譙天敏, 羅 蓉, 朱天輝

(四川農(nóng)業(yè)大學林學院,成都 611130)

南方紅豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞桿菌的鑒定

譙天敏, 羅 蓉, 朱天輝*

(四川農(nóng)業(yè)大學林學院,成都 611130)

經(jīng)形態(tài)學特征觀察、致病性測定及rDNA-ITS序列分析,首次確定紅豆杉根腐病病原為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。采用平板對峙培養(yǎng)法從健康植株根際土壤中篩選得到3株對尖孢鐮刀菌具有明顯拮抗作用的芽胞桿菌YB6、YB15、YB37。經(jīng)形態(tài)學、生理生化及16S rDNA同源性分析,并通過構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹,將YB6、YB15和YB37分別鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)和多黏類芽胞桿菌(Paenibacillu polymy xa),其中多黏類芽胞桿菌拮抗效果最好,具有進一步研究開發(fā)的潛力。本研究通過對南方紅豆杉根腐病病原鑒定及其拮抗芽胞桿菌的篩選,對該病的防治提供了理論依據(jù)。

南方紅豆杉; 根腐病; 尖孢鐮刀菌; 拮抗芽胞桿菌

紅豆杉在資源植物中具有較突出的地位[1],它是集藥用、觀賞、綠化、特種優(yōu)質(zhì)用材為一體的珍貴樹種,其根、莖、葉中可提取一種近年來全球緊俏的高新技術(shù)抗癌新藥成分紫杉醇[2]。天然紅豆杉資源非常有限,遠遠不能滿足醫(yī)藥市場的需求[3],所以人工種植的紅豆杉成為提取紫杉醇的主要來源。南方紅豆杉因其出苗率較高而被選為人工栽種的優(yōu)良種。但南方紅豆杉實生苗繁殖慢,扦插繁殖技術(shù)要求高,尤其苗期病蟲害發(fā)生較多[4]。近年來,隨著南方紅豆杉人工種植面積的擴大,病害逐年加重,對紫杉醇的生產(chǎn)供應產(chǎn)生了極大的影響。

目前,國內(nèi)有關(guān)紅豆杉病害的研究較少。范曉龍等[2]根據(jù)Sutton[5]的炭疽病分類鑒定方法對南方紅豆杉炭疽病病原進行了分離鑒定。有關(guān)紅豆杉根腐病病原分離、鑒定及其拮抗菌的篩選等研究尚未見報道。根腐病是一種較難防治的土傳病害[6],生產(chǎn)上常采用化學防治方法,但化學農(nóng)藥的大量不合理使用給生態(tài)環(huán)境及人類帶來了不良影響[7],也無法達到根治的效果。生物防治方法因具有安全、經(jīng)濟、長效和不污染環(huán)境等特點而逐漸成為防治病蟲害的有效手段。微生物農(nóng)藥的開發(fā)利用是生物防治未來的主要趨勢,拮抗菌株的篩選和鑒定則是微生物農(nóng)藥開發(fā)的基礎[8]。

本試驗從發(fā)病的南方紅豆杉根部分離出一株致病菌株,從形態(tài)學、致病性和分子生物學等方面進行了鑒定,并針對該病原菌篩選出3株拮抗作用較好的芽胞桿菌,以期為南方紅豆杉根腐病的有效防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

從雅安市天賜苗木有限公司洪雅縣生產(chǎn)基地采集具有南方紅豆杉根腐病典型癥狀的新鮮病株進行室內(nèi)鑒定。采用常規(guī)組織分離法[9]進行分離：先用無菌水將新鮮的病株根部沖洗干凈,觀察根部癥狀。從病健交界處切取4 mm×4 mm的病組織,在70%乙醇中浸泡1～2 min,再移至0.1%的升汞中滅菌3～4 min,接著用無菌水洗3～4次。在無菌條件下將病組織接種至PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),長出菌絲后,取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)至新鮮PDA上培養(yǎng),經(jīng)單孢純化后獲得菌種,保存于PDA斜面上,并于4℃冰箱中備用。

