邱宗波，袁萌萌，張曼曼，張 亮，郭君麗

（河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007）

microRNAs（miRNAs）是一類長度為21～24個核苷酸（nt）的非編碼單鏈RNA 分子，廣泛存在于植物、線蟲和人類等真核生物細(xì)胞中[1－2]，而且在真核生物生長發(fā)育、形態(tài)建成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)等重要生命過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是最主要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子之一[3－4]。miRNA 通過與靶基因mRNA 序列互補結(jié)合來介導(dǎo)mRNA 的降解或抑制mRNA 的翻譯，主要在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。此外，植物miRNA 還具有保守性、時序性和組織特異性[5]，在個體發(fā)育的不同時期或不同組織中有不同的表達(dá)模式。研究miRNAs的表達(dá)常用Northern雜交、microarray、半定量RT－PCR和實時定量PCR（qRT－PCR）等，qRT－PCR 檢測基因表達(dá)靈敏度高、快捷、高效。目前，qRT－PCR 在基因表達(dá)研究中已成為最重要的方法之一。

研究表明，miRNA 在植物對重金屬鎘脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[4，6－8]。Xie等[8]用表達(dá)序列標(biāo)簽及生物信息學(xué)方法預(yù)測甘藍(lán)型油菜（Brassicanapus）中的21個miRNA，并且采用RT－PCR方法發(fā)現(xiàn)miR156、miR171、miR393 和miR396a的轉(zhuǎn)錄受重金屬鎘的抑制，暗示這幾個miRNA 在重金屬鎘脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。利用miRNA 微陣列芯片技術(shù)，F(xiàn)ang等[9]鑒定了經(jīng)鎘處理和未處理的大豆（Glycinemax）株系中miRNA 表達(dá)模式的差異，共鑒定出26個與鎘應(yīng)激相關(guān)的miRNA，其中有9個miRNA 在2 個 株 系 中 均 有 發(fā) 現(xiàn)，有5 個 和12 個miRNA 分別在鎘耐受型和鎘敏感型大豆中特異表達(dá)。這些研究結(jié)果表明，不同植物參與響應(yīng)鎘脅迫應(yīng)答過程的miRNA 存在多樣性。目前miRNAs脅迫表達(dá)的研究主要集中在擬南芥、水稻和毛白楊等模式植物上，對小麥鎘脅迫相關(guān)miRNAs的研究鮮有報道。為此，筆者等在前期已完成的小麥鎘脅迫miRNA 表達(dá)譜高通量測序的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他植物中已報道的與鎘脅迫相關(guān)的miRNAs，選擇9條可能與鎘脅迫相關(guān)的小麥miRNA 進(jìn)行研究，并對其靶基因進(jìn)行預(yù)測及功能分析，以期為進(jìn)一步明確這些miRNAs的表達(dá)調(diào)控機制以及揭示小麥體內(nèi)miRNA 響應(yīng)鎘脅迫的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥（TriticumaestivumL.）品種為鄭麥4號，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 脅迫處理

選取籽粒飽滿、大小均勻的種子用0.1%HgCl2消毒1min后用去離子水沖洗30min，自然干燥，然后置于25℃恒溫箱中浸種36h，播種在鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，80 粒／皿，出芽后培養(yǎng)于（25±1）℃人工氣候室內(nèi)，澆以Hoagland’s 營養(yǎng)液，12h／d光照，相對濕度70%。待幼苗長生長7d（1葉一心）時，開始鎘脅迫處理。設(shè)置營養(yǎng)液中CdCl2濃度為150μmol／L，每天更換1次培養(yǎng)液，試驗設(shè)3次重復(fù)。鎘脅迫處理0h、6h、12h、24h和48h后分別取小麥幼苗葉片和根，立即用液氮處理，－80℃保存。

1.3 總RNA提取

用Concert Plant RNA Reagent（Invitrogen，美國）提取鎘脅迫小麥幼苗的葉片和根為材料的總RNA，總RNA 用Promega 公 司 的RNase－free Dnase I去除污染的DNA。取3μL 總RNA 溶液，用常規(guī)瓊脂糖凝膠電方法檢測其完整性。通過230 nm、260nm 和280nm 波長的光吸收值測定，檢驗所提取RNA 純度和濃度。

1.4 實時定量PCR擴增

1.4.1 實時定量PCR 引物設(shè)計 選擇小麥中9個 保 守 miRNAs （miR167，miR169，miR171，miR319，miR395， miR396， miR397， miR399，miR444）進(jìn)行檢測，包括之前報道過的植物鎘脅迫相關(guān)miRNAs或小麥中高度保守的miRNAs，內(nèi)參基因選用小麥延伸因子1a－亞基 （TEF1）（GenBankaccession No.M90077.1）。引物設(shè)計（表1）中盡可能使所有引物具有相同的Tm 值，以便同一批檢測。對于GC含量較高或較低的miRNAs，可通過增加或減少引物長度使Tm 值相近或一致，引物合成均在北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行。

