王 穎，郭世榮，束 勝，劉 芳，劉 濤，孫 錦

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京210095；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)（宿遷）設(shè)施園藝研究院，江蘇宿遷223800）

鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，過量鹽離子主要通過引發(fā)滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫，致使植物的蛋白質(zhì)合成、能量和脂類的代謝等生理代謝受抑制，也影響光合作用器官的組分，如酶、光合色素、類囊體膜蛋白及膜脂等［3－4］，并使得植物葉綠素（Chlorophyll，Chl）合成代謝受阻、含量降低，從而影響植物的光合作用。植物則通過調(diào)節(jié)氣孔開度、合成滲調(diào)物質(zhì)、區(qū)隔過量離子及清除活性氧物質(zhì)等響應(yīng)來減輕脅迫損害［5］。

Chl是綠色植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，在光合作用的能量捕獲及傳遞中起著重要作用［6］。植物體內(nèi)Chl的合成與分解代謝一般處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，失衡就會(huì)產(chǎn)生異常。Chl的生物合成途徑為：谷氨酸（glutamate，Glu）→δ－氨基酮戊酸（δaminolevulinic acid，ALA）→膽色素原（porphobilinogen，PBG）→尿卟啉原Ⅲ（uroorphyrinogenⅢ，Uro Ⅲ）→原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，ProtoⅨ）→鎂原卟啉Ⅸ（Mg－protoporphyrin Ⅸ，Mg－protoⅨ）→原葉綠素酸（protochlorophyll，Pchl）→葉綠素a（Chlorophyll a，Chl a）→葉綠素b（Chlorophyll b，Chl b）［7］，生物合成的任何一個(gè)步驟出現(xiàn)障礙，都會(huì)影響Chl的正常合成，從而引起Chl含量降低［8］；病害、鹽脅迫、溫度等生物和非生物脅迫都會(huì)破壞Chl合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡，從而引起Chl含量的變化［9］。許多研究表明，植物Chl含量在鹽脅迫下降低［10－11］，但也有Chl含量升高的報(bào)道［12－13］，并且Chl含量與光合作用效率有正相關(guān)關(guān)系［11］。

多胺（polyamines，PAs）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有強(qiáng)烈生理活性的低分子量脂肪族含氮堿，與逆境脅迫關(guān)系密切［14］。植物體內(nèi)的PAs主要包括腐胺（Put）、亞精胺（Spd）和精胺（Spm）。許多研究表明，PAs可提高鹽脅迫下植物的光合色素含量，從而改善光合作用，提高植物的耐鹽性［15－16］。然而，PAs提高鹽脅迫下植物葉片Chl含量的原因尚不清楚。菠菜（SpinaciaoleraceaL.）Chl含量豐富，是研究植物Chl代謝和光合作用的理想材料。為此，本試驗(yàn)以耐鹽性較弱的菠菜品種‘全能菠菜’［17］為材料，通過葉面噴施Spd，研究了外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜Chl合成前體含量的影響，探討外源Spd緩解鹽脅迫下菠菜Chl合成受阻的原因，為利用外源Spd提高作物鹽脅迫耐性的實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用耐鹽性較弱的菠菜（SpinaciaoleraceaL.）品種‘全能菠菜’為材料，種子購自于株洲湘蔬種業(yè)有限公司；Spd購自Sigma公司。

1.2 材料培養(yǎng)與處理設(shè)置

試驗(yàn)于2013年10月至2014年4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地自控溫室內(nèi)進(jìn)行。將菠菜種子在15 ℃去離子水中浸泡12h后放置于20 ℃恒溫箱中催芽，待芽長(zhǎng)2 mm 時(shí)播種于50cm×50cm的石英砂盤內(nèi)。子葉展開后，每2d澆1次1／4倍的Hogland營養(yǎng)液；幼苗長(zhǎng)至5 片真葉時(shí)，定植于20L的水培箱中，箱內(nèi)盛有1／2Hogland營養(yǎng)液，水培箱上覆蓋有5×6 個(gè)定植孔的泡沫板，每孔植1株，實(shí)驗(yàn)期間用氣泵24h向水箱內(nèi)通氣。