1.2 病原鑒定

1.2.1 致病性測定

用柯赫氏法則(Koch’s postulate)驗證病原菌的致病性。將分離并純化的真菌移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后,加20 m L無菌水洗下孢子,制成濃度為106～107個的真菌孢子懸浮液,然后采用傷口接種法[9](在健康無病、生長良好的植株基部距離土面3～5 cm處用滅菌刀輕輕弄傷根系表皮,使之形成傷口),在傷口處滴孢子懸浮液2 m L/株,3次重復,每次重復接種10株,以無菌水處理作對照。每天定時觀察植株發(fā)病情況并做記錄。從接種發(fā)病的病株根部取腐根木質(zhì)部和韌皮部病健交界處組織,用組織分離法分離病原菌,并進行鑒定。

1.2.2 病原菌的形態(tài)觀察

將分離獲得的優(yōu)勢菌株在PDA上培養(yǎng),于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,在此期間觀察記錄病原菌菌株的培養(yǎng)特征,包括菌落顏色、形態(tài)和菌落生長速度;制作切片,在光學顯微鏡下觀察有無大、小型分生孢子和厚垣孢子及其大小、形狀和著生方式;隔膜有無及其數(shù)目、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等。參考Booth鐮刀菌分類標準[10]和真菌鑒定手冊[11]進行鑒定。

1.2.3 病原菌r DNA-ITS序列分析

1.2.3.1 DNA的提取

采用搖床振蕩培養(yǎng)方法液體培養(yǎng)病原菌,具體操作：接種病原菌菌株于PDA培養(yǎng)基上,室溫下連續(xù)培養(yǎng)3 d后,取菌落邊緣菌絲少許,轉(zhuǎn)接于裝有100 m L PD液體培養(yǎng)基的300 m L錐形瓶中,25℃, 125 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。收集菌絲體,先用無菌水沖洗干凈,再用無菌濾紙吸干多余水分。收集的菌絲置于-20℃條件下保存?zhèn)溆??；蚪MDNA的提取參照天根植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟。

1.2.3.2 PCR擴增

擴增r DNA片段的引物為真菌通用引物ITS1和ITS4,上海生工技術(shù)公司合成。其序列分別為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反應擴增體系(20μL)包括：基因組DNA 1μL,10×PCR buffer 2μL,0.25 mmol/L d NTP 1μL,5 U/μL r Taq 0.2μL,1μmol/L ITS1 0.5μL,1μmol/L ITS4 0.5μL,dd H2O 14.8μL。反應程序為：96℃預變性5 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物的檢測在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上進行。

1.2.3.3 產(chǎn)物的回收克隆

參照林劍偉等[12]的方法,利用回收試劑盒(天根植物基因組DNA提取試劑盒)對目標基因片段進行切膠、回收、純化。將回收的PCR產(chǎn)物連接至p MD18-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài),利用菌落PCR篩選陽性克隆[13],送上海生工技術(shù)公司進行測序。

1.2.3.4 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序所得的片段序列,登錄NCBI進行BLAST比對,從GenBank中下載與所得片段同源性較高的菌株的rDNA-ITS序列,利用MEGA 5.0建立病原菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,進行基于rDNA-ITS的序列分析。

1.3 拮抗芽胞桿菌的篩選與鑒定

1.3.1 篩選

1.3.1.1 分離純化

從雅安市天賜苗木有限公司洪雅縣南方紅豆杉栽培基地采集健康植株根際土樣,風干備用。稱取土樣10 g,放入盛有90 m L無菌水和玻璃珠的三角瓶中,搖床上劇烈振蕩30 min后于80℃的水浴中保持20 min。用無菌水進行梯度稀釋并涂布NA平板,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h左右,挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落進入初篩。

1.3.1.2 初篩

以病原菌為指示菌,采用PDA平板對峙生長法。平板中央先移入直徑為3 mm的病原菌的瓊脂塊,再將分離得到的菌株點接在距平板中央3 cm處的4個角點上,每個菌株3次重復,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d,選出對病原菌生長有抑制作用的菌株進入復篩。

1.3.1.3 復篩

將初篩得到的菌株采用平板對峙法進行反復篩選,每個菌株3次重復,置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d,選出對病原菌生長抑制效果明顯的菌株,并測量抑菌帶大小(細菌菌落中心至病原菌菌絲邊緣的距離)和計算抑菌率,直到篩出抑菌圈半徑較大,被抑病原菌菌絲邊緣平齊且拮抗作用持久的菌株。