表1 Real－time PCR中使用的引物Table 1 Primers of Real－time PCR

1.4.2 實時定量PCR 擴增 應(yīng)用Ncode miRNA第一鏈cDNA 合成試劑盒（MIRC－50；Invitrogen）和1μg純化后的總RNA 進(jìn)行cDNA 合成。采用Toyobo’s Thunder bird SYBR qPCR 試劑盒進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為20μL，2μL 1∶10稀釋的cDNA 作為模板，引物濃度為0.3μM。每個樣品均重復(fù)3 次，熒光定量PCR 儀為Rotor－Gene 3000。PCR 循環(huán)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)，PCR 擴增之后，用熱變性循環(huán)測定熔解曲線驗證擴增的特異性。以小麥TEF1為內(nèi)參基因，擴增的結(jié)果用比較Ct方法分析[10]，即采用公式2－ΔΔCt（Ct代表循環(huán)閾值）。miRNA 表達(dá)水平用TEF1 基因的表達(dá)水平進(jìn)行校正，在CK 中的表達(dá)水平設(shè)為1。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測

基于網(wǎng)站程序psRNATarget 進(jìn)行小麥保守miRNA 靶基因的預(yù)測。靶基因數(shù)據(jù)庫為小麥的unigene序列 [DFCI Gene Index（TAGI），version 12，ftp：／／occams.dfci.harvard.edu／pub／bio／tgi／data／Triticum＿aestivum／TAGI.release12.zip]。選擇功能3 和默認(rèn)參數(shù)，進(jìn)行miRNA 靶基因預(yù)測[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理小麥幼苗總RNA提取

試劑盒提取總RNA 后，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。從圖1看出，不同處理樣品的28SrRNA 和18SrRNA 電泳條帶分離清晰，無擴散現(xiàn)象，且28SrRNA 條帶的亮度約為18SrRNA 條帶亮度的2倍。說明，所提取的總RNA 完整性好，沒有明顯降解，能夠用于qRT－PCR 的后續(xù)研究。

2.2 qRT－PCR熔解曲線

圖2給出了部分qRT－PCR 程序分析得到的熔解曲線?？梢钥闯?，10個基因呈現(xiàn)的熔解曲線均為顯著的單一峰，擴增曲線清晰可辨。說明，cDNA 擴增產(chǎn)物非常專一，可用于后續(xù)定量分析實驗。

圖1 不同處理小麥幼苗總RNA的瓊脂糖電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA isolated from wheat in different treatment

圖2 10個基因的Real－time PCR熔解曲線Fig.2 Real－time PCR melting curves of 10genes

2.3 鎘脅迫小麥幼苗葉片中miRNA的相對表達(dá)量

從表2看出，在鎘脅迫6h后，miR169、miR171和miR319表達(dá)上調(diào)，而miR397和miR399的表達(dá)下調(diào)。在鎘脅迫12h 后，miR319 的表達(dá)上調(diào)，而miR397、miR399 和miR444 的表達(dá)下調(diào)。在鎘脅迫24h 后，miR319、miR396 和miR397 的 表 達(dá) 上調(diào)，miR399 的表達(dá)下調(diào)。在鎘脅迫48h后miR319和miR396的表達(dá)上調(diào)，miR397和miR399的表達(dá)下調(diào)。其中，miR319在鎘脅迫處理各時間段的表達(dá)均上調(diào)，而miR399在鎘脅迫處理各時間段的表達(dá)均下調(diào)。說明，在同一鎘脅迫時間下，不同miRNA在小麥幼苗葉片中的表達(dá)量有很大的差異。

2.4 鎘脅迫小麥幼苗根中miRNA的相對表達(dá)量

從表2看出，在鎘脅迫6h 后，miR169、miR396和miR397的表達(dá)上調(diào)，而miR167和miR171的表達(dá)下調(diào)；在鎘脅迫12h后，miR396和miR397的表達(dá)上調(diào)，而miR167的表達(dá)下調(diào)；在鎘脅迫24h后，miR169、miR171、miR319 和miR397 的表達(dá)上調(diào)，miR167和miR444的表達(dá)下調(diào)；在鎘脅迫48h 后，miR169、miR397 和miR399 的表達(dá)上調(diào)，miR167、miR171和miR444 的表達(dá)下調(diào)。其中，miR167 在鎘脅迫處理各時間段的表達(dá)均下調(diào)，而miR397在鎘脅迫處理各時間段的表達(dá)均上調(diào)。說明，在同一鎘脅迫時間下，不同miRNA 在小麥幼苗根中的表達(dá)量有很大的差異。

表2 小麥幼苗葉片和根中鎘脅迫相關(guān)miRNA的相對表達(dá)量Table 2 Relative expression（fold difference）of cadmium stress related microRNA in leaves and roots of wheat seedlings

