李婷菲　葉斌

摘 要：目的：對(duì)毛蚶及其胰蛋白酶水解產(chǎn)物進(jìn)行功能性評(píng)價(jià)和比較。方法：通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胰蛋白酶水解條件，并對(duì)毛蚶水解產(chǎn)物和毛蚶進(jìn)行蛋白含量、氨基酸成分和抗氧化活性的檢測(cè)和比較。結(jié)果：通過胰蛋白酶的水解，毛蚶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和肽含量明顯提高，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。結(jié)論：胰蛋白酶處理過的毛蚶具有更明顯的藥用活性，為進(jìn)一步研究后者的藥用價(jià)值提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：毛蚶 胰蛋白酶 抗氧化性

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）03（a）-0247-04

Abstract：Objective Function evaluation of Arca subcrenata Lischke and its trypsin hydrolysates.Methods The preparation of hydrolysates were optimized in orthogonal experiments，and we evaluated the effects of Arca subcrenata Lischke and its trypsin hydrolysates，including of the content of protein，the amino acid composition and the antioxidant properties.Results The hydrolysates prepared with trypsin had an higher nurtritional value and peptide content，and showed a stronger antioxidant activity.Conclusion The hydrolysates prepared with trypsin showed more obvious activity than Arca subcrenata Lischke.

Key words：Arca subcrenata Lischke；Trypsin；Antioxidant activity

英國(guó)學(xué)者Harman在20世紀(jì)50年代中期首次提出了自由基學(xué)說[1]，自由基學(xué)說是一種具有代表性的致衰學(xué)說。人體在進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種中間代謝物，該物質(zhì)稱為自由基。而自由基過多時(shí)就會(huì)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)造成一定的傷害，從而引起機(jī)體的損傷，這也是造成帕金森綜合征、肝炎、癌癥等疾病的主要因素[2]。因此，研究和制造一種安全且無毒害作用的天然抗氧化劑成為現(xiàn)今備受矚目的課題。

現(xiàn)階段新型保健品和藥物的一個(gè)主要來源是海洋制品。海洋生物在自身的新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生各種各樣的且具有特殊生理功能的活性物質(zhì)，且有一些活性物質(zhì)很難在陸地生物的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因此為海洋生化藥物和功能性保健品的研發(fā)提供了充足的原料。例如，分布在西太平洋的中國(guó)、朝鮮、日本沿岸的毛蚶就是一種海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，且還是一種常見的藥物和食物。中醫(yī)學(xué)上記載，用毛蚶治療炎癥、貧血、腫瘤等疾病已有幾百年的歷史。另外，毛蚶的水解產(chǎn)物不僅可以降低由四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖小鼠的血糖活性，還可以降低高血脂癥實(shí)驗(yàn)小鼠的血脂[3]。王勇等[4]也從毛蚶中分離純化出有抗氧化活性成分的糖肽。

但是天然存在的活性成分大部分或含量微少，或提取難，不足以大量生產(chǎn)供給所需，因此，人們更多地把目光投向開發(fā)體外水解產(chǎn)物這條途徑上來。該文通過對(duì)毛蚶及其胰蛋白酶水解產(chǎn)物的一些功能性比較和研究，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料為：毛蚶（山東青島），二苯代苦味胼基自由基（DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司），胰蛋白酶（廣西龐博生物工程有限公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器為：組織搗碎機(jī)，ICS-2500離子色譜分析儀（美國(guó)戴安公司），Heto-FD1.0-60E低壓冷凍干燥機(jī)（Heto-Helten公司），UV2450紫外分光光度計(jì)（Shimadzu公司），CR21G高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司），DF-Ⅱ集熱型磁力加熱攪拌器（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠），pHS-25數(shù)顯酸（上海虹益儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛蚶胰蛋白酶解工藝過程

首先把毛蚶清洗并且瀝干，按照1：1（W：V）的比例加入蒸餾水，放入組織搗碎機(jī)中以12000r/min的轉(zhuǎn)速運(yùn)轉(zhuǎn)3min后制成樣品勻漿。隨后調(diào)節(jié)勻漿的pH值至所需值，再把胰蛋白酶按照一定的比例加入其中，進(jìn)行水解。這里需注意，水解時(shí)要保持恒定的溫度和pH值。接著，反應(yīng)完成后，把水解液加熱到90℃，保持15min，進(jìn)行滅酶[5]。最后等水解液冷卻后，用15000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，4℃冷凍，上清液冷凍干燥，保存?zhèn)溆?。另外，取部分勻漿，以相同的條件冷凍離心，取上清液，即為毛蚶的可溶性蛋白粗品，冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 正交試驗(yàn)

選擇酶解時(shí)間、酶用量、pH值以及溫度為實(shí)驗(yàn)因素，采用了L9（34）正交表對(duì)胰蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。見表1。

