孟祥飛，郭征，李小康，李勇，裴軼豐，王財儒，楊巍，樊向利

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍骨科研究所，陜西 西安 710032)

實驗研究

rhBMP-2明膠納米微球制備及體外緩釋效果研究

孟祥飛，郭征*，李小康，李勇，裴軼豐，王財儒，楊巍，樊向利

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍骨科研究所，陜西 西安 710032)

目的 制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)明膠納米微球并檢測其體外緩釋效果。方法 “二次凝聚法”制備明膠納米微球，掃描電鏡、透射電鏡和粒徑分析儀檢測納米微球的表面形態(tài)、內(nèi)部結構、粒徑，計算其溶脹率；將rhBMP-2與明膠納米微球復合，計算其包封率和載藥量，并對其體外緩釋效果進行檢測。結果 明膠納米微球的表面形態(tài)良好，分散均一，內(nèi)部結構多孔隙、通道，平均粒徑(171.49±50.12) nm，溶脹率為1.83；rhBMP-2明膠納米微球的包封率為(98.13±0.131)%，載藥量為(58.89±0.079) ng/mg；rhBMP-2明膠納米微球釋藥時間在1個月以上，呈“雙相緩釋”，第1天為“突釋相”，釋藥量約為7%，以后平緩釋放呈“緩釋相”，40%左右的藥物于28 d內(nèi)釋放，約60%的藥物在1個月以后釋放。結論 成功制備rhBMP-2明膠納米微球，不但包封率高，而且體外緩釋效果好。

明膠；納米微球；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；緩釋；生物材料

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)能促進骨再生和修復在臨床已得到廣泛證實[1]，安全性也非?？煽縖2]，然其價格昂貴，少量使用在體內(nèi)會快速稀釋和降解[3]，達不到促進骨修復的效果，大量使用不僅浪費而且造成血腫、異位成骨等并發(fā)癥[4]。研究表明，rhBMP-2促進骨愈合的能力不僅與其劑量相關，而且與載體關系密切，因此制備高效的載體是rhBMP-2獲得大規(guī)模臨床應用的前提[5]。納米載體是指利用天然或合成高分子材料制成粒徑在10～1 000 nm的一類新型載體，它具有靶向、緩釋、提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性、降低藥物的毒副作用和可生物降解等優(yōu)點[6]。近年來關于明膠納米微球的研究頗多[7]，但是用其作為rhBMP-2載體的研究甚少。此外，國內(nèi)外關于“二次凝聚法”的流程和參數(shù)差異較大，重復操作困難。本研究擬在前人的基礎上，對納米明膠微球的制備方法加以改進，制備rhBMP-2納米明膠微球，并檢測其降解和釋藥特性，希望對rhBMP-2的局部應用提供必要的實驗依據(jù)和更加可靠、安全的解決方案。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器 B型明膠(Sigma-Alidrich)，丙酮(天津福晨)，25%戊二醛(天津福晨)，0.4mol/L鹽酸(實驗室提供)，rhBMP-2(上海瑞邦)，rhBMP-2ELISA試劑盒(武漢博士德)，pH酸度計pH-3C(上海大譜)，IKA-RCT磁力加熱攪拌器(德國IKA)，離心機Anke TGL-16G(上海安亭)，超聲清洗機KQ-5200(鞏義予華)，真空旋轉蒸發(fā)儀EYELA N-100(power)EYELA OSB-2100(heating)(東京理化)，凍干機FD5.serise FREEZE DRYER(美國西蒙)，粒徑分析儀DelsaTMNano CParticleAnalyzer(美國貝克曼)，掃描電鏡HITACHI S-4800(日立公司)，透射電鏡FEI TECNAL G2(FEI公司)，全恒溫振蕩器THZ-C-1(太倉設備廠)。