抑菌率(%)=(對照病原菌菌落直徑—處理病原菌菌落直徑)/對照病原菌菌落直徑×100。

1.3.2 鑒定

1.3.2.1 形態(tài)特征

參照沈萍等[14]的方法,觀察拮抗芽胞桿菌在NA培養(yǎng)基上的生長特征和顯微形態(tài)特征。

1.3.2.2 生理生化特征

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[15]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]、Gordon等的《芽胞桿菌屬》[17]和王大耜的《細菌分類基礎》[18],對拮抗作用較好的菌株進行相關(guān)生理生化指標的測定。

1.3.2.3 16S r DNA同源性分析

采用搖床振蕩培養(yǎng)方法液體培養(yǎng)拮抗菌株18～24 h,收集菌體,以DP305離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒(由北京天根生化科技有限公司提供)提取的基因組DNA為模板,采用細菌16S r DNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3')進行PCR擴增。25μL反應液：2×PCR Master mix 12.5 mL,引物27F和1492R濃度0.2μmol/ L,各0.75 mL,目的DNA 1μL,dd H2O 10μL。PCR反應程序參照杜毓博等[19]：94℃5 min;94℃30 s、55℃45 s、72℃60 s,30個循環(huán);72℃7 min。反應結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果,用Promega公司的Wizard PCR產(chǎn)物純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化,回收目的片段,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

根據(jù)上海生工技術(shù)公司發(fā)回的片段序列,登錄NCBI進行BLAST比對,從GenBank中下載同源性較高菌株的16S r DNA序列,利用MEGA 5.0建立拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,進行基于16S r DNA的序列同源性分析。

2 結(jié)果分析

2.1 病原鑒定

2.1.1 病害癥狀

南方紅豆杉根腐病危害面積大,病癥嚴重,且潛伏周期較長,一旦發(fā)現(xiàn)病害便是大面積植株已受到傷害,發(fā)病率達到80%,這給防治工作帶來很大困難。采樣地點發(fā)病植株多是10 cm左右的栽培苗,受害面積大,給當?shù)氐纳a(chǎn)者帶來很大的經(jīng)濟損失。病株發(fā)病時根部受病菌侵染初呈褐斑,后皮層腐爛(干腐)變黑,發(fā)霉,木質(zhì)部變色,尤其是主根皮層腐爛水漬狀,后呈紅褐色,病株葉片變褐由下往上,由內(nèi)向外,嚴重時枝葉萎蔫失水,最后導致全株死亡。

2.1.2 病原菌的分離和致病性測定

采用常規(guī)組織分離法[9],從發(fā)病的植株根部分離得到7株病原菌菌株,純化后培養(yǎng)比較,發(fā)現(xiàn)各菌株形態(tài)特征一致,為同一種真菌。分離菌株經(jīng)傷口接種法接種于健康南方紅豆杉植株根部后,20 d后發(fā)病。試驗結(jié)果顯示發(fā)病癥狀與初始感染南方紅豆杉根腐病癥狀一致,發(fā)病率達到100%,對照組沒有癥狀出現(xiàn),將接種發(fā)病的南方紅豆杉腐根進行再次分離,分離物與第1次得到的分離物菌落形態(tài)一致,產(chǎn)生的孢子也與第1次分離的孢子形態(tài)一致。

2.1.3 病原菌形態(tài)特征

病原菌在PDA平板上,于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),菌落平均生長速率為1.21 cm/d,其中在培養(yǎng)第3天到第4天增長速率最大。5 d后,菌落直徑約為6.0 cm,菌落圓形,氣生菌絲茂盛,致密,為白色絨毛狀;菌落邊緣菌絲呈放射狀,菌落背面中央淡紫色,邊緣乳白色(圖1)。鏡檢發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲透明,產(chǎn)孢細胞為瓶狀,共產(chǎn)生大小兩種分生孢子,營養(yǎng)條件不佳時產(chǎn)生厚垣孢子。小型分生孢子(圖2)居多,卵形、腎形,無色無隔,假頭狀聚生,大小為(4.1～14.4)μm×(2.4～3.9)μm;大型分生孢子(圖2)鐮刀形,兩端漸均勻變細,略彎曲,足孢顯著,1～3個隔,大小為(14.2～21.53)μm×(2.0～3.9)μm,平均17.16μm ×2.6μm;厚垣孢子球形或卵形,間生或頂生。根據(jù)以上形態(tài)特征以及田間癥狀,依據(jù)Booth鐮刀菌分類標準[12],并參考《真菌鑒定手冊》[13],初步鑒定該病原菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

