謝林，顧軍，唐田，陳艦艦

(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210028)

實驗研究

山羊腰椎間盤退變微創(chuàng)動物模型研究

謝林，顧軍，唐田，陳艦艦

(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210028)

目的 腰椎間盤退變動物模型是研究人體椎間盤退變的機制及治療方法中不可或缺的部分，目前腰椎間盤退變模型研究以小型動物為主，其椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體差異明顯。山羊腰椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體相似，本研究用微創(chuàng)手術(shù)方法建立山羊腰椎間盤損傷退變模型，探索一種新的大型動物腰椎間盤退變造模方法。方法 20只成年波爾多山羊隨機分為腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)。術(shù)前A、B組使用MRI測量腰椎間盤原始數(shù)值，腰椎微創(chuàng)造模組(A組)使用全內(nèi)窺鏡腰椎微創(chuàng)手術(shù)方法制造腰椎間盤退變模型，腰椎假手術(shù)組使用相同操作而不損傷腰椎間盤。術(shù)后2個月復(fù)查腰椎MRI，動物空氣栓塞處死后獲取腰椎間盤標(biāo)本，并進行組織固定、切片、染色。術(shù)前及術(shù)后按Videman椎間盤退變等級、Zhang Y的山羊動物椎間盤組織退變分級標(biāo)準比較兩組之間腰椎MRI影像學(xué)及細胞組織形態(tài)學(xué)評分，并用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，rt-PCR)法檢測腰椎間盤髓核組織中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)基因表達差異。結(jié)果 腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)經(jīng)比較，MRI影像學(xué)評分差異明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細胞組織形態(tài)評分差異明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HIF-1基因表達在兩組之間差異顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TNF-a、TGF-β、IL-1基因表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NF-κB表達在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)腰椎間盤MRI及組織形態(tài)學(xué)差異顯著，從影像學(xué)及組織學(xué)上說明全內(nèi)窺鏡微創(chuàng)造模法成功建立波爾多山羊腰椎間盤退變動物模型。兩組山羊HIF-1、TNF-a、TGF-β、IL-1基因表達差異從分子角度證明山羊腰椎間盤退變微創(chuàng)動物模型造模成功。

腰椎間盤退變；山羊動物模型；微創(chuàng)手術(shù)

腰椎間盤退變引起的相關(guān)病癥影響著人們的生活，而腰椎間盤退變動物模型是研究人體椎間盤退變的機制及治療方法中不可或缺的部分。目前，關(guān)于腰椎間盤退變動物模型的文獻報道較多，備選動物種類及動物模型制作方法繁多，但以鼠、兔居多，其椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)差異明顯，并且其椎間盤體積較小，不利于椎間盤組織工程修復(fù)、椎間盤細胞再生等研究，而山羊腰椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體較為相似。本研究用腰椎微創(chuàng)手術(shù)方法建立腰椎間盤退變模型，探索一種新的大型腰椎間盤退變動物造模方法。

1 資料與方法

1.1 實驗器材與動物造模 選用20只健康雌性成年波爾多山羊(江蘇省農(nóng)科院羊養(yǎng)殖基地提供)，體重36～41 kg，平均為38.5 kg，采用隨機數(shù)列分為2組，每組10只，分別為腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)。

實驗器材：德國 Richard Wolf全內(nèi)窺鏡操作系統(tǒng)(25°視角，長度165 mm，直徑6.9 mm×5.6 mm，工作通道直徑4.1 mm)、常規(guī)骨科手術(shù)器械、德國Richard Wolf胸腰椎全內(nèi)窺鏡脊柱手術(shù)器械(抓鉗、籃鉗、探針)、美國KARL STORZ視頻影像系統(tǒng)、德國Richard Wolf手術(shù)沖洗泵系統(tǒng)、西門子公司C型移動式X線機、Ellman美國雙頻射頻機(4 MHz)、美國Thermo Scientific公司702型超低溫冰箱、日本Sanyo公司MPR-1410恒溫保存箱、日本Sanyo公司MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋、Eppendorf 5415D小型臺式高速離心機、美GE核磁共振成像儀、3L袋裝生理鹽水(每袋鹽水中加入慶大霉素16萬單位)。美國Milli-Q Biocel超純水器-2.5 mm克氏針數(shù)枚。術(shù)前常規(guī)骨科器械采用高溫消毒，全內(nèi)窺鏡脊柱手術(shù)器械采用低溫消毒。