表3 鎘脅迫相關(guān)miRNA的靶基因Table 3 Targets of cadmium stress related microRNA

2.5 小麥鎘脅迫相關(guān)miRNA靶基因的預(yù)測

植物miRNA 與靶基因的高度互補有利于預(yù)測靶基因。除miR169和miR399沒預(yù)測出相應(yīng)的靶基因外，其他6條小麥miRNAs共預(yù)測出7個潛在的靶基因（表3）。其中，miR167靶基因為生長素應(yīng)答因子，參與生長素信號途徑的調(diào)控；miR171靶基因為超氧化物歧化酶，在清除超氧化物的過程中發(fā)揮重要作用；miR319靶基因為2個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，參與植物逆境脅迫應(yīng)答響應(yīng)[12]；miR395靶基因腺苷5′三磷酸硫酰酶，參與硫的吸收與同化[13]；miR444和miR397的靶基因鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，參與鈣－鈣調(diào)素信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控[14]。

3 結(jié)論與討論

1）本研究利用實時定量PCR 方法，對9 個miRNAs在小麥鎘脅迫不同時間段的表達(dá)模式進(jìn)行分析，初步發(fā)現(xiàn)9個miRNAs參與了小麥鎘脅迫響應(yīng) 的 調(diào) 控。 其 中，miR167、miR171、miR399 和miR444在鎘脅迫后的小麥幼苗的根或葉中表達(dá)呈下調(diào)趨勢，而miR319、miR396和miR397在小麥幼苗根和葉片中的表達(dá)呈上調(diào)趨勢。表明，miRNAs參與了小麥鎘脅迫響應(yīng)的調(diào)控，對鎘脅迫不同時間段的響應(yīng)呈現(xiàn)出動態(tài)變化的過程，且多數(shù)miRNAs的表達(dá)具有組織特異性。

有研究表明，miRNA 參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括激素調(diào)節(jié)、生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及逆境環(huán)境的適應(yīng)能力等[3－4]。在植物中，干旱、鹽堿、重金屬等非生物脅迫能影響基因在植物內(nèi)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控[15]。鎘是毒性最強的重金屬之一，可以使植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧（ROS）從而導(dǎo)致氧化脅迫，或者使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的羧基或硫醇基失活，從而嚴(yán)重影響植物細(xì)胞的生長發(fā)育[16]。miRNA 在植物對重金屬脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，在重金屬脅迫下，植物miRNA 表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)，以響應(yīng)重金屬脅迫[17－18]。Zhou等[19]在豆科的模式生物蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）中，應(yīng)用實時定量PCR 方法發(fā)現(xiàn)了部分miRNA 的表達(dá)可受重金屬鎘的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)，其中，miR171、miR319和miR529 在鎘脅迫下表達(dá)上調(diào)，而miR167、miR399則表達(dá)下調(diào)。

2）植物miRNA 功能的發(fā)揮主要通過下游靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)而實現(xiàn)。miR167的靶基因是生長素響應(yīng)因子ARF6 和ARF8[20]，鎘處理下miR167在小麥幼苗根中的表達(dá)減弱，推測miR167可能通過影響生長素信號途徑而在抵抗鎘脅迫等過程中發(fā)揮重要作用。miR395 通過調(diào)節(jié)ATP 硫酸化酶的表達(dá)而參與硫酸鹽同化和分配[21]。缺硫能夠誘導(dǎo)擬南芥miR395的表達(dá)[22]，本研究也證實鎘脅迫同樣能誘導(dǎo)小麥幼苗葉和根中miR395 的表達(dá)。Sunkar等[23]發(fā)現(xiàn)，擬南芥在高銅、高鎘脅迫下，miR398 表達(dá)降低，其所調(diào)控的Cu／Zn 超氧化物歧化酶表達(dá)上調(diào)，從而提高了擬南芥對重金屬脅迫的耐受性。在小麥中，經(jīng)過鎘脅迫處理后的miR171的表達(dá)在脅迫處理時間段的表達(dá)趨勢整體下調(diào)，而其在小麥中的靶基因是超氧化物歧化酶。當(dāng)小麥遭遇鎘脅迫時，miR171表達(dá)下調(diào)，而其靶基因超氧化物歧化酶的表達(dá)上調(diào)，從而提高了小麥對重金屬脅迫的耐受性。另外在預(yù)測結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)miR319靶基因為2個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，miR444靶基因鈣調(diào)素結(jié)合蛋白和miR397靶基因鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。丁艷菲等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR444d 在鎘脅迫下表達(dá)下降，暗示其靶基因鈣調(diào)素結(jié)合蛋白表達(dá)上升。本研究表明，miR444在鎘脅迫小麥幼苗根中的表達(dá)呈下降趨勢，暗示其靶基因鈣調(diào)素結(jié)合蛋白表達(dá)上升，這一結(jié)果首次通過miRNA 將鈣信號與鎘脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來。miRNA 處于基因表達(dá)調(diào)控的中心位置，在植物對重金屬脅迫的應(yīng)答過程中起著重要調(diào)控作用。

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