谷祖敏, 周 飛, 畢 卉, 李寶聚, 張 兵, 田小穎

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110161;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

香菇菌糠對(duì)綠色木霉防治黃瓜枯萎病的增效作用

谷祖敏1, 周 飛1, 畢 卉1, 李寶聚2*, 張 兵1, 田小穎1

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110161;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

試驗(yàn)以栽培香菇剩余的菌糠為原料,采用室內(nèi)抑菌試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)相結(jié)合的方法探討了香菇菌糠對(duì)綠色木霉防治黃瓜枯萎病的增效作用。菌糠提取液對(duì)綠色木霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)表現(xiàn)促進(jìn)作用,促進(jìn)率分別為18.20%和9.82%;對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)表現(xiàn)抑制作用,抑制率分別為11.85%和87.78%。香菇菌糠與木霉混合使用對(duì)黃瓜枯萎病的防效達(dá)70.26%,黃瓜的地上部分鮮重和根重分別增加了65.06%和58.10%。與單用木霉相比,加入香菇菌糠后綠色木霉在土體土、根際土和根系中定殖數(shù)量分別提高了251.39%、208.21%和104.76%,黃瓜枯萎病菌數(shù)量分別減少了56.98%、77.72%和76.83%。

菌糠; 綠色木霉; 黃瓜枯萎病; 生物防治

黃瓜枯萎病是由半知菌亞門(mén)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)侵染引起的維管束病害。在露地和保護(hù)地栽培黃瓜上均可發(fā)生,發(fā)病率一般為10%～30%,重茬地嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%～90%[1]。木霉生長(zhǎng)繁殖速度快,能迅速占領(lǐng)空間,競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分,可分泌抗生物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng),對(duì)植物病原菌具有重寄生作用,被認(rèn)為是極有價(jià)值的植病生防因子[2]。但木霉單獨(dú)使用時(shí)因受環(huán)境的影響其生存能力和定殖能力較弱,從而影響其生物活性的發(fā)揮,使其生防效果的穩(wěn)定性和持久性均較差[3-4]。近年來(lái)一些研究將木霉與優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥結(jié)合起來(lái)使用,使其在植物的土傳病害防治和植株生長(zhǎng)方面有一定的積極促進(jìn)作用[5-6]。菌糠是利用農(nóng)業(yè)秸稈、木屑等原料進(jìn)行食用菌栽培,出菇后的培養(yǎng)基剩余物。菌糠富含蛋白質(zhì)、多糖和礦物質(zhì),將其與生防菌混合使用,將會(huì)改善田間土壤環(huán)境,促進(jìn)拮抗菌的生存和定殖,提高拮抗菌防治病害的效果。

本文通過(guò)室內(nèi)抑菌測(cè)定和盆栽試驗(yàn),探索香菇菌糠與綠色木霉混合使用對(duì)黃瓜枯萎病的發(fā)生以及對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)的影響,為進(jìn)一步研發(fā)拮抗菌強(qiáng)化的微生物有機(jī)肥、預(yù)防和控制蔬菜土傳病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：生防菌株為綠色木霉(Trichoderma viride)TR-8;致病菌株為尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum),均由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)試驗(yàn)室提供。

供試菌糠：香菇菌糠由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

供試黃瓜種子：‘荷蘭M6’。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 m L)用于培養(yǎng)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌;玉米粉沙土培養(yǎng)基(玉米粉∶沙土∶水=1∶1∶0.8)用于盆栽試驗(yàn)中擴(kuò)繁黃瓜枯萎病菌接種物;麥麩稻殼玉米粉培養(yǎng)基(麥麩∶稻殼∶玉米粉=6∶1.5∶2.5,水適量)用于盆栽試驗(yàn)中擴(kuò)繁綠色木霉接種物;鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,Fe-Na-EDTA 0.01 g,L-天門(mén)冬酰胺2.0 g,D-半乳糖20.0 g,蒸餾水1 000 m L,Na2B4O7·10H2O 1.0 g,硫酸鏈霉素0.3 g,用于鐮刀菌的選擇性培養(yǎng);孟加拉紅培養(yǎng)基用于木霉的培養(yǎng)。

供試土壤：草炭土和蛭石1∶1混合作為育苗土;消毒菜園土、草炭土、蛭石按4∶1∶1作為移栽土壤。

1.2 香菇菌糠提取液的制備

將香菇菌糠粉碎,稱取50 g樣品放入三角瓶中,加無(wú)菌水500 mL,常溫振蕩浸泡24 h,8層紗布過(guò)濾,濾液用細(xì)菌過(guò)濾器(d=0.22μm)過(guò)濾,加無(wú)菌水定容至500 mL,獲得100 mg/mL菌糠提取液,然后用無(wú)菌水依次稀釋至50.25、12.5和6.25 mg/m L。

