張 宇，夏 志，劉 刊，李明偉，田亞婷，袁 玲，楊玉蓮

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州省化學(xué)化工實驗教學(xué)示范中心，貴州 畢節(jié)551700）

毒死蜱屬有機磷農(nóng)藥殺蟲劑，被用于水稻、小麥、蔬菜、水果等多種咀嚼式害蟲的防治，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中應(yīng)用十分廣泛[1－2]。但毒死蜱進入人體會產(chǎn)生很大的傷害[3－5]。因此，毒死蜱一直是食品和農(nóng)業(yè)環(huán)境中農(nóng)藥殘留檢測的重點。傳統(tǒng)的毒死蜱殘留檢測方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]以及其與質(zhì)譜的聯(lián)用[8]等技術(shù)，這些方法具有分析靈敏度高、檢測限低和定性定量準確的優(yōu)點，但所需的儀器設(shè)備大型昂貴、樣品前處理過程繁瑣、檢測時耗久和不能實現(xiàn)在線檢測。且常規(guī)檢測中的提取、凈化、濃縮及檢測等過程中，每一步驟所用的操作方法、硬件設(shè)施、人員技術(shù)熟練程度乃至實驗室的管理水平等都對測定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，從而限制了其應(yīng)用前景，不能快速有效地在野外進行實時檢測。

生物傳感器技術(shù)作為近年來檢測農(nóng)藥殘留的新方法，相比傳統(tǒng)的檢測方法具有更好的準確性和特異性，有選擇性好、響應(yīng)快、操作簡便、價格便宜、樣品處理要求較低、可微型化、便于利用計算機收集和處理數(shù)據(jù)以及不會或很少損傷樣品或造成污染等特點。

生物傳感器的響應(yīng)性能很大程度依賴于傳感器的構(gòu)建，只有設(shè)計構(gòu)造出性能優(yōu)異的傳感器才有實際應(yīng)用的價值和意義。碳納米材料具有化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、導(dǎo)電性和生物相容性優(yōu)異等優(yōu)點，能夠為電化學(xué)反應(yīng)提供充足的活性位點[9－10]，石墨烯（GO）因其表面豐富的親水基團和其特殊的結(jié)構(gòu)，可以作為分散劑分散碳納米管（CNTs）制備出水溶性和分散性較好的碳納米管－石墨烯（CNTs－GO）納米復(fù)合物。并將其作為載體構(gòu)建以乙酰膽堿酯酶（AChE）為催化活性中心的有機磷農(nóng)藥殘留檢測傳感器，促進有機磷農(nóng)藥殘留檢測實現(xiàn)簡單、實時、在線和快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

乙酰膽堿酯酶（AChE，TypeC3389－500UN，425.94units／mg，Sigma－Aldrich 公 司），氯 化 乙 酰膽堿（阿拉丁試劑），毒死蜱標品（湖北仙隆化工股份有限公司），碳納米管（CNTs），石墨烯（GO）（南京先鋒納米科技股份有限公司），氯化鉀、磷酸和氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），Al2O3粉末（上海辰華試劑廠）；試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），掃描電鏡（S－4800，Hitachi，日本），精密型酸度計（上海雷磁儀器廠），5L、10L、25L、50L 微量進樣器（寧波市鎮(zhèn)海玻璃廠）。

1.2 納米復(fù)合材料的制備

將1∶1的CNTs和GO 水溶液置于超聲波中，利用超聲波的震蕩作用，使兩種物質(zhì)分散并融合，最后得到混合均勻的CNTs－GO 納米復(fù)合物。

1.3 電極的前處理及傳感器的制備

電極修飾前，在麂皮上用粒徑0.05m 的Al2O3粉懸濁液將玻碳電極（GCE）拋光成鏡面，再用二次水清洗干凈，分別在乙醇和二次水中超聲清洗5min，室溫下自然晾干。然后先將CNTs－GO 的納米復(fù)合物滴涂在電極表面，再將AChE 固定在納米復(fù)合材料表面，在冰箱內(nèi)靜置24h，讓其晾干，即制得AChE／CNTs－GO／GCE。同法制備CNTs／GCE和GO／GCE。

1.4 測定方法

試驗均采用三電極系統(tǒng)：修飾的GCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極（Pt）為對電極，所有試驗均在室溫下進行。具體的電極構(gòu)造及實驗原理見圖1。

圖1 三電極系統(tǒng)電極構(gòu)造及原理Fig.1 The schematic diagram of the electrode structure and principle