試驗(yàn)分3部分進(jìn)行：①NaCl對(duì)菠菜生長(zhǎng)和Chl含量的影響試驗(yàn)。在菠菜定植后7d，在營養(yǎng)液中分別一次性加入25、50、75、100、150、200、250、300和350mmol·L－1的NaCl，以正常營養(yǎng)液栽培（不進(jìn)行鹽處理）為對(duì)照。處理14d后取樣測(cè)定植株生長(zhǎng)和Chl含量等指標(biāo)；②Spd對(duì)NaCl脅迫下菠菜生長(zhǎng)與Chl含量的影響試驗(yàn)。菠菜定植后7d，以試驗(yàn)①篩選出的鹽濃度處理菠菜植株，同時(shí)葉面分別噴施0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和1.5mmol·L－1Spd溶液，以不噴施Spd而噴施等量清水為對(duì)照。處理14d后測(cè)定植株生長(zhǎng)和Chl含量等指標(biāo)；③外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜葉綠素前體含量的影響試驗(yàn)。因預(yù)備試驗(yàn)中正常營養(yǎng)液栽培用Spd處理，對(duì)菠菜Chl含量沒有影響，故以試驗(yàn)①和試驗(yàn)②篩選出的鹽濃度和Spd濃度為依據(jù)，設(shè)置如下處理：正常營養(yǎng)液栽培并噴施等量清水（CK）；營養(yǎng)液中加入250 mmol·L－1NaCl（NaCl）；鹽脅迫7d 后葉面噴施Spd溶液（NaCl＋Spd）。分別在處理后第0、1、3、5、7天測(cè)定葉綠素合成前體ALA、PBG、UroⅢ、ProtoⅨ、Mg－protoⅨ、Pchl、Chl a及Chl b含量。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次，隨機(jī)排列，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 植株生長(zhǎng)指標(biāo) 各處理材料分別取10株，用去離子水洗凈植株，吸干表面水分，先分別測(cè)定每株地上部和地下部鮮重（g），再經(jīng)105℃殺青15min，75℃烘至恒重，測(cè)定每株地上部和地下部干重。

1.3.2 Chl含量 Chl含量測(cè)定參考沈偉其［18］的乙醇、丙酮、水混合液浸提法（體積比為4.5∶4.5∶1）。

(3)該種原料適合生產(chǎn)粒度不大于2.8 μm、松裝密度不大于1.0 g/cm3的韓國喜新鉬粉，但是一次過篩率則較低。

1.3.3 葉綠素合成前體含量 Proto Ⅸ、Mg－protoⅨ和Pchl含量測(cè)定參考Hodgins［19］的方法；UroⅢ含量測(cè)定參考Bogorad［20］的方法；ALA 含量測(cè)定參考Richard［21］方法；PBG 含量測(cè)定參考Bogorad［20］的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl和Spd對(duì)菠菜植株生長(zhǎng)的影響

由表1可知，隨著NaCl處理濃度的升高，菠菜植株地上部分和地下部分的干重、鮮重均呈先升高后降低趨勢(shì)，并大多在鹽濃度為25mmol·L－1時(shí)達(dá)到最大值，較對(duì)照均明顯升高，且除地下部干重外均達(dá)到顯著水平；但隨著NaCl濃度繼續(xù)升高，菠菜植株生長(zhǎng)量逐漸降低，植株地上部分干重和鮮重大多在150mmol·L－1時(shí)就顯著低于對(duì)照，地下部分的干重、鮮重也最終顯著低于對(duì)照；在鹽濃度為250 mmol·L－1時(shí)，菠菜植株總鮮重、植株總干重、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重分別較對(duì)照分別降低了57.23%、53.08%、63.14%、55.05%、42.22%和42.86%，且均達(dá)到顯著差異水平（表1）。

同時(shí)，250 mmol·L－1NaCl脅迫下，菠菜植株葉面噴施不同濃度Spd后，植株的生長(zhǎng)量均有不同程度增加，且隨著噴施濃度的增大呈先上升后下降趨勢(shì)，并在1.0 mmol·L－1Spd時(shí)均達(dá)到最大值，此時(shí)植株鮮重、干重、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重較單純鹽脅迫處理（CK）分別顯著提高了62.83%、71.19%、60.57%、71.74%、70.31%和69.23%（表1）。另 外，圖1顯 示，250 mmol·L－1NaCl脅迫下，噴施不同濃度的Spd均可促進(jìn)菠菜植株生長(zhǎng)，其中1.0mmol·L－1Spd的作用最為明顯。

圖1 外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of exogenous Spd on the growth of spinach under salt stress