1.3 香菇菌糠提取液對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定。分別取1 mL不同濃度菌糠提取液加到培養(yǎng)皿中,然后加入融化后冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基,充分混合均勻。凝固后,在平板中央分別接種黃瓜枯萎病菌和綠色木霉菌餅(d=0.5 cm),以加無(wú)菌水為對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù)。處理后置于25℃恒溫箱中培養(yǎng),3 d后測(cè)量綠色木霉菌落直徑,7 d后測(cè)量枯萎病菌菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

1.4 香菇菌糠提取液對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

分別取20μL綠色木霉和黃瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液滴于凹玻片上,然后分別加入20μL不同濃度的菌糠提取液,混勻后25℃保濕培養(yǎng)24 h,顯微鏡下測(cè)定孢子萌發(fā)率,以加等量無(wú)菌水的處理作為空白對(duì)照,計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率,每個(gè)處理3次重復(fù)。孢子萌發(fā)抑制率(%)=(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

1.5 盆栽試驗(yàn)測(cè)定香菇菌糠對(duì)綠色木霉防治黃瓜枯萎病和促進(jìn)植株生長(zhǎng)的影響

黃瓜枯萎病菌接種物的制備 黃瓜枯萎病菌接種至PDA平板中,25℃培養(yǎng)7 d,從菌落邊緣打取菌餅(d=0.5 cm),然后將菌餅接種至裝有玉米粉沙土培養(yǎng)基的三角瓶中,每瓶接種4個(gè)菌餅,25℃恒溫培養(yǎng)14 d,待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿菌絲后,將含菌絲的培養(yǎng)基取出,作為病原菌接種物備用。

綠色木霉接種物的制備 綠色木霉接種至PDA平板中,25℃培養(yǎng)5 d,從菌落邊緣打取菌餅(d=0.5 cm),然后將菌餅接種至裝有麥麩稻殼玉米粉培養(yǎng)基的三角瓶中,每瓶接種4個(gè)菌餅,25℃恒溫培養(yǎng)10 d,將培養(yǎng)物過(guò)篩,獲得綠色木霉分生孢子。

防病盆栽試驗(yàn) 先將綠色木霉分生孢子加入到育苗土中,充分混勻,土壤中木霉孢子濃度為106個(gè)/g土,然后將菌糠分別按照3%、6%、9%、12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例與育苗土混合,裝入育苗盤(pán)中,播種事先催芽的黃瓜種子。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照,CKⅠ為單獨(dú)木霉處理, CKⅡ?yàn)榭瞻讓?duì)照(育苗土中無(wú)木霉和菌糠),每個(gè)處理5次重復(fù)。7 d之后移栽到營(yíng)養(yǎng)缽(18 cm×12 cm)中,營(yíng)養(yǎng)缽中裝有含4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的黃瓜枯萎病菌接種物的土壤,每缽移栽3株黃瓜幼苗,處理后將營(yíng)養(yǎng)缽置于溫度25℃、相對(duì)濕度60%～70%的氣候培養(yǎng)箱中,14 d后調(diào)查黃瓜發(fā)病情況。

防病結(jié)果調(diào)查 黃瓜枯萎病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考柏敏戰(zhàn)等的方法[7]。1級(jí),無(wú)癥狀;2級(jí),1片或2片子葉明顯變黃,以致脫落;3級(jí),1片或2片真葉變黃或全株發(fā)黃,子葉稍萎蔫下垂;4級(jí),全株明顯萎蔫或真葉嚴(yán)重變黃,生長(zhǎng)受抑制、矮化;5級(jí),全株嚴(yán)重萎蔫以致枯死。按下式計(jì)算病情指數(shù)和防病效果。病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù)),防病效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100。同時(shí)調(diào)查植株生物量,將植株拔出用剪刀沿莖基部剪開(kāi),根系洗凈、晾干,稱重各處理地上部分鮮重(莖和葉)和地下部分鮮重(根系),計(jì)算植株生長(zhǎng)促進(jìn)率。促進(jìn)率(%)=(處理根或莖鮮重-對(duì)照根或莖鮮重)/對(duì)照根或莖鮮重×100。

