廖 陽，閆榮玲，何永峰，龔令軍，殷小林

（湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州425199）

錳是植物所需微量元素的重要一員，它對細(xì)胞器正常結(jié)構(gòu)的維持，光合作用的氧化還原反應(yīng)以及體內(nèi)酶的激活等均具有重要意義［1］。但過量錳則形成一種不利于植物生長的脅迫逆境［2－6］。在一定脅迫程度和持續(xù)時(shí)間內(nèi)，植物可以通過多種機(jī)制抵御錳富集帶來的不利影響，并盡可能完成自身生命周期，但當(dāng)脅迫超過植物應(yīng)對能力后，則會在分子、細(xì)胞、器官、植株等多個(gè)水平表現(xiàn)出嚴(yán)重異常甚至死亡［7－9］。根系吸收的錳離子會向上運(yùn)輸至莖、葉等器官，進(jìn)入繁殖期后則繼續(xù)向生殖器官轉(zhuǎn)移、分配，進(jìn)而可能影響植株的繁殖能力。

垂序商陸（Phytolaccaamericana）是具錳超富集能力的多年生草本植物，其葉片中錳含量可超過25g·kg－1，遠(yuǎn)高于其他植物［10－11］。另外，垂序商陸還具有適應(yīng)性好、繁殖力強(qiáng)、生長速度快、地理分布廣、生物量大等眾多優(yōu)點(diǎn)，因此是開展錳污染土壤生物修復(fù)治理的理想植物種類［12］。迄今，已經(jīng)對高錳脅迫下垂序商陸體內(nèi)錳離子的富集規(guī)律，以及錳富集對植株組織結(jié)構(gòu)、生理特征的影響等方面作了初步 研究［9，11，13］。但這些研究所進(jìn)行的錳脅迫處理時(shí)間較短，且均在垂序商陸的非繁殖期進(jìn)行，目前還未見有關(guān)錳脅迫下垂序商陸生殖器官錳富集規(guī)律的報(bào)道，且錳在生殖器官內(nèi)的富集對植株的繁殖能力會產(chǎn)生怎樣的影響也還不明了。本研究試圖對上述問題進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 植株培養(yǎng)與處理

2013年5月，將采自湖南科技學(xué)院校園附近空地的72株長勢一致的野生垂序商陸幼苗栽于裝有河沙的塑料桶內(nèi)，所取河沙預(yù)先進(jìn)行了清洗和過篩。各組幼苗置于可避雨的臨時(shí)棚內(nèi)生長，棚四周與外界相通。幼苗分成3組，每組24株，每組設(shè)3次重復(fù)。其中一組為對照組，所澆霍蘭氏培養(yǎng)液不再額外添加錳離子（濃度為0.005 mmol／L），另兩組為處理組，依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［9，11］培養(yǎng)液中錳離子的濃度分別設(shè)置為0.1和1.0mmol／L（屬于輕度至中度脅迫水平），額外錳離子添加試劑為MnCl2·4H2O。營養(yǎng)液每5d澆灑1次，每桶均為0.5L，中間根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)補(bǔ)水。植株培養(yǎng)至2013年9月上旬實(shí)驗(yàn)結(jié)束，此時(shí)收獲各組植株所結(jié)種子。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 器官錳含量 2013年6月至8月標(biāo)記一批同步開花的花朵，跟蹤觀察其從閉合花蕾到結(jié)果以及果實(shí)（種子）整個(gè)成熟過程，并根據(jù)果實(shí)的表觀性狀（大小、顏色、果漿量等）在不同階段（6月25日、7月15日、7月28日、8月8日、8月18日、8月30日）進(jìn)行6次植株不同器官錳含量的測定。測定時(shí)，先用自來水沖洗干凈拔出的植株，再用去離子水洗2次，之后分離根、莖、葉、果實(shí)置于經(jīng)硝酸浸泡處理過的干凈研缽內(nèi)，于70℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后研磨至粉末狀，其中果實(shí)在研磨前分出一部分，分離出種子并在顯微鏡下確定種子表面無其他附著物，再次清洗并烘干后置于另一研缽內(nèi)研磨。研磨得到的植株不同部位粉末稱取0.1～0.2g經(jīng)硝酸與高氯酸4：1混合液充分消化后，用原子吸收分光光度法（WFX－1E2型原子吸收儀，北京）測定各器官錳含量。測定時(shí)儀器參數(shù)：波長279.5nm；燈電流3.0 mA；狹縫0.2nm；空氣流量6.5L／min；乙炔流量1.7L／min。