1.2.3 測(cè)定酶解液水解度（DH）

采用pH-stat法控制和測(cè)定水解過程。為保持水解時(shí)的pH值恒定，需要不斷加入NaOH，且根據(jù)堿的消耗量來計(jì)算水解度（DH），公式如下[6-7]：

DH（%）=[B Nb/Mp α htot]×100

B——消耗的堿體積，單位為mL；Nb——堿液濃度，單位為mol/L；Mp——水解反應(yīng)中蛋白質(zhì)總量，單位為g；α——α—氨基的平均解離常數(shù)[8]；htot——底物蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)，單位為mmol/每克蛋白質(zhì)，具體取值為8.0[9]。

1.2.3 測(cè)定蛋白濃度

采用Folin-酚試劑法測(cè)水解產(chǎn)物蛋白濃度[10]。

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

首先把待測(cè)樣品配置成20mg/mL是溶液，然后取出7份不同體積的樣品，最后用反滲透水把這些樣品稀釋至2mL，備用。根據(jù)Shimada[11]所采用的方法，取濃度為0.2mmol/Ld的DPPH的乙醇溶液0.5mL加入到2mL的上述樣品中混合，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，對(duì)照組選用2ml蒸餾水，在室溫下放置30min，最后在517nm處測(cè)吸光度。同時(shí)做空白對(duì)照。用下述公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH的清除率：

清除率%={1-（S-SB）/（C-CB）}×100

S——樣品加DPPH的吸光度；SB——樣品加蒸餾水的吸光度；C——蒸餾水加DPPH的吸光度；CB——蒸餾水加蒸餾水的吸光度。

1.2.4.2 對(duì)H2O2的清除作用

取7份不同重量的待測(cè)樣品，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.4的磷酸緩沖液稀釋至5mL，取0.6mL濃度為4mol/L的H2O2溶液加入到3.4mL的上述溶液中，靜置l0min，混合液在230nm下測(cè)定吸光值，與不加樣品的H2O2溶液進(jìn)行對(duì)比。每個(gè)濃度做三個(gè)平行。用下述公式計(jì)算對(duì)H2O2的清除率：

清除率%={1-（S-SB）/（C-CB）}×100

S——樣品加H2O2的吸光度；SB——樣品加蒸餾水的吸光度；C——蒸餾水加H2O2的吸光度；CB——蒸餾水加蒸餾水的吸光度[12]。

1.2.5 測(cè)定氨基酸含量

對(duì)于蛋白酶水解產(chǎn)生的氨基酸含量及其種類的分析需要采用離子色譜分析儀，根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]所述的方法，先處理游離氨基酸測(cè)定樣品和總氨基酸測(cè)定樣品。分析條件如下所示。（1）色譜柱：Amino PAC PA10，2×250mm；（2）進(jìn)樣體積：25μL；（3）柱溫：30℃；（4）流速：0.25mL/min；（5）流動(dòng)相：去離子水、NaAC、0.25mol/L NaOH。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解海洋生物QHR條件的優(yōu)化

選擇酶解時(shí)間、酶用量、pH值以及溫度為實(shí)驗(yàn)因素，指標(biāo)為酶解液水解度（DH），采用正交表L9（34）對(duì)中性蛋白酶水解毛蚶蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2所示。其中水解度是三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值（P<0.05）。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果的R值可以看出，胰蛋白酶最重要影響因素是酶底比。同時(shí)由k值，可得出胰蛋白酶的最佳水解溫度為40℃，水解時(shí)間是5小時(shí)，E/S值是2.5%，pH為8.5。我們根據(jù)此最佳水解條件，對(duì)樣品進(jìn)行處理，并對(duì)毛蚶樣品及其水解產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

2.2 酶解產(chǎn)物蛋白含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

酶解產(chǎn)物及毛蚶的蛋白含量如表3所示。

（1）樣品溶液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的濃度。

（2）實(shí)際濃度為樣品溶液稀釋前的濃度，即濃度的數(shù)值乘以20倍。

由表3可知，蛋白的含量在蛋白酶酶解后有顯著的提高。這是因?yàn)槊乐杏泻芏嗟牡鞍谉o法和其他組織締結(jié)或者不溶于水，而這些蛋白經(jīng)過胰蛋白酶的作用后，斷開了與疏水基因或其他組織的連接，暴露出親水組織，從而可以與水相容并被提取出。

2.3 毛蚶及其酶解產(chǎn)物的氨基酸分析

該實(shí)驗(yàn)在對(duì)毛蚶和其胰蛋白酶產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸的含量和種類測(cè)定時(shí)，采用的是高效離子交換色譜-積分脈沖安培法，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，經(jīng)過胰蛋白酶的水解后，各種氨基酸的含量都有所增加，毛蚶及其水解產(chǎn)物的必需氨基酸含量分別為30.53%和35.47%，胰蛋白酶作用下毛蚶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有一定的提高。同時(shí)，胰蛋白酶水解后，產(chǎn)物的肽含量也相當(dāng)高，說明胰蛋白酶對(duì)毛蚶主要起著內(nèi)切酶的作用，而海洋生物的肽多具有生物活性，因此，我們認(rèn)為胰蛋白酶對(duì)毛蚶藥用活性成分的研究有非常重要的意義。