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可見，鹽脅迫濃度為250mmol·L－1時(shí)，菠菜植株的干重、鮮重的降低幅度均在50%左右；在此基礎(chǔ)上再噴施1.0mmol·L－1Spd又可顯著提高菠菜植株的干重、鮮重，并且提高幅度在5 0%以上。盧樹昌等［22］認(rèn)為，植物生長(zhǎng)量降低50%左右時(shí)是植物的臨界鹽濃度。因此，將250mmol·L－1作為該菠菜品種的臨界鹽濃度，并作為后續(xù)試驗(yàn)中采用的鹽脅迫濃度，同時(shí)將1.0mmol·L－1作為后續(xù)試驗(yàn)中采用的Spd濃度。

2.2 不同濃度NaCl和Spd對(duì)菠菜葉片Chl含量的影響

隨著NaCl濃度升高，菠菜葉片Chl含量［Chl a、Chl b和Chl（a＋b）］也呈先增高后降低趨勢(shì)，并均在50mmol·L－1時(shí)達(dá)到最大值，且顯著高于對(duì)照；隨后，菠菜Chl含量又逐漸降低，當(dāng)NaCl濃度超過150mmol·L－1時(shí)，Chl含量已顯著低于對(duì)照水平；之后，Chl含量維持在相對(duì)穩(wěn)定的較低水平。當(dāng)鹽濃度為250 mmol·L－1時(shí)，Chl a、Chl b 及總Chl含量分別較對(duì)照顯著降低了42.31%、54.55%和44.53%（表1）。同時(shí)，在250 mmol·L－1NaCl脅迫條件下，噴施不同濃度Spd均可不同程度提高菠菜葉片Chl含量，且隨Spd濃度升高表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，且均在1.0mmol·L－1時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)Chl a、Chl b及Chl（a＋b）含量分別較單純鹽脅迫處理（CK）顯著提高了46.24%、51.85%和47.11%（表1）?？梢?，菠菜葉片葉綠素含量在較低濃度（≤100mmol·L－1）鹽脅迫下不同程度被促進(jìn)，但較高濃度（≥150 mmol·L－1）鹽脅迫下卻得到顯著抑制；250 mmol·L－1鹽脅迫下，菠菜葉片Chl含量降低50%左右，而噴施1.0 mmol·L－1Spd 后可使Chl含量顯著升高50%左右。

2.3 外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片葉綠素合成前體含量的影響

圖2 外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中ALA 和PBG 含量的影響Fig.2 Effects of exogenous Spd on ALA and PBG contents of spinach leaves under NaCl stress

2.3.1 ALA和PBG含量 圖2顯示，在250mmol·L－1NaCl脅迫下，菠菜葉片中ALA 和PBG 含量均比對(duì)照（CK）顯著提高，且隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，兩者含量在鹽脅迫處理第7天較對(duì)照分別顯著提高了86.76%和42.70%；在鹽脅迫條件下噴施1.0mmol·L－1Spd，菠菜葉片中ALA 和PBG 含量總體呈降低趨勢(shì)，并接近對(duì)照水平，兩者含量在Spd處理第7天時(shí)分別顯著低于鹽脅迫處理52.76%和50.10%。

2.3.2 Uro Ⅲ含量 由圖3可看出，菠菜葉片中UroⅢ含量在NaCl脅迫下顯著比對(duì)照降低，并隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)，其在鹽脅迫第7天較對(duì)照顯著降低38.57%；在鹽脅迫條件下，菠菜葉片UroⅢ含量在1.0mmol·L－1Spd處理第1、3天時(shí)與鹽脅迫處理接近，隨后逐漸增加，在Spd處理第7天時(shí)已顯著高于鹽脅迫處理52.16%，并與同期對(duì)照接近。

2.3.3 ProtoⅨ、Mg－protoⅨ和Pchl含量 由圖4可知，在NaCl脅迫條件下，菠菜葉片中Proto Ⅸ、Mg－protoⅨ和Pchl含量均比對(duì)照顯著降低，且隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈緩慢遞減趨勢(shì)，它們?cè)邴}脅迫第7天 較 對(duì) 照 分 別 顯 著 降 低6 3.7 9%、4 4.4 4%和69.23%；在鹽脅迫條件下，噴施Spd處理菠菜葉片中ProtoⅨ、Mg－protoⅨ和Pchl含量也始終低于對(duì)照，其在Spd處理第7天時(shí)均顯著高于鹽脅迫處理61.90%、60.00%和125.00%。

圖3 外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中UroⅢ含量的影響Fig.3 Effects of exogenous Spd on UroⅢcontent of spinach leaves under NaCl stress