同時(shí)，在測定種子中錳含量基礎(chǔ)上，計(jì)算各次取樣種子中錳含量較前一次的變化率，計(jì)算公式為：變化率（%）＝（第N 次錳含量測量值－第N－1次測量值）×100／第N－1次測量值。

1.2.2 果汁中有機(jī)酸成分及含量 在最后一次采樣時(shí)，各處理組均選取顆粒飽滿的部分果實(shí)，撕開果皮后，輕輕擠壓收集果汁后離心（2 000r／min）取上清液。準(zhǔn)確吸取樣品120mL，濃縮至30mL 左右后，置于150mL 碘量瓶中，加入60mL 12.5%硫酸甲醇溶液（冷水浴冷卻和攪拌條件下，將20 mL 濃H2SO4緩慢加入160 mL 無水甲醇中搖勻制得）?；靹蚝?0 ℃（轉(zhuǎn)速150r／min）恒溫振蕩酯化24h。將甲酯化后的樣液置于150 mL 的分液漏斗中，用二氯甲烷萃取3 次（20mL×3），合并萃取液。用飽和氯化鈉溶液洗滌2 次（20mL×2），再用無水硫酸鈉（10g）脫水，靜置過夜后濾出硫酸鈉，濾液濃縮至30 mL，參照已有文獻(xiàn)使用氣質(zhì)聯(lián)用儀（島津QP2010S）進(jìn)行GC－MS分析［14］。

1.2.3 種子萌發(fā)率 收集不同錳離子濃度下各組植株顆粒飽滿的種子，于2014年4月進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。在硬質(zhì)玻璃培養(yǎng)皿中疊放兩張圓形濾紙，用去離子水充分潤濕濾紙。種子經(jīng)2.5%次氯酸鈉溶液浸種20min后用去離子水沖洗3次再置于濾紙上，每皿30 粒，每組設(shè)置3 次重復(fù)，蓋好皿蓋置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中等待萌發(fā)，跟蹤觀察并注意補(bǔ)水保持濾紙濕潤，于第10天統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。萌發(fā)率的計(jì)算公式為：

萌發(fā)率＝（發(fā)芽種子總數(shù)／供試種子總數(shù)）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003、SPSS19.0 以 及Sigmaplot10.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子成熟過程中果實(shí)與種子的表觀變化特征

各組垂序商陸植株5月中旬后不斷掛果，果內(nèi)所含種子（近似腎形）隨時(shí)間推移不斷成熟。在此過程中，果實(shí)的大小、重量、果汁量、顏色以及種子的大小顏色、硬度等性狀均不斷變化。其中，花（果）枝遠(yuǎn)端的果實(shí)生長速度較近端果實(shí)慢，果實(shí)顏色由最初的綠色逐漸變?yōu)樽厣僮兂勺罱K的黑色。果枝與果柄的顏色也逐漸由綠色變?yōu)闇\紅直至最終深紫色。果實(shí)中的果漿含量隨果實(shí)表觀變化表現(xiàn)為先增加后減少最后完全消失，僅剩透明薄皮包裹種子（果漿減少過程中，果皮形成越來越明顯的褶皺）。在此過程中，果實(shí)內(nèi)的種子從乳白半透明逐漸變?yōu)楹谏w積逐漸增大至芝麻粒大小且硬度不斷增加。圖1示對照組種子成熟過程的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)果實(shí)與種子的表觀狀態(tài)，各圖分別對應(yīng)實(shí)驗(yàn)的第1次（階段）至第6次（階段）取材，各次對應(yīng)的日期分別為6月25日、7月15日、7月28日、8月8日、8月18日和8月30日。跟蹤觀察過程中未發(fā)現(xiàn)錳處理組與對照組的果實(shí)和種子在表觀形態(tài)上表現(xiàn)出差異。

2.2 垂序商陸種子成熟過程中植株各器官錳含量動(dòng)態(tài)變化

對種子成熟過程中垂序商陸不同器官錳含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間推移對照組和處理組植株的根、莖、葉、果實(shí)（含種子）的錳含量均呈持續(xù)增加趨勢。種子內(nèi)錳含量的變化在對照與處理組之間存在差異：種子內(nèi)錳含量在對照組（0.005mmol／L）中于初期先出現(xiàn)少許下降（4.0%），之后持續(xù)增加，且在最后階段微弱增加（1.2%；圖2，A）；而處理組（0.1 mmol／L與1.0mmol／L）則整體變化趨勢相似，均先持續(xù)增加，并于8月8日達(dá)到最大值，到種子成熟末期再有所減少，且1.0mmol／L 組的變化幅度在各階段均大于0.1mmol／L組（圖2，B、C）。