1.6 香菇菌糠對(duì)綠色木霉和枯萎病菌數(shù)量影響的測(cè)定

防病盆栽試驗(yàn)結(jié)果調(diào)查后,每個(gè)處理隨機(jī)抽取3個(gè)盆缽,每缽采集3個(gè)部位的樣品進(jìn)行木霉和鐮刀菌計(jì)數(shù)。(1)土體土壤采集：將黃瓜根系周圍的土體土壤充分混勻后,取100 g混合樣品。(2)根際土壤采集：抖落粘在黃瓜根系表面的土壤后,稱重根系,按每克根加9 mL無(wú)菌水的比例放入裝有玻璃珠的試管中,置于渦旋儀上渦旋5 min,洗脫在無(wú)菌水中的土壤即為根際土壤。(3)根系采集：取黃瓜根1 g,75%乙醇消毒3 min,無(wú)菌水沖洗3次,無(wú)菌濾紙吸干后,于滅菌的研缽中研磨成勻漿,加入9 mL無(wú)菌水,振蕩混勻。

枯萎病菌和木霉計(jì)數(shù)采用稀釋平板法。將土樣或根系研磨液稀釋至適當(dāng)濃度,各吸取0.1 m L分別放入鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基和木霉培養(yǎng)基平板中,涂布均勻,于28℃培養(yǎng)3 d,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析,Duncan’s新復(fù)極差法(P＜0.05)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇菌糠提取液對(duì)綠色木霉和枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知,香菇菌糠提取液濃度低于12.5 mg/mL時(shí)對(duì)兩種菌生長(zhǎng)影響不大,和對(duì)照差異不顯著。隨著菌糠提取液濃度的增加,對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的作用,促進(jìn)了綠色木霉的生長(zhǎng)而抑制了黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng),不同濃度之間差異顯著。濃度為100 mg/m L菌糠提取液對(duì)綠色木霉菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)率為18.20%,對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為11.85%。

表1 不同濃度香菇菌糠提取液對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響1)Table 1 Effect of different concentration extract from mushroom residuum on mycelium growth of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum and Trichoderma viride

2.2 香菇菌糠提取液對(duì)木霉和枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

香菇菌糠提取液對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌的孢子萌發(fā)也表現(xiàn)不同的作用(表2)。低濃度的提取液對(duì)綠色木霉孢子萌發(fā)基本無(wú)影響,提取液濃度的增加不同程度促進(jìn)了孢子的萌發(fā),濃度為100 mg/mL時(shí)對(duì)木霉孢子萌發(fā)的促進(jìn)率達(dá)9.82%。不同濃度的香菇菌糠提取液對(duì)黃瓜枯萎病菌的孢子萌發(fā)均有抑制作用,濃度越高抑制作用越強(qiáng),不同濃度之間抑制作用差異顯著。在最高濃度100 mg/mL時(shí)對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率高達(dá)87.78%。

表2 不同濃度香菇菌糠提取液對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of different concentration extract from mushroom residuum on spore germination of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum and Trichoderma viride

2.3 香菇菌糠對(duì)木霉防治黃瓜枯萎病和黃瓜生物量的影響

溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示,育苗時(shí)高濃度菌糠的添加對(duì)綠色木霉防治黃瓜枯萎病表現(xiàn)顯著的增效作用。木霉單獨(dú)使用時(shí)防效僅為45.12%,加入3%菌糠對(duì)木霉的防病作用影響較小,與單用木霉相比較,防效差異不顯著。隨著菌糠濃度加大,木霉的防病作用顯著增加,在菌糠濃度為12%時(shí)防效達(dá)到70.26%,比單用木霉提高了55.72%。

從表3看出,木霉可以明顯促進(jìn)黃瓜根系和植株的生長(zhǎng)發(fā)育,加入菌糠后這種促進(jìn)作用顯著增加。不同濃度的菌糠和木霉混合對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用差異顯著。在含有木霉的育苗基質(zhì)中加入12%的菌糠,地上部分鮮重和地下部分鮮重分別增加了65.06%和58.10%,與單用木霉相比,分別提高了181.04%和204.99%。

表3 香菇菌糠對(duì)綠色木霉防治黃瓜枯萎病和黃瓜生物量的影響Table 3 Effect of mushroom residuum on control efficiency against cucumber wilt and cucumber biomass