2.4 抗氧化活性

該文比較了毛蚶及其胰蛋白酶水解產(chǎn)物的清除DPPH自由基和H2O2的能力，其中抗壞血酸為陽性對(duì)照，清除率為三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值（P<0.05）。結(jié)果見圖2、圖3。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，毛蚶和其水解產(chǎn)物均可以在一定程度上清楚DPPH自由基和H2O2，且隨著樣品濃度的增加，清除率曲線呈線性上升趨勢(shì)，因此其清除作用與濃度有關(guān)，酶解產(chǎn)物的活性越強(qiáng)，上升趨勢(shì)越明顯。通過線性方程，可以計(jì)算出胰蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除作用的EC50值為7.44mg/ml，對(duì)H2O2清除作用的EC50值為20.88mg/ml。有報(bào)道[15]牡蠣的537酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH清除作用的EC50為8.08mg/ml，毛蚶的胰蛋白酶水解產(chǎn)物的清除活性優(yōu)于牡蠣酶解產(chǎn)物。

3 結(jié)語

該文通過正交試驗(yàn)，以水解度DH為依據(jù)，對(duì)胰蛋白酶的最佳水解條件進(jìn)行了篩選，得到其最佳水解溫度為40℃，水解時(shí)間是5小時(shí)，E/S值是2.5%，pH為8.5。同時(shí)對(duì)毛蚶及其酶解產(chǎn)物進(jìn)行了功能性評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)證明，通過胰蛋白酶的水解，毛蚶的蛋白含量大幅度地提高，必需氨基酸含量提高約5%，肽含量也明顯增加，同時(shí)對(duì)DPPH自由基和H2O2也表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力，EC50值分別為7.44mg/ml和20.88mg/ml，是一種潛在的保健品和藥品生產(chǎn)原料。綜上所述，我們認(rèn)為胰蛋白酶的處理提高了毛蚶的抗氧化活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這一結(jié)果對(duì)毛蚶活性成分的研制有非常重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Ashok BT and Ali R. The aging paradox： free radical theory of aging [J].Exp Gerontol，1999，34（3）：293-303.

[2] 余杰，楊振國(guó)，鐘煉，等.酶法制備牡蠣抗氧化肽研究[J].中國(guó)海洋藥物雜質(zhì)， 2012，31（3）：31-36.

[3] Dou， C.G.，Yan，Y.Q.，Zhang，Z. Experimental studies on hypoglycemia and hypolipid effects of hydrolysate of Arca subcrenata[J].Chin. J Mar.Drugs 1996，15（1）：13-15.

[4] 王勇，楊靜，孫峋.毛蚶提取物的抗氧化活性分析[J].中國(guó)海洋藥物，2008，27（3）：11-14.

[5] Vilailak K， Soottawat B， Duangporn K， et al. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally （Selaroides leptolepis） as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type[J]. Food Chemistry，2007，102（4）：1317-1327.

[6] F. Guerard， L. Dufosse， D. De La Broise，et al. Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfin tuna （Thunnus Albacares）wastes using Alcalase[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2001，11：1051-1059

[7] Guerard， F.，Guimas， L.，Binet，A. Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation[J].J.Mol.Catal.B-Enzym，2002，19（20）：489-498.

[8] 于婭.牡蠣活性膚的制備及生物活性研究[D].無錫：江南大學(xué)，2004.

[9] K.Yokoyama，et al.Biosci.Biotech. Biochem，1992，56（10）：1541—1545

[10] 嚴(yán)春艷.海洋生物JNY中抗腫瘤多肽分離純化及其活性的初步研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2004.

[11] Shimada K，F(xiàn)ujikawa K， Yahara K， et al.Antioxidative properties of xanthan on the antioxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J]. J Agric Food Chem，1992，40（6）：945-948.

[12] Ruch h. J.，Cheng S.J.，Klauning J.E.Prevention of cytotoxity and inhibition of interecellular communication by antioxidant catechin isolated from Chinese green tea[J].Carcinogenesis，1989，10（6）：1003-1008.

[13] Hailun He， Yiulan Chen，Caiyun Sun. Preparation and functional evaluation of oligopeptide-enriched hydrolysate from shrimp （Acetes chinensis） treated with crude protease from Bacillus sp. SM98011[J]. Bioresource Technology， 2006，97（3）：385-390.

[14] Jin-shui Wang， Mou-ming Zhao， Qiang-zhong Zhao. Antioxidant properties of papain hydrolysates of wheat gluten in different oxidation systems[J].Food Chemistry，2007，101（4）：1658-1663.

[15] 歐成坤.酶法制備牡蠣生物活性肽新工藝研究[D].無錫：江南大學(xué)，2005.