圖1 對照組種子成熟過程中垂序商陸果實(shí)與種子的表觀變化Fig.1 Apparent change of fruits and seeds during seed maturation process of Phytolacca americana of control group

同時(shí)，處理間相比較，各器官錳含量隨培養(yǎng)環(huán)境錳離子濃度的升高而大幅明顯增加，同一器官不同濃度下錳含量始終表現(xiàn)為1.0 mmol／L 組＞0.1 mmol／L組＞0.005mmol／L 組（圖2）。另外，器官間相比較而言，種子成熟后期，各組不同器官錳含量高低順序均為種子＜莖＜根＜果實(shí)＜葉，果實(shí)的錳含量遠(yuǎn)高于種子中的錳含量（圖2），即果漿或果皮中分配和富集了大量的錳。

另外，GC－MS分析表明，果漿中的有機(jī)酸主要為草酸（占有機(jī)酸總量的95.5%）以及少量的2－羥基丙酸（占有機(jī)酸總量的4.5%；圖3、表1）；各處理組果汁有機(jī)酸成分相同，含量無明顯變化（P＞0.05，表1）。

圖2 不同錳濃度下垂序商陸各器官錳含量動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of the manganese content in different organs of P.americana

圖3 垂序商陸果汁中2－羥基丙酸（A）和草酸（B）GC－MS分析質(zhì)譜圖（1.0mmol／L組）Fig.3 Mass spectrometry of 2－h(huán)ydroxy propionic acid（A）and oxalic acid（B）in P.americanajuice（1.0mmol／L group）

圖4 不同錳濃度下垂序商陸種子在成熟過程中錳含量變化規(guī)律及其萌發(fā)率Fig.4 Comparison of manganese content change in seeds during the maturation process and seed germination rate of P.americanaamong different manganese concentrations

表1 不同濃度組果汁有機(jī)酸含量比較Table1 Comparison of the content of organic acid in fruit juice among different group with different manganese concentrations

2.3 錳脅迫對垂序商陸種子錳含量和萌發(fā)率的影響

圖4顯示，垂序商陸種子內(nèi)錳含量變化趨勢及變化程度在不同濃度間明顯不同。CK 組種子錳含量在初期出現(xiàn)少許下降（4.0%），且在最后階段微弱增加（1.2%）；2個(gè)不同濃度的錳脅迫處理組整體變化趨勢相似，且在后期均出現(xiàn)不同程度負(fù)增長；同時(shí)，所有各階段錳含量的變化率始終表現(xiàn)為1.0 mmol／L均大于0.1mmol／L。另外，0.005、0.1和1.0mmol／L 3個(gè)不同錳濃度下植株所結(jié)種子萌發(fā)率分別為97.8%、88.9%、78.8%，三者間差異極顯著（P＜0.01），即垂序商陸所處培養(yǎng)液錳濃度越高，種子萌發(fā)率則越低。

3 討 論

植物遭受錳脅迫后會發(fā)生積極靈敏的生理響應(yīng)，并通過區(qū)域化隔離、根系有機(jī)酸螯合、限制吸收與外排、抗氧化系統(tǒng)增強(qiáng)、離子間交互等多種機(jī)制來抵御錳脅迫［1，15］。不同植物對錳的耐受能力差異明顯，木本植物中的馬尾松（Pinusmassoniana）與山茶科植物，以及生長在被錳礦尾渣污染的土壤中的早熟禾（Poaannua）、鼠麴草（Gnaphaliumaffine）等物種耐性較強(qiáng)［4，16－17］。盡管如此，這些植物對錳的耐受與富集能力相比垂序商陸還是低得多。研究表明，垂序商陸植株體內(nèi)錳富集量遠(yuǎn)超人們對錳超累積植物的界定標(biāo)準(zhǔn)（10 000 mg／kg）［11，17］。本研究中未發(fā)現(xiàn)錳脅迫處理組垂序商陸植株果實(shí)出現(xiàn)表觀異常，即所設(shè)錳處理濃度均在其耐受范圍內(nèi)，這與已有報(bào)道相符［12－13］。同時(shí)，可能由于所設(shè)錳濃度較低，未形成導(dǎo)致出現(xiàn)嚴(yán)重生理機(jī)能障礙的嚴(yán)重脅迫，因此對照組與處理組植株的果汁中有機(jī)酸成分及含量沒有表現(xiàn)出顯著差異。