圖4 外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中ProtoⅨ、Mg－protoⅨ和Pchl含量的影響Fig.4 Effects of exogenous Spd on ProtoⅨ，Mg－protoⅨand Pchl contents of spinach leaves under NaCl stress

2.3.4 Chl a及Chl b含量 由圖5可以看出，菠菜葉片中Chl a及Chl b含量在NaCl脅迫下均始終顯著低于對(duì)照水平，且隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均呈降低趨勢(shì)，其在鹽脅迫處理第7天時(shí)較對(duì)照分別顯著降低了61.11%和63.16%；同時(shí)，鹽脅迫菠菜葉片Chl a及Chl b含量在噴施Spd后均有所提高，且處理時(shí)間越長(zhǎng)增加幅度越大，但始終明顯低于同期對(duì)照，其在Spd處理第7天時(shí)分別較鹽脅迫處理顯著提高78.57%和71.43%。

圖5 外源Spd對(duì)鹽脅迫下菠菜葉片中Chl a及Chl b含量的影響Fig.5 Effects of exogenous Spd on Chl a and Chl b content of spinach leaves under NaCl stress

以上 結(jié) 果 說 明，NaCl脅 迫 下，Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、Proto Ⅸ和Uro Ⅲ含量均明顯降低，而PBG和ALA含量升高，表明鹽脅迫下菠菜Chl含量降低是由于PBG 向Uro Ⅲ的轉(zhuǎn)化受阻所致；鹽脅迫下葉面噴施Spd后，菠菜Chl合成前體Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、ProtoⅨ和UroⅢ含量均明顯升高，而PBG 和ALA 含量有所降低，表明外源Spd可使Chl合成的受阻作用得到有效緩解。

3 討 論

生物量變化是植物對(duì)鹽脅迫的綜合反應(yīng)，是評(píng)估脅迫程度和植物抗鹽能力的可靠指標(biāo)［23］。鹽脅迫下，植物根系最早感受逆境脅迫信號(hào)，并產(chǎn)生相應(yīng)的生理反應(yīng)，繼而影響地上部生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，在NaCl濃度為25mmol·L－1時(shí)菠菜植株的生長(zhǎng)量較對(duì)照均有明顯提高，這與鹽脅迫下桉樹幼苗［24］和西瓜幼苗［25］的研究結(jié)果一致。低濃度的NaCl處理促進(jìn)植物生長(zhǎng)，可能是由于低濃度NaCl脅迫促進(jìn)了植物細(xì)胞伸展和水分平衡［26］，激發(fā)了植株根系對(duì)K＋的攝?。?7］，改善了光合細(xì)胞的水分狀況進(jìn)而促進(jìn)光合作用［28］。隨著NaCl濃度的繼續(xù)升高，菠菜植株生長(zhǎng)量逐漸降低，在鹽濃度為250 mmol·L－1時(shí)各生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著低于對(duì)照，表明高濃度的鹽脅迫顯著抑制菠菜植株生長(zhǎng)，菠菜植株受到了嚴(yán)重的鹽脅迫傷害。

PAs廣泛存在于植物細(xì)胞中，參與多種生理過程，如葉片衰老、花器官的形成與發(fā)育、果實(shí)發(fā)育與成熟以及植物對(duì)逆境的響應(yīng)等［29－30］。眾多研究表明，逆境脅迫下，適宜濃度的PAs處理能夠緩解植物所受到的傷害，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［31－32］。然而，PAs作為一種新型的植物激素，與其他大多數(shù)植物激素一樣，在逆境下的作用具有濃度效應(yīng)。例如，1.0 mmol·L－1外源Spm 可顯著提高NO3－脅迫下黃瓜幼苗的凈光合速率，增加干物質(zhì)積累，促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)，但Spm 濃度高達(dá)1.5～2.0mmol·L－1時(shí)，黃瓜幼苗生長(zhǎng)受到抑制［33］；低濃度（0.1～15.0mmol·L－1）Put可緩解NaCl脅迫對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制，株高、生物積累量均顯著升高，而高濃度（20.0～30.0mmol·L－1）Put處理則加劇了NaCl對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)脅迫［34］；低濃度（150～200 mg·L－1）Spd可顯著提高鹽脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)量，而濃度為250mg·L－1時(shí)較低濃度處理的植株生長(zhǎng)量明顯降低［35］；低濃度（100～150mg·L－1）Spd誘導(dǎo)能顯著提高鹽脅迫下小白菜的株高、單株干重、單株鮮重等生長(zhǎng)量，濃度為200mg·L－1時(shí)較低濃度處理的植株生長(zhǎng)量明顯降低［36］。本研究結(jié)果表明，1.0 mmol·L－1外源Spd顯著提高了鹽脅迫下菠菜的生長(zhǎng)量，而濃度為1.5mmol·L－1時(shí)的菠菜生長(zhǎng)量則比1.0mmol·L－1處理顯著降低，說明外源Spd緩解鹽脅迫對(duì)菠菜生長(zhǎng)抑制的作用也存在濃度效應(yīng)。