實驗藥品及試劑：速眠新Ⅱ(10*1.5 mL，吉林省華牧動物保健品有限公司生產(chǎn))、鹿醒寧(10*1.5 mL，吉林省華牧動物保健品有限公司生產(chǎn))、鹽酸利多卡因(5 mL︰100 mg，山東華魯制藥有限公司提供)、注射用青霉素納(160萬單位，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))、10%中性甲醛(江蘇省中醫(yī)藥研究院病理科配制)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司生產(chǎn))、氯仿(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))、異丙醇(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))、Trizol(Invitrogen公司生產(chǎn))、75%酒精(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))、SBYR Green預(yù)混試劑(Thermo公司)。

實驗動物手術(shù)前一天開始禁食，術(shù)前肌注陸眠寧Ⅱ(0.2 mL/kg)(長春軍需大學(xué)研究所提供)行全身麻醉。麻醉成功后，進行MRI術(shù)前檢查，記錄實驗動物腰椎基礎(chǔ)信號。腰椎手術(shù)區(qū)域備皮，造模組取左側(cè)臥位，常規(guī)手術(shù)消毒、鋪巾，C型臂機下定位L3～4及L4～5椎間隙，連接雙頻射頻機、全內(nèi)窺鏡、視頻監(jiān)測系統(tǒng)、及手術(shù)沖洗泵系統(tǒng)。自L3～4，L4～5椎體前外側(cè)用皮刀切開約0.6 cm切口，垂直插入開路錐，經(jīng)C型臂機透視正側(cè)位確定位置后，逐漸向椎間盤垂直插入套筒，C型臂機透視再次確認位置后放置全內(nèi)窺鏡工作系統(tǒng)，在視頻監(jiān)視下用射頻探頭止血并燒灼阻礙視野的脂肪組織，顯露椎間盤，以探針探入，證實是椎間盤后將2.5 mm克氏針插入，用榔頭緩慢敲入1 cm，拔除克氏針，徹底止血，拔除套筒，縫合切口，敷料覆蓋，術(shù)畢。腰椎微創(chuàng)造模組(A)實驗動物術(shù)中出血少，手術(shù)過程順利。腰椎假手術(shù)組(B組)手術(shù)過程無克氏針損傷椎間盤步驟，其余與造模組相同。

各組實驗羊蘇醒后均能自行行走，生命體征穩(wěn)定，四肢活動正常，術(shù)后6 h后予正常飲食，肌注青霉素80萬U，連續(xù)3 d。術(shù)后密切觀察切口滲血滲液、飲食、四肢活動及大小便情況，切口處紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.2 標(biāo)本處理與檢測方法

1.2.1 標(biāo)本采集及制備 兩組60 d后，在全麻下再次對實驗羊的腰椎攝MRI，與術(shù)前的MRI進行比較，取耳緣靜脈予空氣栓塞處死，取出完整腰椎，剔除椎體周圍肌肉、韌帶，保留L1～L6椎體。截取包括腰椎間盤及其兩側(cè)1/3椎體，祛除兩側(cè)椎弓根、椎板及周圍軟組織，取部分椎間盤標(biāo)本以10%中性甲醛浸泡，固定1 周后，然后用10%稀硝酸常溫下脫鈣，脫鈣至針尖能扎進終板為準。脫鈣后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟塊包埋，切片機切片，切片后行HE染色。剩余椎間盤標(biāo)本30 min內(nèi)放入-80℃冰箱內(nèi)保存以備聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)用。

1.2.2 MRI評估 由兩位不參與手術(shù)的骨科醫(yī)生和兩位放射科醫(yī)生進行腰椎間盤退變程度MRI檢測，通過對實驗動物羊術(shù)前、術(shù)后2個月腰椎矢狀位、冠狀位、水平位MRI檢測對比，并計算Kappa值。根據(jù)Videman椎間盤退變等級對腰椎間盤的退變程度進行評估(見表1)。

表1 Videman椎間盤退變等級

1.2.3 組織學(xué)評估 根據(jù)Zhang Y的山羊動物椎間盤退變分級標(biāo)準(見表2)從四方面評估椎間盤退變程度：a)纖維環(huán)與髓核交界處結(jié)構(gòu)；b)纖維環(huán)組織結(jié)構(gòu)；c)髓核組織外基質(zhì)形態(tài)；d)髓核細胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)。分數(shù)為0-2分，正常組織為0分，輕微退變?yōu)?分，重度退變?yōu)?分。觀察切片的顯微鏡為Olympus BX-60。