1.2 方法

1.2.1 明膠納米微球的制備 采用二次凝聚法[8]稍做改進，2.5g明膠放入燒杯(見圖1a)，加50 mL蒸餾水，40℃ 600 rpm攪拌15 min；注射器快速注入丙酮50 mL，4℃靜置10 min，溶液分兩層(見圖1b)；倒掉上層濁液，杯底部剩余棕黃色透明膠狀沉淀，加50 mL蒸餾水，50℃ 600 rpm攪拌10 min；滴入鹽酸將溶液pH值調(diào)至2.5；溶液轉至圓底燒瓶，50℃ 1 000 rpm，逐滴加入丙酮150 mL(滴速約2 mL/min)，溶液由清亮變?yōu)槿榘咨?見圖1c)；0℃冰水浴10 min；加25%戊二醛500μL，室溫交聯(lián)16 h；10 000 rpm離心5 min，對沉淀用同等體積丙酮/水(70/30，V/V)的溶液進行超聲再分散和離心，重復3次；50℃旋轉蒸發(fā)去除溶液中的丙酮，將溶液pH值調(diào)至7；-80℃預冷凍12 h，凍干24 h，得到白色粉末(見圖1d)；鈷60照射，4℃保存。

圖1 制備明膠納米微球過程中明膠的變化

1.2.2 rhBMP-2明膠納米微球的制備 用蒸餾水配成rhBMP-2(3 μg/mL)溶液，按每毫克明膠納米微球60 ng rhBMP2的比例混勻，4℃過夜，凍干，60Co輻照4℃保存。

1.2.3 表面形態(tài)、內(nèi)部結構和粒徑分析 取2mg微球粉末鋪于導電膠上，噴金，掃描電鏡觀察表面形態(tài)，隨機選取800個微球統(tǒng)計其粒徑。取凍干前的納米微球懸液100μL，4 mL蒸餾水稀釋，取一滴加至銅網(wǎng)上，透射電鏡掃描微球內(nèi)部結構，粒徑分析儀檢測其在水溶液中的粒徑(n=800)。

1.2.4 溶脹率計算 微球在水中粒徑R0，干粉態(tài)粒徑R1，溶脹率按以下公式計算：溶脹率=水中微球的粒徑(R0)/干粉態(tài)微球的粒徑(R1)。

1.2.5 包封率和載藥量檢測 取3只5 mL離心管，各放入50mg明膠納米微球和1 mL rhBMP-2溶液(3 μg/mL)，4℃過夜，加入3 mL PBS沖洗離心，rhBMP-2ELISA試劑盒檢測上清液中未包封的rhBMP-2含量，按以下公式計算其包封率和載藥量：包封率=微球中rhBMP-2質(zhì)量/投入的rhBMP-2質(zhì)量×100%；載藥量=微球中rhBMP-2質(zhì)量/(微球質(zhì)量+rhBMP-2質(zhì)量)。

1.2.6 體外釋藥 取3只5 mL離心管，各放入10mg微球，各加入rhBMP-2溶液60 μL(10 μg/ mL)，4℃過夜，各加入PBS(pH7.4)緩沖液3 mL(疊氮鈉0.2 g/L)，放入恒溫振蕩器(37℃，50 rpm/min)，計時緩釋，于1 d，4 d，7 d，14 d，21 d，28 d，10 000 rpm離心5 min，后取上清液3 mL，并補充同等體積的PBS緩沖液，ELISA法檢測上清液中rhBMP-2的量，計算累積釋藥百分數(shù)。

2 結 果

2.1 表面形態(tài)、內(nèi)部結構及粒徑 表面形態(tài)如圖2所示，微球表面光滑，球形規(guī)整，分散均勻，球間無黏連。內(nèi)部結構如圖3所示，微球由絨毛狀分子聚合形成，內(nèi)部多孔隙、通道；干粉態(tài)微球的粒徑為(171.49±50.12) nm，集中分布于100～250 nm，分散如圖4所示基本上成正態(tài)分布；水溶液中微球的平均粒徑為303.10 nm，分散也比較均勻，如圖5所示成正態(tài)分布。

2.2 溶脹率 微球在水中的平均粒徑為313.01 nm，在干粉態(tài)的粒徑為171.49 nm，溶脹率為1.83；轉換成體積比1.833=6.1，即明膠納米微球在吸水后體積變?yōu)樵瓉淼?.1倍。

2.3 包封率和載藥量 按上述方法計算微球的包封率為(98.13±0.131)%，微球載藥量為(58.89±0.079) ng/mg，即每毫克微球可加載的rhBMP2為(58.89±0.079) ng。