葉綠素（Chl）含量是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)，環(huán)境因子的改變會(huì)引起Chl含量變化，進(jìn)而引起光合性能的改變［37］。鹽脅迫下，植物Chl含量會(huì)顯著降低［38－39］。本研究結(jié)果表明，250mmol·L－1鹽脅迫下菠菜葉片Chl含量顯著降低，這可能是鹽脅迫下菠菜生長(zhǎng)顯著受到抑制的重要原因之一。一般認(rèn)為，造成植物Chl含量降低的原因主要是鹽脅迫下類囊體膜的完整性受損［40］、Chl合成途徑中關(guān)鍵酶活性的降低［41］和降解途徑中Chl酶活性的升高［38］等。孫錦等［42］認(rèn)為，海水脅迫下菠菜Chl含量降低主要是由于其合成途徑受阻所致。Chl的生物合成途徑（Glu→ALA→PBG→UroⅢ→ProtoⅨ→Mg－protoⅨ→Pchl→Chl a→Chl b）中任何一步驟出現(xiàn)障礙，都會(huì)影響Chl的合成，從而引起Chl含量降低［43］。本研究結(jié)果表明，NaCl脅迫下，Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、ProtoⅨ和UroⅢ含量均明顯降低，而PBG 和ALA 含量升高，表明鹽脅迫下菠菜Chl含量降低是由于PBG 向Uro Ⅲ的轉(zhuǎn)化受阻，這與陳新斌等［41］的研究結(jié)果一致。鹽脅迫下葉面噴施Spd后，菠菜Chl合成前體Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、ProtoⅨ和UroⅢ的含量均明顯升高，而PBG 和ALA 含量有所降低，表明外源Spd可使Chl合成的受阻作用得到有效緩解?？梢?，鹽脅迫下外源Spd通過緩解菠菜Chl合成途徑的受阻程度來提高了Chl含量，對(duì)維持光合作用的正常進(jìn)行具有重要作用。

Chl合成過程中PBG 向Uro Ⅲ轉(zhuǎn)化是在膽色素脫氨酶（PBGD）的催化下，4分子PBG 脫氨聚合成線性的1－羥甲基膽色素烷（HMB），HMB 在尿卟啉原Ⅲ合成酶的催化下環(huán)合形成所有天然四吡咯化合物的共同前體——尿卟啉原Ⅲ［44］。因此，作為一種具有重要功能的酶，PBGD 廣泛存在于生物體內(nèi)，其活性與葉綠素合成息息相關(guān)。目前，已經(jīng)從豌豆［45］等作物中分離、克隆到PBGD基因。植物在水分脅迫［44］、高低溫脅迫［46－48］下PBGD基因表達(dá)受抑制，PBGD 活性下降，從而抑制Chl合成，導(dǎo)致Chl含量降低。因此，推測(cè)Spd可能通過增強(qiáng)鹽脅迫下菠菜葉片中PBGD基因表達(dá)水平，使PBGD 活性升高，緩解Chl合成的受阻程度，從而促進(jìn)Chl合成代謝的順利進(jìn)行。然而，Spd對(duì)PBGD基因表達(dá)的調(diào)控作用是否如此，以及具體通過什么途徑和方式調(diào)節(jié)PBGD 基因表達(dá)，需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，高鹽脅迫條件下，菠菜植株的生長(zhǎng)受到顯著抑制，葉片葉綠素含量降低可能是其中重要原因之一；菠菜葉片含量降低源于其合成受阻，受阻位點(diǎn)在PBG 向Uro Ⅲ的轉(zhuǎn)化路徑之間；外源Spd能夠緩解鹽脅迫下菠菜葉片葉綠素合成路徑的受阻程度，促進(jìn)葉綠素合成，從而提高葉綠素含量，有效緩解鹽脅迫對(duì)菠菜生長(zhǎng)造成的傷害。

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