1.4.1 底物最適濃度的測定 改變底物濃度對酶納米復(fù)合結(jié)構(gòu)生物傳感器的反應(yīng)速率有很大影響。試驗采用循環(huán)伏安法考察傳感器在反應(yīng)體系中對底物氯化乙酰膽堿濃度的選擇，在反應(yīng)體系中，逐漸增加氯化乙酰膽堿的量，然后再逐一進行循環(huán)伏安掃描。

1.4.2 pH及孵育時間的優(yōu)化 酶的活性受pH值影響較大，過酸或過堿都會影響AChE 酶蛋白的構(gòu)象。同時pH 還會影響氯化乙酰膽堿與AChE的解離狀態(tài)、酶與底物形成的中間產(chǎn)物解離速度以及酶活性。因此，采用計時電流法考察傳感器在反應(yīng)體系中pH 值的最優(yōu)值。分別配制0.1mol／L、pH 4.0～8.5的PBS，測定底物氯化乙酰膽堿的響應(yīng)電流。

毒死蜱與AChE 作用使酶失活需要一定的時間才能達到平衡，這段時間被稱為抑制時間。只有當酶被一定濃度毒死蜱抑制完全后才能對毒死蜱的抑制作用進行檢測，進而確定其濃度。對抑制時間進行選擇，采用循環(huán)伏安法考察傳感器在1.43 μmol／L毒死蜱中抑制不同時間的響應(yīng)。

1.4.3 傳感器對毒死蜱的電化學(xué)響應(yīng) 分別向反應(yīng)體系中加入事先配置好的毒死蜱標準液，抑制合適時間后，加入底物，反應(yīng)徹底后利用循環(huán)伏安法測定修飾電極對農(nóng)藥毒死蜱的響應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CNTs和CNTs－GO的微型形貌

從圖2－a中可見，單純的CNTs管徑分布均勻，相互纏繞在一起，呈明顯的卷曲狀，有團簇現(xiàn)象。而加入GO 后，表面存在彎曲褶皺，呈現(xiàn)石墨烯的固有特征，CNTs從GO片層中穿過，又由于GO 與CNTs有較強的π－π鍵作用，由此形成一種3D 立體的疏松多孔夾層結(jié)構(gòu)（圖2b），這種結(jié)構(gòu)能使電極的比表面積大幅提升，能為電化學(xué)反應(yīng)提供充足的活性位點和反應(yīng)場所，促進電子傳遞，從而提高整個納米復(fù)合材料修飾電極的催化性能。

圖2 碳納米管（a）和碳納米管／石墨烯（b）的微型形貌Fig.2 SEM morphology of CNTs（a）and CNTs－GO（b）

2.2 電化學(xué)表征

從不同材料修飾的玻碳電極在0.1mol／L、pH 7.5的磷酸緩沖液（PBS）中的循環(huán)伏安曲線（圖3）看出，裸玻碳電極（a曲線）的氧化電流強度很小，且無明顯的出峰；b曲線氧化電流強度有了明顯增大，且在－0.1V 左右有一對明顯的氧化還原峰，為碳納米管的特征峰[11－12]；雖然GO 由于具有豐富的親水基團水溶性較好，但c曲線導(dǎo)電性能無還原石墨烯強，電流強度較b曲線有所下降；d曲線電流強度比c、b曲線強，這是因為GO 的加入大幅度提升了電極的比表面積，降低了CNTs的團聚，顯著提高了電極的電化學(xué)性能。

圖3 不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammetry curve of different modified electrodes

2.3 反應(yīng)體系底物的最適濃度

從圖4看出，0.6V 左右峰電流值有明顯變化，且峰電流值隨濃度的增大而降低。底物濃度在0.5～8.5μmol／L 時，氧化峰電流值隨濃度的增大而降低，但濃度大于8.5μmol／L 時電流反常，而且變化值很小。為避免底物濃度過小導(dǎo)致電極響應(yīng)不明顯，又不致使底物濃度過大而導(dǎo)致酶的活性中心被底物全部占據(jù)從而對抑制劑不敏感，引起檢測下限升高，選擇最適濃度為8.5μmol／L。

2.4 pH及孵育時間的優(yōu)化

由圖5（A）可知，當pH 值在5.0～7.5時，響應(yīng)電流逐漸增大，pH＝7.5時響應(yīng)電流最大，pH 大于7.5時，響應(yīng)電流反而減小。因此，選擇0.1mol／L pH 7.5的PBS為測試底液。