表2 Zhang Y的山羊動物椎間盤退變分級標(biāo)準

1.2.4 基因表達檢測

1.2.4.1 RNA的提取 所有實驗用品經(jīng)雙蒸餾水清洗，高溫蒸汽消毒，烘箱烘烤24 h處理。迅速剪碎取出的新鮮髓核組織標(biāo)本，在研磨皿中加入適量液氮，待液氮揮發(fā)后，用研磨棒將髓核組織剪碎。加入TRIzol試劑1 mL(組織塊總體積未超過TRIzol試劑體積的10%)，用移液槍頭充分吹打該髓核組織樣品，移入1.5 mL EP管中，將上述EP放置室溫下5 min，等待核糖核酸和蛋白分離充分，再向每1 mLTRIzol試劑用量的勻漿液中加入0.2 mL氯仿，蓋緊管蓋，后手動劇烈搖晃15 s，溶液呈乳粉紅色狀，無分層現(xiàn)象。最后室溫靜置2～3 min，放入4℃離心機，于 10 000 rpm離心10 min；取出EP管，見樣品分為三層：無色清水相的上層、乳白色的中間層及粉紅色的有機相下層。只吸取上層水相(無色)加入到新EP管中，吸入約200 μL；不必過多吸取上清液，防止吸入DNA和蛋白雜質(zhì)(中間層，白色)；上清液加入200 μL的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖勻；于室溫下靜置10 min，待RNA充分沉淀(為減少RNA降解，此步驟可省略)再次將混合溶液放入4℃離心機，于 10 000 rpm離心10 min；離心后，本次將上清棄除(注意不丟棄沉淀)，每管加入1 mL 75%乙醇潤洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動試管，以去除殘留的異丙醇和鹽份，于4℃離心機下7 500 rpm離心5 min；將上清棄除(注意不丟棄沉淀)，打開管蓋，將RNA沉淀干燥(室溫揮發(fā))，未讓RNA沉淀不可完全干燥，否則難以溶解；將RNA沉淀溶解于50 μL的無酶(RNase)水中，待完全溶解后取少量進行電泳和OD值檢測，后于-80℃保存。

1.2.4.2 引物設(shè)計 通過查閱NCBI數(shù)據(jù)庫資料，獲得腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase，MMP-1)五個基因的序列，設(shè)計quantitative real time PCR引物。引物設(shè)計軟件：Primer5。引物設(shè)計如下：

NF-kB

Goat-NF-KB-F：5-GACACAGCCAGTTACATGTGC-3′

Goat-NF-KB-R：5-TGGCCCGGATGAATACTTGG-3′

TNF-α

Goat-TNF-α-F：5-CAGACATCCCATTCAGGAGGC-3′

Goat-TNF-α-R：5-GTGTTTTGCACTTTTGTCCTGC-3′

Bcl-2

Goat-Bcl-2-F 5-GTCTGAAGCGCATCGGAGAT-3′

Goat-Bcl-2-R 5-CCTTGAGCACCAGTTTGCTG-3′

HIF-1

Goat-HIF-1-F 5-TCCATTTTCCACTCAGGACACT-3′

Goat-HIF-1-R 5-GCGGTGGCTATAGGAGGTTC-3′

MMP-1

Goat-MMP-1-F 5-TGGGCGAGTATGCCACATTT-3′

Goat-MMP-1-R 5-TCCTGAGCTCCTCGTTGAAA-3′

GAPDH

Goat-GAPDH-F 5-CATGTTTGTGATGGGCGTGA-3′

Goat-GAPDH-R 5-GTGGTCATAAGTCCCTCCACG-3′

2 結(jié) 果

2.1 腰椎間盤退變影像學(xué)結(jié)果 造模前后MRI腰椎間盤纖維環(huán)形態(tài)見圖1～2。腰椎微創(chuàng)造模組與腰椎假手術(shù)組在術(shù)后2個月腰椎間盤的MRI結(jié)果相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表3 各組實驗羊L3～4、L4～5腰椎間盤影像學(xué)評分測量結(jié)果比較(例)

圖1 造模前MRI示右側(cè)纖維結(jié)構(gòu)完整

2.2 腰椎間盤退變組織學(xué)結(jié)果 兩組髓核組織形態(tài)(400倍光鏡下觀察)見圖3～4。兩組實驗羊L3～4、L4～5腰椎間盤組織學(xué)評分測量，腰椎微創(chuàng)造模組(10 例)組織學(xué)評分(1.50±0.40)分，腰椎假手術(shù)組(10 例)組織學(xué)評分(0.10±0.05)分，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 造模后MRI示右側(cè)纖維結(jié)構(gòu)紊亂

