李 焱 龔旗煌

（北京大學物理學院，北京 100871）

光學顯微鏡（optical microscope）在生物學和醫(yī)學等眾多科學技術(shù)以及生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.16世紀至18世紀細胞等生物學和醫(yī)學的重大發(fā)現(xiàn)幾乎都與顯微鏡的重要改進分不開.進入20世紀，光學顯微鏡又有重要突破，分辨能力進入納米尺度[1-7].2014年獲得諾貝爾化學獎的超分辨熒光顯微鏡，已是名副其實的“顯納鏡”（nanoscope）.

1 光學顯微鏡的原理

顯微鏡的發(fā)明，大大提升了人類的觀察能力，打開了人類認識微觀世界的大門.人類感官接收的外部信息中，約90%以上通過眼睛傳遞給大腦.眼睛看見物體形成視覺的過程可以簡化成以下幾步（見圖1）：來自物體的光穿過角膜和瞳孔到達晶狀體后折射，折射光線穿過玻璃體在視網(wǎng)膜上形成像，再經(jīng)視神經(jīng)傳導(dǎo)至大腦視覺中樞形成視覺.其中黃斑附近視神經(jīng)最發(fā)達，所以眼睛觀察物體時，通常將成的像調(diào)節(jié)到黃斑附近.由于瞳孔和晶狀體大小有限，而且感光細胞也有一定大小，當兩個物點距離太近時，形成的像斑重疊或落在同一感光細胞上時，眼睛便不能分辨.一般人眼的正常角分辨率為1′，對于眼睛敏感的綠光，兩個物點在1m處間隔大于0.3mm才能分辨清楚，亦即在明視距離（25cm）處兩個物點的間距要大于0.08mm才能分辨清楚.因此，人眼要看清整個長度僅為0.21mm的柄翅卵蜂等微小物體是極其困難的，但借助顯微鏡卻能做到.

圖1 眼睛成像示意圖

顯微鏡的使用已有400多年的歷史.16世紀，歐洲的眼鏡業(yè)已經(jīng)很發(fā)達，放大鏡廣泛使用，磨鏡技術(shù)大大提高，為顯微鏡的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ).1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)制造出類似顯微鏡的放大儀器.1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當時的光學工匠紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進.

光學顯微鏡的成像系統(tǒng)主要由靠近物體的物鏡和靠近眼睛的目鏡組成，如圖2所示.被觀察物體位于物鏡的前焦點外側(cè)附近，經(jīng)物鏡成一倒立的實像于目鏡前焦點內(nèi)側(cè)附近，這個中間像經(jīng)目鏡成一放大虛像于明視距離處.常規(guī)顯微鏡最大有效放大倍率接近500倍，分辨能力提升到亞微米.人們借助顯微鏡可以“看見”微米量級的微小物體.

2 光學顯微鏡的組成

圖2 光學顯微鏡成像原理圖

17世紀中葉，英國的羅伯特·胡克（Robert Hooke）和荷蘭的列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻.1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調(diào)焦機構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標本片的工作臺.這些部件經(jīng)過不斷改進，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分.常見的光學顯微鏡一般由載物臺、聚光照明系統(tǒng)、物鏡和目鏡組成的成像系統(tǒng)和調(diào)焦機構(gòu)組成.早期的光學顯微鏡只是光學元件和精密機械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像.后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器.現(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計算機后構(gòu)成完整的圖像信息采集和處理系統(tǒng)，如圖3所示.

圖3 光學顯微鏡的組成

3 光學顯微鏡對生物學發(fā)展的推動作用

顯微鏡的發(fā)明極大地促進了生物學和醫(yī)學等學科的發(fā)展.1665年，胡克利用顯微鏡觀察軟木的木栓組織上的微小氣孔，并命名為“細胞”.圖4為胡克顯微鏡.