圖2 明膠納米微球掃描電鏡圖(×20 000)

圖3 明膠納米微球透射電鏡圖(×20 000，×100 000)

圖4 干粉態(tài)明膠納米微球粒徑分布圖

2.4 體外釋藥 微球的rhBMP2呈“雙相釋放”，如圖6所示，第1天藥物釋放量最大，7%左右，為“突釋相”，主要為吸附在微球表面的藥物解吸附所致；1 d以后釋放速度減慢呈“緩釋相”，2周時累計釋放量不到30%，4周時累計釋放量占40%左右，該相主要是由微球緩慢降解釋放的藥物和通道內(nèi)藥物的逐步擴散出所造成的。

3 討 論

圖5 明膠納米微球在水溶液中粒徑分布圖

圖6 rhBMP2明膠納米微球累計4周的釋藥曲線

有學者用單凝聚法制成明膠納米微球，經(jīng)Coester等[8]用“二次凝聚法”改良之后，微球更穩(wěn)定，在醫(yī)學領域得到廣泛應用。插田泡提取物-明膠納米微球比單純提取物能更有效地調(diào)節(jié)機體免疫[9]；CpG-明膠納米微球可使抗炎和抗過敏因子IL-10的分泌明顯增加[10]；siRNA-明膠納米微球與siRNA相比，能在腫瘤細胞內(nèi)聚集更多siRNA發(fā)揮沉默RFP基因的作用[11]；抑癌基因(wt-p53)/抗腫瘤藥物(吉西他濱)-明膠納米微球比單用wt-p53或吉西他濱更有效促進胰腺癌細胞凋亡[12]；核殼結構的萬古霉素-明膠納米微球?qū)崿F(xiàn)抗生素的按需釋放，降低了產(chǎn)生多重耐藥菌的概率[13]；發(fā)冷光的CdSe-明膠納米微球應用在生物顯像領域是一次創(chuàng)新[14]；礦化的肝素-明膠納米微球制成可注射膠體，有良好的骨誘導和機械性能[15]；納米明膠微球-納米磷酸鈣復合膠體，在高離子強度下有良好的延展性、復形能力[16]，在骨組織工程領域有美好應用前景；而國內(nèi)相關報道較少，丁素麗等制備明膠納米微球，并對其表面電荷改性進行研究[17]，但并未涉及明膠納米微球的提取。鑒于其廣泛應用，本文結合rhBMP-2明膠納米微球制備和檢測作如下討論。

明膠納米微球制備條件的優(yōu)化：a)明膠類型：明膠分為A型明膠(PI=9)和B型明膠(PI=5)，要加載的rhBMP-2(PI=8.5)在pH7.4時帶正電，而B型明膠帶負電，利用異性電荷吸引實現(xiàn)結合，所以B型明膠最合適[18]。b)溫度：40℃、50℃、60℃微球粒徑隨溫度的升高而增大，40℃明膠分子即可在水中充分散開，50℃制備的明膠納米微球分散度最小、粒徑均一[19]。因此，第一次加丙酮前，水浴溫度40℃即可，第二次加丙酮前，溫度在50℃最佳。c)pH：將明膠溶液pH調(diào)至遠離其等電點(PI=5)2.5或12，此時微球攜帶最多正或負電荷，因同性電荷相互排斥而保持穩(wěn)定。Shirzad Azarmi等發(fā)現(xiàn)無論A型或B型明膠，pH2.5是制備納米微球的最佳pH值，當pH≥4時微球不穩(wěn)定易聚集[19]；pH越低納米微球的粒徑越小，而且酸性pH也利于戊二醛交聯(lián)[17]，因此2.5是制備微球的最佳pH；冷凍前將微球懸液的pH調(diào)至7.0，與pH7.4接近，加載藥物時可攜帶相應電荷[20]。d)交聯(lián)劑：戊二醛作交聯(lián)劑應用廣泛、效果好，而且交聯(lián)度可控，但是戊二醛有一定毒性[21]；京尼平交聯(lián)效果比戊二醛好且毒性低[22]，但其交聯(lián)條件pH7.0和25～37℃[23]并不適合本實驗，pH2.5時京尼平幾乎不交聯(lián)；所以，減少其用量并延長交聯(lián)時間，控制在每克明膠200 μL 25%戊二醛，交聯(lián)16 h；用甘氨酸滅活殘留的醛基，也可降低其毒性[24]。e)形態(tài)：交聯(lián)前，0℃冰水浴使微球具有更好形態(tài)，時間過短球形度不好，過長則發(fā)生聚集，10 min最合適[17]；f)微球純化：離心后的納米微球沉淀，用水再分散困難，主因明膠吸水性強，微球迅速吸水形成膠塊；如用(70/30，V/V)丙酮/水作分散液，超聲后沉淀容易再分散，所以用(70/30，V/V)丙酮/水作分散液最佳。g)凍干：預冷凍溫度越高，微球內(nèi)水形成冰晶慢且體積大，預冷凍溫度越低，形成冰晶快而且體積小[25]；大冰晶形成球內(nèi)部的多孔結構直徑大，對球結構破壞大，用到體內(nèi)會加速降解，致使微球釋藥過快；而小冰晶形成多孔結構直徑小而均勻，對球結構破壞也較小，更有利于藥物的加載和緩慢釋放。研究中也發(fā)現(xiàn)，-20℃預冷凍，微球嚴重聚集黏連，導致凍干失敗，而-80℃基本都能成功，因此-80℃是預冷凍的最佳溫度。經(jīng)過上述條件優(yōu)化，制備出平均粒徑在171.49 nm的明膠納米微球，粒徑小且分散均一。