圖1 病原菌菌落正面(a)與反面(b)圖Fig.1 The front(a)and back(b)of the pathogenic bacterial colonies

2.1.4 病原菌r DNA-ITS序列分析

采用真菌ITS1/ITS4通用引物對其進行PCR擴增,得到一條大小約500 bp明亮清晰的片段。測序結(jié)果顯示,該序列長度為520 bp,將該序列與Gen-Bank中的核酸序列進行同源性比對,發(fā)現(xiàn)該病原菌菌株的ITS序列與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)(登錄號：EF611088)的ITS序列同源性達到了100%。選取NCBI登錄的尖孢鐮刀菌及相近屬rDNA-ITS序列,進一步用軟件DNAMAN和MEGA5.0進行多重比對,并采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。

圖2 病原菌的小型(a)和大型(b)分生孢子Fig.2 The small(a)and big(b)conidia of the pathogen

圖3 基于ITS序列分析構(gòu)建的南方紅豆杉根腐病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of the pathogen causing root rot of Taxus chinensis var.mairer based on ITSsequence analysis

2.2 拮抗芽胞桿菌的分離篩選和鑒定

2.2.1 分離篩選結(jié)果

經(jīng)涂布培養(yǎng),共分離出37株能在NA培養(yǎng)基上生長良好且外表性狀不同的菌株,命名為YB1～YB37。經(jīng)初篩,共篩選出9株對病原有拮抗效果的菌株,分別為YB6、YB9、YB15、YB18、YB20、YB27、YB30、YB36、YB37。采用PDA平板對峙生長法對初篩得到的9株菌株進行反復篩選,最終篩選出3株對南方紅豆杉病原菌拮抗效果良好的菌株,分別為YB6、YB15和YB37,3株拮抗菌株的抑菌率都在30%以上,其中YB37拮抗效果最好,拮抗抑菌帶達到10 mm。3株拮抗菌株對南方紅豆杉根腐病病原菌的拮抗效果見表1和圖4。

表1 3株拮抗菌對南方紅豆杉根腐病菌的拮抗效果(對峙培養(yǎng)5 d)1)Table 1 Inhibitory effects of the three bacterial strains(culture for 5 d)

圖4 3株拮抗菌與病原菌對峙培養(yǎng)5 d的拮抗效果圖Fig.4 Antagonistic effects of the inhibitory strains against the pathogen cultured for 5 days

2.2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.2.1 形態(tài)特征和生理生化特征

拮抗菌株接種于NA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,挑取菌體革蘭氏染色,電子顯微鏡下觀察形態(tài),48 h后觀察菌落特征,結(jié)果見表2。根據(jù)表中描述,YB6、YB15、YB37分別與蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、多黏類芽胞桿菌(P.polymyxa)形態(tài)基本一致。

表2 3株拮抗菌株的菌落形態(tài)及特征Table 2 The colony morphology and characteristics of three antagonistic strains

生理生化試驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明,YB6、YB15和YB37分別與蠟樣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌和多黏類芽胞桿菌生理生化特征基本一致。

表3 3株拮抗菌株的生理生化特性1)Table 3 The physiological and biochemical characteristics of three antagonistic strains

2.2.2.2 16S r DNA同源性分析結(jié)果

采用細菌通用引物27F/1492R對拮抗菌YB6、YB15、YB37的16S r DNA進行基因PCR擴增,分別得到大小約1 500 bp片段,產(chǎn)物的測序結(jié)果表明YB6、YB15、YB37擴增片段大小分別為1 221、1 222、1 243 bp(圖5)。