圖4 胡克顯微鏡

1674年，列文虎克發(fā)現(xiàn)了原生動物，并隨后發(fā)現(xiàn)了“細菌”，創(chuàng)建微生物學，他還發(fā)明了高倍物鏡的研磨和拋光方法，被稱為“顯微鏡之父”.1833年，布朗 （Brown）通過顯微鏡觀察紫羅蘭，隨后發(fā)表了對“細胞核”的詳細論述.1857年，寇利克（Kolliker）發(fā)現(xiàn)了細胞中的“線粒體”.1879年，佛萊明 （Flemming）發(fā)現(xiàn)了動物細胞進行有絲分裂時，其清晰可見的染色體活動過程.人們借助顯微鏡逐漸描繪出細胞的結(jié)構(gòu)，植物葉肉細胞的立體結(jié)構(gòu)模型如圖5所示.

1888年，以卡嘉爾（Cajal）為首的組織學家發(fā)展出顯微鏡染色觀察法，為顯微解剖學奠定了基礎(chǔ).1932年，澤尼克（Zernike）發(fā)明出相襯顯微鏡，可以直接觀察活細胞和未染色標本，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學獎.1952年，諾馬斯基（Nomarski）發(fā)明了微分干涉相襯光學顯微鏡，能顯示細胞等立體影像.1988年，共焦掃描顯微鏡投入使用，不僅可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于進行細胞內(nèi)生化成分的定量分析和實現(xiàn)長時間活細胞動態(tài)觀察.1990年，發(fā)展了非線性光學多光子顯微成像技術(shù)，可以獲得生物細胞、活組織的長時間動態(tài)三維成像.

4 阿貝衍射極限

雖然光學顯微鏡發(fā)展迅速，但是人們繼續(xù)提高常規(guī)光學顯微鏡分辨能力卻遇到了不可逾越的障礙，常規(guī)光學顯微鏡不能分辨病毒或比其更小的東西，這是受到阿貝衍射極限的限制，如圖6所示.由于衍射的存在，物鏡、眼睛等無法把光線匯聚成無限小的點，而只會在像平面上形成有限大小的艾里斑（中心是很亮的斑，外圍是明暗相間的環(huán)）.光學儀器成像過程中，是把物平面上的無數(shù)微小的點轉(zhuǎn)換成艾里斑，然后再把它們疊加起來呈現(xiàn)在像平面上.

艾里斑的大小與光學系統(tǒng)有關(guān)，而能分辨的最小細節(jié)由瑞利判據(jù)決定.假如物平面上有兩個點，通過一個光學成像系統(tǒng)后產(chǎn)生兩個艾里斑.當這兩個點離得較遠時，像平面上的艾里斑也會離得較遠——此時我們可以很容易地分辨出物平面上有兩個點.如果把兩個點逐漸移近，艾里斑也會隨之接近.當這兩個艾里斑接近到一個圓斑中心與另一個圓斑邊緣重合的時候，我們達到能夠分辨出有兩個點的極限（這就叫瑞利判據(jù)）.如果這兩點再接近，像平面上的兩個艾里斑互相重疊在一起，實際看起來成為一個圓斑，那物平面上的兩個點就不能分辨了，如圖7所示.早在1872至1873年，阿貝（Ernst Abbe）通過分析指出，在常規(guī)光學顯微鏡中，恰能分辨時兩點的距離約為半波長.可見光中波長最短的藍光波長約400nm，這意味著光學顯微鏡能分辨出的物體最小距離約0.2μm（200nm）.因此0.2μm 成為光學顯微鏡能夠達到的最高分辨率，也就是我們通常所說的阿貝衍射極限.細胞的許多內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及大部分病毒的尺寸，都在200nm左右或者更小，常規(guī)光學顯微鏡就無能為力了.

圖7 阿貝衍射極限示意圖

5 光學“顯納鏡”—超分辨熒光顯微鏡

為了繞開阿貝衍射極限的限制，很多人選擇了其他顯微技術(shù)，利用光學近場掃描技術(shù)或非線性光學方法，或使用波長極短的電子顯微鏡（分辨率能達到0.2nm），但是這些方法不利于活體生物樣品大視角遠場實時觀察.2014年獲得諾貝爾化學獎的埃里克·貝齊格、斯特凡·黑爾和威廉·莫納（圖8）獨辟蹊徑，突破阿貝衍射極限，將分辨能力提升到納米量級，實現(xiàn)了超分辨熒光顯微技術(shù)，又大大推動了生物學和醫(yī)學的發(fā)展.