明膠納米微球的載藥，以廉價的明膠作材料，二次凝聚法制備的明膠納米微球，非常有利于加載藥物，主要原因有：a)凍干時冰晶的致孔作用，使球內(nèi)形成疏松多孔結構，如圖3示，孔隙深達球內(nèi)；b)明膠吸水性好，微球吸水后體積是干粉狀態(tài)下的6.1倍，這與文獻描述是一致的，即明膠吸水后質(zhì)量為原來的5～10倍[26]，非常適合加載水溶性藥物；c)明膠作為兩性分子，改變所在環(huán)境的pH值可攜帶相應電荷，通過電荷吸引加載藥物，而且其優(yōu)良吸水性對藥物加載也有促進作用。綜上所述，將藥物溶液與明膠納米微球混勻，即可迅速完成藥物吸收加載，rhBMP2的包封率高達到98.13%，載藥量58.89 ng rhBMP2每毫克微球。另一種載藥方式，即在制成微球前，將藥物先于明膠溶液混勻結合。Azimi等將牛血清蛋白(brovine serum albumin，BSA)在成球前與明膠溶液結合，制成納米微球的形態(tài)跟BSA的量明顯相關，當BSA包封率≤2%時，微球粒徑小而分散均一，當BSA包封率≥3%時，微球粒徑大、分散不均，而且形態(tài)很差，有大量聚集和融合[27]。關于微球載藥需要強調(diào)三點：a)藥物配成溶液，將液體控制在微球的飽和吸水量內(nèi)，理論上可將藥物完全加載，若想提高藥物加載量提高藥物濃度即可；b)任何載體其載藥量并非無限，總會飽和，對于明膠納米微球最大載藥量，還需更深入研究；c)如果是蛋白或多肽類容易變性的藥物，由于制備流程中有丙酮等有機溶劑(容易使蛋白變性)的使用，建議在制成納米微球后再將藥物與其復合，可以保持最大藥物活性。