圖3 腰椎假手術(shù)組髓核細胞豐富，胞漿均勻，胞核形態(tài)正常(×400)

圖4 腰椎微創(chuàng)造模組髓核細胞減少，髓核細胞形態(tài)異常，胞漿減少，胞核濃縮(×400)

2.3 腰椎間盤退變TNF-α、Bcl-2、HIF-1等基因表達檢測結(jié)果 經(jīng)統(tǒng)計分析，HIF-1基因表達在兩組之間，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，TNF-a、TGF-β、IL-1基因表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NF-κB表達在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

3 討 論

腰椎間盤退變繼發(fā)的椎間盤源性腰痛、腰椎間盤突出癥及相關(guān)運動功能障礙普遍存在。70%的人一生中會因為腰椎間盤退變引起的疾病就診[1]。20世紀60年代起國內(nèi)外學(xué)者開始對腰椎間盤退變的病因、病理進行研究，其確切的退變機理仍不清楚。眾多國內(nèi)外學(xué)者認為腰椎間盤退變是多種因素共同作用的結(jié)果，包括氧化應(yīng)激、炎癥因子、細胞衰老、細胞凋亡、酶活性水平的改變、營養(yǎng)通路等因素，在退變過程中腰椎間盤的生物力學(xué)、生物化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了相應(yīng)的變化，最終導(dǎo)致腰椎間盤細胞分解代謝增加，合成代謝減少，導(dǎo)致腰椎間盤退變。

表4 各組實驗羊腰椎間盤組織基因表達測量結(jié)果

3.1 建立動物模型的意義 動物模型是研究人體腰椎間盤退變的機制及治療方法中不可或缺的部分。鑒于目前研究方法與治療手段的多樣性，為探索腰椎間盤退變的發(fā)病機制及藥物的治療機制，需要獲得與人體椎間盤結(jié)構(gòu)及退變機制相似的動物模型，并且這種模型需要滿足經(jīng)濟性、低周期性、易獲得性、可重復(fù)性等特點。但目前研究動物使用種類繁雜，模型制作的方式多種多樣，沒有固定的造模標(biāo)準，也沒有統(tǒng)一的評估體系。因此，建立經(jīng)濟、安全、可靠的腰椎間盤退變動物模型，用于研究腰椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展以及探索其有效治療手段以及制定防治策略具有重要意義。目前，腰椎間盤退變動物模型主要有自發(fā)退變模型[2-4]、損傷動物模型[5-7]、誘導(dǎo)退變模型等[8-10]，它們都有各自的優(yōu)缺點，而微創(chuàng)腰椎間盤退變造模是目前研究的熱點。

3.2 構(gòu)建動物模型的方法選擇 動物模型是研究人體椎間盤退變的機制及治療方法中不可或缺的部分。但是選擇動物模型模擬人體的腰椎間盤退變過程時，要考慮到動物的種類、自然壽命、年齡、行走方式等，同時也要考慮到人體的生理構(gòu)成，考慮到人體椎間盤在正常生理狀態(tài)下所承受著垂直方向的重力及水平方向的剪切力特征。出于上述考慮，類人猿如恒河猴是最理想的動物模型之一，但由于經(jīng)濟成本、實驗動物獲取等因素，此類動物模型不能成為主要的實驗對象。

小動物，諸如嚙齒類大鼠、兔是目前常用的備選動物。此類動物容易獲得、造模周期短、經(jīng)濟實用，所以被廣泛用于椎間盤退變研究。但是此類動物椎間盤較小，普通的注射穿刺即可引起退變，所以只適用于前期基礎(chǔ)實驗，不利于藥物注射、細胞移植、基因轉(zhuǎn)染的椎間盤再生、修復(fù)的研究。大型動物的椎間盤結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)較為相似，其中包括犬類、豬、牛、羊等大型動物。O′Connell等[11]使用幾何方法研究實驗動物椎間盤厚度、高度、前后徑等與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似度發(fā)現(xiàn)，大型動物山羊的椎間盤結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)較為相似。