圖8 獲得2014年諾貝爾化學獎的3位科學家

超分辨率熒光顯微鏡利用了熒光分子的發(fā)光特性.熒光分子能夠吸收一種波長的光，放射出另外一種波長的光.熒光分子有一定的壽命，其持續(xù)發(fā)光一段時間后，將不能繼續(xù)發(fā)光.熒光分子可以是熒光蛋白質(zhì)分子，也可以是有機分子.

在莫納之前，人們觀測熒光分子時都是同時觀測到幾百萬甚至幾千萬個分子，得到的結(jié)果是其平均統(tǒng)計結(jié)果.而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人，在1989年，那是一項偉大的成就.能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要，并啟發(fā)大量化學家將他們的注意力轉(zhuǎn)向單分子研究，其中一位便是埃里克·貝齊格.雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2μm的愛里斑，但是在沒有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以通過大量統(tǒng)計而精確地定位，定位精度能可以達到1nm.

莫納的另一個貢獻是發(fā)現(xiàn)了像控制電燈泡一樣方便地控制熒光蛋白發(fā)光的方法即光激活（photoactivation）.1997年，莫納來到加州大學圣迭戈分校，后來被授予諾貝爾獎.綠色熒光蛋白技術(shù)的發(fā)明人錢永健也在這里任職.錢永健從水母體內(nèi)分離出發(fā)綠色熒光的蛋白，其重要意義在于它能夠讓活體生物體內(nèi)細胞的其他蛋白質(zhì)同樣變得可見.運用基因技術(shù)，科學家們將這些微小的綠色熒光蛋白與其他類型的蛋白進行結(jié)合.這樣，利用綠色熒光作為標記，科學家們便能知道那些被標記的蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)所處的位置.莫納注意到一種綠色熒光蛋白分子，其熒光可以被隨意地開啟或關(guān)閉.當用波長488nm的光激發(fā)這一蛋白質(zhì)時，它開始發(fā)出熒光，但過一會之后它就熄滅了.此后不管再使用多少光去照射它，這個蛋白質(zhì)的熒光都已經(jīng)死了.然而如果使用波長為405nm的光去照射它，這個蛋白質(zhì)又能再次復(fù)活并發(fā)出熒光.當該蛋白質(zhì)被再次激活，它會再次發(fā)出波長為488nm的熒光.莫納將這些可以被光激活的蛋白質(zhì)均勻分散到一種凝膠中，這樣其單個分子之間的距離就能大于阿貝衍射極限所限定的0.2μm的長度.由于這些分子被分散開來，一臺常規(guī)的光學顯微鏡便可以區(qū)分來自單個分子發(fā)出的熒光——它們就像是帶著開關(guān)的微小燈泡.這一發(fā)現(xiàn)顯示了通過光學手段操控單個分子熒光的可能性，解決了兩年多一直困擾著埃里克·貝齊格的問題.

貝齊格發(fā)明的超分辨率顯微鏡叫光激活定位顯微鏡（PALM：PhotoActivated Localization Microscopy），利用了莫納發(fā)現(xiàn)的光激活方法.貝齊格利用微弱的405nm激光照射樣品，使得其中極小部分熒光分子能夠發(fā)出熒光.由于這些發(fā)光的熒光分子很稀疏從而相距較遠，它們的位置能夠精確地確定下來.等這些分子失去活性后，再次照射405nm激光而激活另一小部分熒光分子.重復(fù)這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來，從而得到整個樣品的圖像，其原理如圖9所示.

圖9 單分子熒光顯微原理

溶酶體膜的光激活定位顯微鏡成像與傳統(tǒng)光學顯微鏡成像的比較如圖10所示，可以看出超分辨光激活定位顯微鏡確實是“顯納鏡”.