明膠納米微球的釋藥機制有：a)吸附球表面的藥物與球脫離；b)球孔道內(nèi)藥物向外擴散；c)微囊內(nèi)包裹藥物的釋放(特指微囊類載體)；d)與球基質(zhì)通過電荷或化學結合的藥物，隨球的降解而被釋放；e)藥物的擴散和降解釋放共同作用[28]。當藥擴散速度大于球降解速度時，擴散是主要釋藥方式；反之，當藥擴散速度小于球降解速度時，降解釋藥是主要釋藥方式。釋藥過程不是單一方式，而是多種釋藥方式的組合，一般呈“兩相”，釋藥開始即“突釋相”，主要是球表面的藥物在短時間內(nèi)釋放造成的；隨后，釋放減慢，遵循一級動力學，此階段為“緩釋相”，這部分藥物一部分來自微球孔隙內(nèi)吸附的藥物，另一部分來自與球結合的藥物在球降解后而被釋放。經(jīng)過4周觀察，發(fā)現(xiàn)rhBMP2明膠納米微球的釋藥呈典型的“雙相”釋放，第1天釋藥達7%左右，為“突釋相”；2周釋藥量為20%左右，4周時釋藥量也不過40%，為藥物的“緩釋相”，其釋放可維持1個月以上。Narayanan等[29]發(fā)現(xiàn)，布洛芬在1周左右釋藥達到100%，這可能是因為明膠納米微球交聯(lián)度低，快速降解導致藥物的迅速釋放。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶由于分子量較大，大部分吸附在球的表面而不能進入球內(nèi)(如圖3所示：微球由表面至內(nèi)部孔隙越來越小)，導致藥物的“突釋相”較明顯，第1天釋藥即達70%左右，而分子量較小的rhBMP-2(26KD)大部分可以進入球內(nèi)，所以突釋效應不明顯，只有30%左右，在釋藥溶液里加入膠原酶后，rhBMP-2四周時釋藥可達到90%左右。由此可見，影響釋藥的因素很多：藥物分子量、載體的交聯(lián)度、藥物與載體的結合方式、酶的參與等。本實驗不足之處在于，在pH7.4的PBS緩沖液里進行模擬體內(nèi)的緩釋，所以體內(nèi)rhBMP2釋放還需進一步研究。

明膠納米微球應用的幾點展望：a)rhBMP2明膠納米微球復合在假體表面，促進假體周圍骨生長，實現(xiàn)假體與自體骨牢固結合，還可與其他材料復合制備新型人工骨。b)加載血管內(nèi)皮生長因子和rhBMP-2制成一種可注射的生物膠，注射到骨缺損處，既可促進骨周圍血管化，又促進骨誘導，甚至可以加載多種因子協(xié)同作用。c)加載抗腫瘤藥，既提高抗腫瘤效果，又減少藥物副作用；用作基因載體，極大提高轉染率。d)球表面有很多活性基團，連接抗體后能特異識別某些細胞，實現(xiàn)藥物、基因的靶向治療?？傊髂z納米微球是一種非常有臨床應用前景的納米載體。

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Preparation of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 Loaded Gelatin Nanoparticles and Sustained-release Effect in Vitro

Meng Xiangfei1，Guo Zheng2*，Li Xiaokang2，etal.

(Institute of Orthopedics，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)

Objective To prepare rhBMP-2 loaded gelatin nanoparticles and study the sustained-release effect of rhBMP-2 loaded gelatin nanoparticles in vitro.Methods The gelatin nanoparticles were prepared by two-step desolvation method，the surface morphology，inner structure and particle size of the gelatin nanoparticles were observed by Scanning electron microscope(SEM)，Transmission electron microscope(TEM) and Nano-particle size analyzers，the swelling rate of them in water was calculated.Then rhBMP-2 were loaded to gelatin nanoparticles，it′s envelopment rate and drug loadings were calculated and the sustained-release effect were detected in vitro.Results The gelatin nanoparticles had a good surface morphology，the inner structure of which had a lot of pores and channels，the the average particle size was(171.49±50.12) nm，dispersed uniformly：the envelopment rate and drug loadings of rhBMP-2 loaded gelatin nanoparticles were(98.13±0.131)% and (58.89±0.079) ng/mg respectively，the swelling rate was 1.83；the release time of rhBMP-2 loaded gelatin nanoparticles was more than one month，the release pattern was “Biphasic release”，on the 1st day was“burst release phase”，drug release amount was about 7%，then drug was slowly released step by step，known as the“slow-release”，about 40% of the drug was released until the 28th day，there were about 60% of the drug released thereafter.Conclusion RhBMP-2 loaded gelatin nanoparticles can be prepared successfully with high entrapment and good sustained-release effect in vitro.

gelatin；nanoparticles；rhBMP-2；sustained-release；biomaterials

國家自然科學基金(51271199)；*本文通訊作者：郭征

1008-5572(2015)03-0229-06

R318.08

A

2014-12-08

孟祥飛(1983- )，男，醫(yī)師，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍骨科研究所，710032。