有研究表明，垂序商陸吸收的錳有87%～95%被轉(zhuǎn)移到地上部分［18］。當(dāng)植株進(jìn)入繁殖期形成花、果實(shí)、種子等生殖器官后，錳離子會繼續(xù)向這些新形成的器官轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)，垂序商陸生殖生長過程中各器官內(nèi)錳含量隨錳離子處理濃度的升高而增加，錳脅迫處理組植株各器官錳含量遠(yuǎn)高于對照組，且相同濃度下不同器官內(nèi)錳含量表現(xiàn)為種子＜莖＜根＜果實(shí)＜葉?？梢?，不同錳離子濃度（低濃度，≤1 mmol／L）下，根、莖、葉3個(gè)營養(yǎng)器官在繁殖期對錳的累積規(guī)律及各器官錳含量高低關(guān)系與非繁殖期類似，且葉片是錳在垂序商陸體內(nèi)累積的主要器官［12－13，19－20］。值得注意的是，果實(shí)錳含量遠(yuǎn)高于其內(nèi)部所包裹的種子的錳含量，推測垂序商陸的果汁內(nèi)富集了較高水平的錳，這可能與果漿高水溶性環(huán)境密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，垂序商陸葉細(xì)胞的液泡等高可溶性環(huán)境儲存了葉片中錳含量的絕大部分（74%～80%），從而緩解錳過量對葉細(xì)胞的傷害，也減輕了植株其他器官錳富集的壓力［21］。那么，其果汁的高水溶性環(huán)境是否也是一個(gè)重要的緩解錳脅迫的場所，其作用機(jī)制如何，這些還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

GC－MS分析顯示，垂序商陸果汁中存在豐富的有機(jī)酸，主要成分為草酸以及少量的2－羥基丙酸。有研究證明有機(jī)酸在植物根、葉的解錳毒中發(fā)揮了重要作用，特別是草酸因其與金屬離子有很強(qiáng)的親和力，因此是植物體內(nèi)與錳解毒機(jī)制密切相關(guān)的4種有機(jī)酸之一（另外3 種為檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸）［22］。因此，推測有機(jī)酸是垂序商陸果漿中可富集高水平錳的重要原因。鑒于果汁幾乎不參與植株的重要生理活動(dòng)，把大量錳轉(zhuǎn)移到果汁中對植株本身來說是有利的。另外，由于植株上成熟的果實(shí)最終會脫離母體，因此分批成熟的果實(shí)中，較早期成熟的果實(shí)在脫離母體的同時(shí)也帶走了其所含的錳，這與葉片會優(yōu)先把錳累積在不太重要的表皮細(xì)胞，以及通過表皮毛把錳排出體外（外排效應(yīng)）效果類似［23］?？梢?，垂序商陸在果汁中富集錳是一個(gè)十分巧妙的策略。結(jié)果同時(shí)提示，利用垂序商陸進(jìn)行土壤修復(fù)時(shí)，應(yīng)及時(shí)采摘已成熟果實(shí)，防止其掉落地面使錳回歸土壤。

植物遭受嚴(yán)重錳脅迫后，往往生物量減少、衰老提前、生理異常甚至死亡［24－25］。由于本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的處理組錳離子濃度較低，在垂序商陸的耐受能力范圍內(nèi)，因此各組植株均正常生長、開花、掛果、結(jié)籽從而完成當(dāng)年的生長周期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，垂序商陸種子的錳含量隨處理濃度的增加而升高，萌發(fā)率則隨之降低，提示垂序商陸種子內(nèi)的錳富集會降低商陸的繁殖能力，且脅迫程度越高影響越顯著。體外重金屬浸種實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)浸種液中錳離子濃度超過一定值后，種子萌發(fā)率急劇下降［26－27］。值得注意的是，處理組種子中錳含量在成熟后期不增反減，且錳濃度越高減少越明顯，這可能是垂序商陸的一種自我保護(hù)策略，即在成熟末期遷移出部分錳以降低種子中錳含量來提高種子萌發(fā)率，從而維持自身較高繁殖能力。

綜上所述，垂序商陸作為一種錳超富集植物，對環(huán)境中的錳離子濃度響應(yīng)靈敏，且植株各器官內(nèi)錳積累量與環(huán)境中錳濃度密切相關(guān)；處于繁殖期的垂序商陸在錳脅迫環(huán)境中會把累積到體內(nèi)的過量錳盡可能合理地分配到不同器官中，以降低錳富集所帶來的毒害效應(yīng)從而完成生命周期；在種子成熟末期，其還可能采取降低種子中錳分配量的策略來提高萌發(fā)率從而保證高繁殖能力，果漿的可溶性水環(huán)境及其所含的有機(jī)酸在繁殖期植株解錳毒中發(fā)揮了重要作用。該研究結(jié)果為了解高錳條件下繁殖期垂序商陸對錳離子的轉(zhuǎn)移與分配規(guī)律以及垂序商陸在生態(tài)修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用提供些許參考。

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