在選擇以何種方式構(gòu)建動物退變模型時，自然退變模型、椎間盤損傷模型、誘導(dǎo)模型是目前主要的備選方案。自然退變的動物模型與人體腰椎間盤退變過程相似，但模型獲取周期較長，嚙齒類動物如大鼠就需要8到9個月時間，大型動物需要的時間更長，此類動物模型實驗周期長是其缺點。目前纖維環(huán)損傷模型應(yīng)用較廣，大量報道顯示損傷后的椎間盤組織退變較快，模型容易獲得，但其缺點主要是在手術(shù)方法上的不足，因為開放手術(shù)對腰椎間盤周圍組織損傷較大，安全性低、死亡率高，增加了造模風(fēng)險與不必要的干擾因素。誘導(dǎo)模型主要研究單一致病因素或者生存環(huán)境對實驗動物的椎間盤退變影響，不利于廣泛的機制及治療方法的研究。所以，能夠重復(fù)、安全、創(chuàng)傷小、經(jīng)濟、能夠模擬的大型動物模型是目前腰椎間盤退變研究所缺少的。

我們使用與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似的山羊作為備選動物，通過腰椎間盤微創(chuàng)技術(shù)制備山羊腰椎間盤退變模型，在充分使用大型動物結(jié)構(gòu)特點同時，減少造模過程所帶來的損傷因素、結(jié)構(gòu)破壞的干擾因素，為腰椎間盤退變提供可重復(fù)且簡單易行的動物模型方法，為日后腰椎間盤修復(fù)及再生準備理想的動物模型。

3.3 動物模型制備的要求 腰椎間盤退變模型的選擇要考慮多方面因素，獲得理想腰椎間盤退變模型要綜合以下因素：a)實驗動物經(jīng)濟實用、獲取方便、有利于廣泛開展研究；b)腰椎間盤退變模型可重復(fù)性好，安全可靠；c)選擇造模動物的腰椎間盤結(jié)構(gòu)與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似，有利于開展進一步的修復(fù)與再生研究；d)造模動物的退變過程應(yīng)與人體的損傷及自然退變過程相似；e)造模動物損傷可控與精確化，減少不必要的手術(shù)損傷與退變的干擾因素；f)構(gòu)建腰椎間盤退變客觀、統(tǒng)一的量化標(biāo)準，減少人為的主觀因素對腰椎間盤退變的干擾。

所以采用大型動物作為備選動物模型，借助腰椎微創(chuàng)技術(shù)實現(xiàn)腰椎間盤結(jié)構(gòu)損傷的可控性、精確性，是以后腰椎間盤退變模型構(gòu)建的研究方向，但目前客觀的評價標(biāo)準尚未統(tǒng)一，需進一步量化微創(chuàng)動物模型的觀察及測量指標(biāo)。

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An Animal Goat Model of Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Using Minimally Invasive Surgery

Xie Lin，Gu Jun，Tang Tian，etal

(Jiangsu Provincial Hospital of TCM and Western Medicine，Nanjing 210028，China)

Objective To make goat model of lumbar intervertebral disc degeneration to explorer a new method to create large animal model.Methods Twenty Bordeaux goats were divided to two groups.Group A underwent full-endoscopic technique of minimally invasive surgery，the group B is sham-operation group.Original dates of all lumbar intervertebral disc were detected by MRI before operation.Full-endoscopic technique of minimally invasive surgery was used to make animal model of lumbar intervertebral disc degeneration.Sham-operation group accape the same technique but the structure of lumbar intervertebral disc was not injured.Two months later，MRI test was taken again and lumbar intervertebral discs were harvested after animals sacrificed.Comparation of MRI scores，histology scores and gene expression including HIF-1、TNF-a、TGF-β、NFκB、IL-1in nucleus pulposus tissue were taken in these two groups.Results There were statistically significant differences in MRI scores and histology scores of these two groups(P<0.05).TNF-a、TGF-β、IL-1 gene expression also had a significant difference in these two groups，further more the gene expression of HIF-1 had a statistically significant difference(P<0.01).The gene expression of TNF-a between group A and group B had no statistically difference.(P>0.05)Conclusion The statistically significant differences in MRI scores and histology scores illustrate that full-endoscopic technique of minimally invasive surgery successfully estabilish a goat model of lumbar intervertebral disc degeneration.Also the significant different gene expression of HIF-1、TNF-a、TGF-β、IL-1in nucleus pulposus tissue of the two groups further prove this conclusion with molecule evidence.

lumbar intervertebral disc degeneration；goat animal model；minimally invasive surgery

江蘇省衛(wèi)生國際交流支撐計劃及江蘇省中醫(yī)藥局領(lǐng)軍人才項目資助(BZ2008071)；江蘇省生命健康科技專項(BL2012069)

1008-5572(2015)08-0709-05

R332

A

2014-12-10

謝林(1965- )，男，主任醫(yī)師，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，210028。