缺鐵處理葉片中，其4個(gè)等位基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，與內(nèi)源GA 含量顯著上升相一致，使GA 與GID1結(jié)合成二聚體的數(shù)量增加。形成的GA－GID1二聚體，再同DELLA 蛋白連接，成為GA－GID1－DELLA 三聚體，然后激活泛素26S 蛋白酶降解DELLA 蛋白，解除DELLA 蛋白對生長的抑制作用，進(jìn)而產(chǎn)生“赤霉素效應(yīng)”。

Cao等［27］研究表明，DELLA 蛋白反向調(diào)控GA信號途徑。但是，本試驗(yàn)中DELLA基因表達(dá)水平并沒有隨著內(nèi)源GA 含量增加而降低。缺鐵脅迫同時(shí)誘導(dǎo)了梨葉片內(nèi)源GA 合成和DELLA 蛋白基因的表達(dá)，其中的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

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