圖5 3株拮抗菌的電泳圖像Fig.5 Electrophoresis of the three antagonistic strains

將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行BLAST比對,結(jié)果顯示,YB6、YB15、YB37序列長度分別為1 221、1 222、1 243 bp。YB6與蠟樣芽胞桿菌(登錄號：GQ344805.1)的16S rDNA同源性達到了100%,YB15與解淀粉芽胞桿菌(登錄號：JN700147.1)的16S rDNA同源性達到了99%,YB37與多黏類芽胞桿菌(登錄號：JQ283974.1)的16SrDNA同源性達到了99%。選取NCBI登錄的芽胞桿菌或類芽胞桿菌及相近屬16S rDNA序列,進一步用DNAMAN和MEGA5.0并采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如下(圖6)：

圖6 3株拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of the three antagonistic strains

由圖可知,YB6和YB15屬芽胞桿菌屬,YB37屬類芽胞桿菌屬,結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征,最終鑒定YB6、YB15、YB37分別為蠟樣芽胞桿菌(B. cereus)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)和多黏類芽胞桿菌(P.polymy xa)。

3 討論

作者從雅安市天賜苗木有限公司洪雅縣生產(chǎn)基地采集的具有南方紅豆杉根腐病典型癥狀的新鮮病株上分離得到一株病原菌菌株。根據(jù)形態(tài)學、致病性測定結(jié)果和分子生物學序列分析結(jié)合田間發(fā)病癥狀,最終鑒定該病原菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。尖孢鐮刀菌是一種土壤習居菌,為一類常見的土傳真菌。此前有關(guān)尖孢鐮刀菌引起植物根腐病害已有不少報道,如周洪友等發(fā)現(xiàn)一株尖孢鐮刀菌黃芪?；?F.oxysporum f.sp.astragali)侵染沙打旺導致其根腐[20];黃芳等在西葫蘆根腐病的病原鑒定中確定尖孢鐮刀菌為病原菌[21]。尖孢鐮刀菌引起南方紅豆杉根腐現(xiàn)象國內(nèi)暫未見詳細報道。

南方紅豆杉根腐病潛伏期長、破壞性大且范圍廣,這給該病的防治帶來了一定困難。傳統(tǒng)的化學防治對病害有一定的防治效果,但一些常用的土壤消毒劑對人、畜和大氣臭氧層的危害很大,目前已基本禁用[22]。當前,生產(chǎn)中推行的治理方法是用微生物菌劑(肥)來防治土傳病害[23-25]。芽胞桿菌是一類抗逆能力強,繁殖速度快,營養(yǎng)要求簡單,易定殖在植物表面的生防細菌,近年來正逐漸成為世界生防菌的研究重點。本研究不僅鑒定了該病病原,且針對尖孢鐮刀菌引起的南方紅豆杉根腐病篩選出3株拮抗效果良好的拮抗芽胞桿菌。經(jīng)鑒定,3株芽胞桿菌分別為蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)和多黏類芽胞桿菌(P. polymyxa),其中多黏類芽胞桿菌拮抗效果最好,拮抗帶達到10 mm,具有進一步開發(fā)利用的潛力,這為該病的防治工作進一步奠定了堅實的基礎。

本研究對南方紅豆杉根腐病首次進行病原鑒定,且篩選出3株對病原菌拮抗作用明顯的芽胞桿菌,為今后防治紅豆杉根腐病提供了一定的理論依據(jù)。但本文只是針對洪雅縣某生產(chǎn)基地的南方紅豆杉根腐病進行了病原分離鑒定和拮抗菌的篩選,其他地區(qū)的發(fā)生情況和病原菌的株系還有待進一步研究;鐮刀菌的寄主范圍十分廣泛,各種寄主分離菌系的致病性和生理性狀不盡相同,我國主要作物上的其他鐮刀菌能否侵染紅豆杉及其致病性的強弱還需進一步探討,這對于人工種植紅豆杉和采取農(nóng)業(yè)措施防治紅豆杉根腐病將具有指導意義。

[1] 呂志鵬.甘肅南部紅豆杉栽培技術(shù)與病蟲害防治[J].北京農(nóng)業(yè),2011(5)：152-153.

[2] 范曉龍,朱建華,周旭,等.南方紅豆杉炭疽病病原鑒定及其生物學特性[J].福建林學院學報,2006,26(2)：117-122.