幾乎與貝齊格2006年發(fā)明PALM同時，哈佛大學化學系與物理系的華人教授莊小威也獨立發(fā)明了另一種超分辨率顯微鏡-隨機光學重構(gòu)顯微鏡 （STORM：STochastic Optical Reconstruction Microscopy）.PALM和STORM這兩種顯微技術(shù)不僅同年，而且原理也基本一致.不同之處在于貝齊格利用的是光激活蛋白，而莊小威使用的是有機熒光分子對.圖11是常規(guī)顯微鏡和STORM顯微鏡拍攝的線粒體圖像.

圖10 溶酶體膜的顯微成像

圖11 一個細胞中的線粒體

黑爾發(fā)明的受激發(fā)射損耗（STED：STimulated Emission Depletion）顯微技術(shù)，直接實現(xiàn)對點擴展函數(shù)的調(diào)制，能夠?qū)崿F(xiàn)更快的成像速度，對熒光染料依賴程度低，因此備受關(guān)注.科學家們利用受激發(fā)射原理可以冷卻熒光分子，即將一束特定激光束對準一個熒光分子，后者立即失去能量并變得黯淡.1994年，黑爾提出了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)的設(shè)想，計劃采用一束激光來激發(fā)所有的熒光分子，隨后利用另外一束激光讓所有分子熒光熄滅——那些位于中心位置上納米尺度空間內(nèi)的熒光分子除外.當進行記錄時則只記錄下這一納米部分.讓這一光束掃過整個樣品表面，并連續(xù)記錄光強信息，就有可能得到一張整體圖像.每次允許發(fā)出熒光的空間區(qū)域越小，最后得到的圖像分辨率便越高.于是，從原理上說，對于光學顯微成像的極限再也不復(fù)存在了，如圖12所示.

圖12 受激發(fā)射損耗顯微原理

多年以后這項理論才得以在實踐中被證實.在那段時間里，黑爾一邊繼續(xù)科研工作，一邊四處奔走籌集科研經(jīng)費.2000年，他證明了自己的技術(shù)方法在實際工作中是可行的.當時他對大腸桿菌進行了拍攝，其分辨率是此前任何光學顯微鏡都未能達到過的（圖13）.

圖14是常規(guī)顯微鏡和受激發(fā)射損耗顯微鏡拍攝的一個人類腦瘤樣本的對比圖像，不難看出超分辨受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)的巨大優(yōu)勢.

圖13 第一張由黑爾使用受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)拍攝的大腸桿菌圖像

圖14 一個人類腦瘤樣本

6 結(jié)語

超分辨熒光顯微技術(shù)是物理思想、化學方法、光學技術(shù)和分子探針相結(jié)合的產(chǎn)物，大大提高了人們認識微觀世界的能力，光學顯微鏡進入了“顯納鏡”時代，并在眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.光學顯微鏡不斷帶動許多學科的發(fā)展，現(xiàn)在的功能越來越強，也必將繼續(xù)促進科學技術(shù)和社會進步.

[1]谷祝平.光學顯微鏡[M].蘭州：甘肅人民出版社，1985.

[2]光學顯微鏡網(wǎng)站：http：／／micro.magnet.fsu.edu／primer／index.html

[3]毛崢樂，王琛，程亞.超分辨遠場生物熒光成像 -突破光學衍射極限[J].中國激光，2008，35（9）：1283-1307.

[4]李明.超分辨顯微，至極至美：2014年諾貝爾化學獎述評[J].物理，2014，43（12）：813-816.

[5]2014年諾貝爾化學獎網(wǎng)站和相關(guān)文獻：http：／／www.nobelprize.org／nobel＿prizes／chemistry／laureates／2014／

[6]顧牡，王青.有光的日子—— 寫在2015國際光年 [J].物理與工程，2015，25（1）：封2.

[7]鐘錫華 .光，你這個精靈 [J].物理與工程，2015，25（1）：14-19.