2.4 香菇菌糠對(duì)木霉和黃瓜枯萎病菌數(shù)量的影響

施入菌糠對(duì)土壤中生防菌和致病菌在植物根系和土壤中的定殖有明顯的影響(表4)。菌糠的添加顯著增加了綠色木霉在土壤、根際和根系中定殖的數(shù)量,施用12%菌糠的處理檢測(cè)到的木霉數(shù)量最多,在土體土、根際土和根系中木霉數(shù)量分別為71.86× 104、167.42×104和0.43×104cfu/g,與單用木霉相比數(shù)量分別提高了251.39%、208.21%和104.76%。育苗土中加入綠色木霉顯著降低了土壤和根系中枯萎病菌的數(shù)量,木霉單獨(dú)使用的處理枯萎病菌在土體土、根際土和根系中的數(shù)量顯著低于空白對(duì)照,加入香菇菌糠后各部位枯萎病菌數(shù)量更是顯著減少。菌糠濃度為12%時(shí)在土體土、根際土和根系中枯萎病菌數(shù)量分別為18.94×104、15.57×104和2.28× 104cfu/g,與單用木霉相比數(shù)量分別減少了56.98%、77.72%和76.83%?？傮w來(lái)看,綠色木霉和枯萎病菌在根際土中定殖數(shù)量最多,其次是土體土,而在根系中數(shù)量最少。土體土和根際土中兩種菌的數(shù)量在不同濃度菌糠的處理間差異顯著,而在根系中低濃度間差異不顯著。

表4 香菇菌糠對(duì)綠色木霉和黃瓜枯萎病菌數(shù)量的影響Table 4 Effect of mushroom residuum on the quantity of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum and Trichoderma viride

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外利用菌糠和木霉結(jié)合防治土傳病害主要集中在將菌糠二次利用,作為木霉的培養(yǎng)基質(zhì)使用,如高葦?shù)萚8]、周巍等[9]、李進(jìn)一等[10]將綠色木霉先接種到菌糠上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),然后將菌糠發(fā)酵物再拌土處理來(lái)防治黃瓜立枯病和枯萎病。Kleifeld等同樣以菌糠為基質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)木霉后栽培辣椒,研究哈茨木霉在辣椒根際的定殖和防病作用[11]。本研究在前期確認(rèn)香菇菌糠對(duì)生防菌和致病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)影響的基礎(chǔ)上,將菌糠作為木霉防病的增效劑添加到育苗土中,結(jié)果證實(shí)香菇菌糠顯著提高了木霉對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果,并且提高了木霉在土壤和根系中定殖的數(shù)量。

香菇菌糠對(duì)綠色木霉防病起增效作用主要與香菇菌糠對(duì)致病菌和生防菌表現(xiàn)不同的作用有關(guān)。黃瓜枯萎病作為一種土傳病害,其是否發(fā)病以及發(fā)病嚴(yán)重程度除了受環(huán)境因素如溫度、濕度等影響之外,主要取決于土壤中病原菌的數(shù)量。從致病菌的角度來(lái)看,香菇菌糠中含有某種特殊物質(zhì),強(qiáng)烈抑制黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā),輕微抑制菌絲生長(zhǎng),這種抑制作用一定程度上減少了枯萎病菌的數(shù)量和病菌的致病作用。從生防菌的角度來(lái)看,香菇菌糠對(duì)綠色木霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)表現(xiàn)促進(jìn)作用。香菇菌糠對(duì)綠色木霉來(lái)說(shuō)是一種“養(yǎng)分”,促使木霉快速生長(zhǎng)和繁殖,提供更多的木霉發(fā)揮生防作用,也提高了木霉在土壤中的競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和侵染位點(diǎn)的能力,從而有效抑制病原菌的侵染。

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(責(zé)任編輯：王 音)

Synergism action of mushroom residuum on Trichoderma viride against cucumber Fusarium wilt

Gu Zumin1, Zhou Fei1, Bi Hui1, Li Baoju2, Zhang Bing1, Tian Xiaoying1

(1.College of Plant Protection,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China;2.Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

The synergism action of mushroom residuum on Trichoderma viride against cucumber Fusarium wilt was investigated through inhibitory activity in laboratory and greenhouse pot experiment.Extract of mushroom residuum promoted the mycelium growth and spore germination of T.viride with the rate of 18.20%and 9.82%,respectively.Further more,the extract could inhibit the mycelium growth and spore germination of Fusarium oxysporum by 11.85%and 87.78%,respectively.The mixture of mushroom residuum and T.viride caused 70.26%control efficiency to Fusarium wilt,65.06%and 58.10%fresh weight increase in overground part and underground part,respectively.Compared with the treatment of T.viride used solely,the mixture could increase the quantity of T.viride in bulk soil,rhizosphere soil and cucumber roots by 251.39%,208.21%and 104.76%, respectively,and decrease that of F.oxysporum by 56.98%,77.72%and 76.83%,respectively.

mushroom residuum; Trichoderma viride; Fusarium wilt of cucumber; biological control

S 476.19

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.039

2014-09-26

2014-12-23

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014159)

*通信作者 E-mail：libj@mail.caas.net.cn