[3] 李湘萍.紅豆杉屬植物的地理分布與應用前景[J].植物雜志, 1994(4)：20-21.

[4] 李金平.南方紅豆杉生態(tài)特性及栽培技術(shù)[J].中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃,2002,21(2)：61-62.

[5] Sutton B C.The Coelomycetes：fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and stromata[M].Kew：Commonwealth Mycological Institute,1980：525-526.

[6] 張艷秋,劉偉,胡長效.草莓根腐病的發(fā)生規(guī)律與綜合防治[J].植保技術(shù)與推廣,2003(1)：14-16.

[7] 彭好文,黎起秦,林緯.生物防治研究及其應用概況[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學,2004,23(2)：170-174.

[8] 王振軍,劉玉霞,劉新濤,等.用16S r DNA序列分析方法鑒定4個拮抗細菌[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2006(5)：59-61.

[9] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998：112-134.

[10]高同春,葉鐘音,王梅,等.水稻早育秧苗立枯病致病鐮刀菌分離、鑒定及致病性測定[J].中國水稻科學,2001,15(4)：320-322.

[11]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術(shù)出版社,1979.

[12]林劍偉,闕友雄,陳天生,等.一株甘蔗黑穗病菌的分離與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國農(nóng)學通報,2007(5)：293-297.

[13]胡長志,孫曉棠,謝克強,等.白蓮腐敗病病原菌的分離鑒定[J].長江蔬菜,2013(18)：92-94.

[14]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社,1999.

[15]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊：中文版(8版) [M].中國科學院微生物所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組,譯.北京：科學出版社,1984.

[16]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001.

[17]Gordon R E,Haynes W S,Pang C H N.芽孢桿菌屬[M].蔡妙英,劉聿太,譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1983.

[18]王大耜.細菌分類基礎[M].北京：科學出版社,1977：102-152.

[19]杜敏博.梨黑星病拮抗菌FJ1的篩選及拮抗機理研究[D].西安：西北大學,2012.

[20]周洪友,楊合同,唐文華.沙打旺根腐病發(fā)生及病原菌鑒定[J].草地學報,2004,12(4)：285-288,297.

[21]黃芳,王建明,徐玉梅.等.西葫蘆根腐病的病原鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2007,35(12)：28-30.

[22]王樹雪,魏艷敏,尚巧霞,等.三株拮抗細菌的鑒定及抑菌作用研究[J].中國生物防治學報,2013,29(4)：647-654.

[23]胡洪濤,王開梅,李芒.幾種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液防治草莓病害的藥效試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2002(2)：52.

[24]徐淑華,蔣繼志,姚克文.兩株拮抗細菌對草莓根腐病菌的抑制作用[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2005,28(3)：81-83,97.

[25]趙秀娟,徐文橋,張鳳巧.土壤拮抗微生物對幾種草莓病原菌的拮抗作用測試[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2007,9(2)：77-81.

Identification of the pathogen isolated from root rot of Taxus chinensis var.mairer and screening of its antagonistic Bacillus

Qiao Tianmin, Luo Rong, Zhu Tianhui

(College of Forestry,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

In this study,the pathogen isolated from root rot of Taxus chinensis var.mairer was first indentified. Based on morphological characteristics,pathogenicity and r DNA ITS sequence analysis,the results showed that the pathogen of root-rot disease of T.chinensis var.mairer was Fusarium oxysporum.The tablet confrontation training method was adopted to screen the antagonistic Bacillus species from the healthy plant rhizosphere,and three strains with obvious antagonistic effect were obtained,namely YB6,YB15 and YB37.Through morphological,physiological,biochemical and 16S r DNA homology analysis as well as the construction of 16S r DNA phylogenetic tree,we found that YB6,YB15 and YB37 were Bacillus cereus,B.amyloliquefaciens and Paenibacillus polymyxa,respectively.The antagonistic effect of P.polymyxa was the best with further research and development potential. This study provides some valuable information for effective prevention and treatment of this disease.

Taxus chinensis var.mairei; root rot; Fusarium oxysporum; antagonistic Bacillus

S763.1S476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.010

2014-11-17

2014-12-22

四川省教育廳重點項目(12ZA115)

*通信作者 E-mail：zhuth1227@126.com