由圖5（B）可知：在1～5min，隨著孵育時間的增加，峰電流不斷下降；5 min后，隨著孵育時間的增加，峰電流的變化平緩，說明峰電流進入平臺期，直至試驗結(jié)束，電流值變化不大，說明毒死蜱與AChE作用使酶失活已經(jīng)達到平衡，可以對酶的抑制效果進行檢測。所以，確定毒死蜱對AChE 的最佳孵育時間為5min。

圖4 修飾電極對氯化乙酰膽堿的循環(huán)伏安響應(yīng)（A）和氯化乙酰膽堿的濃度與峰電流之間的關(guān)系（B）Fig.4 Cyclic voltammetry response diagram of the modified electrode to acetylcholine chloride（A）and The relation between different acetylcholine chloride concentration and peak current（B）

圖5 pH 值（A）和抑制時間（B）的修飾電流Fig.5 Effect of pH （A）and restricted time（B）on modified electrode

2.5 傳感器對毒死蜱的電化學(xué)響應(yīng)

隨著毒死蜱的加入，AChE的催化活性被抑制，導(dǎo)致電流下降（圖6A），且電流下降的程度與溶液中的抑制劑毒死蜱的濃度成正比。由電流的抑制率公式[13]：抑制率I%＝（I0－In）／I0（I%為電流抑制率，I0和In分別為抑制前后的峰電流值）處理數(shù)據(jù)得到（圖6B），根據(jù)抑制率和濃度構(gòu)建酶傳感器檢測毒死蜱的抑制率曲線，農(nóng)藥抑制率與濃度在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。在0.71～5.70μmol／L 的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為I%＝2.375 8c＋16.918，相關(guān)系數(shù)R2＝0.809 8；在5.70～71.13μmol／L 的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為I%＝0.055 3c＋28.682，相關(guān)系數(shù)R2＝0.964 9。檢出限達0.23μmol／L，說明，該傳感器檢測毒死蜱時具有較高的靈敏度，可利用毒死蜱對膽堿酯酶的抑制作用檢測毒死蜱的濃度。

2.6 實際樣品的測試

采用傳感器對畢節(jié)流倉河水進行檢測結(jié)果（表）表明，回收率在96%～102%，說明該傳感器可用于實際樣品的檢測。

圖6 修飾電極對不同濃度毒死蜱（0.71，1.43，2.90，4.27，5.70，14.26，42.68，71.13mmol／L）的循環(huán)伏安響應(yīng)（A）及相對應(yīng)的抑制曲線（B）Fig.6 Cyclic voltammetry response diagram of modified electrode to Chlorpyrifo with different concentration including 0.71；1.43；2.90；4.27；5.70；14.26；42.68and 71.13mol／L（A）and corresponding inhibition curves（B）

表 水樣中有機磷農(nóng)藥的檢測（n＝5）Table Detection of Organic phosphorus pesticide in water samples（n＝5）

3 小結(jié)與討論

電化學(xué)傳感器檢測有機磷農(nóng)藥開辟了電化學(xué)與分子生物學(xué)的新領(lǐng)域，為生命科學(xué)的研究提供一種全新的方法。生物傳感器因其快速、高效、簡便等特點，在檢測有機磷農(nóng)藥方面有著傳統(tǒng)方法不可代替的優(yōu)勢。將GO－CNTs納米復(fù)合物作為載體構(gòu)建以AChE為催化活性中心的農(nóng)藥殘留檢測傳感器能更準確地對毒死蜱進行檢測，在最優(yōu)條件下，在0.71～71.13μmol／L具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限達到0.23μmol／L，大大提高了傳感器的靈敏度，能對毒死蜱進行快速靈敏的檢測、前處理簡單、檢測時間短、所需儀器設(shè)備簡單、可及時對市場上含殘留有農(nóng)藥的蔬菜進行檢測，將一部分農(nóng)藥殘留量超標的蔬菜控制在交易市場之外，盡量減少對人們的傷害。其次，這種方法的檢測費用低，可以被廣泛利用，在目前情況下，酶抑制法是蔬菜市場快速測定蔬菜中毒死蜱農(nóng)藥殘留的一種有效可行的方法。

由于酶傳感器技術(shù)還處在不斷發(fā)展和完善的過程中，因此，存在一定的不足，還有很多問題有待解決。如保持固定化酶的活性、高度專一性、提高傳感器的穩(wěn)定性和使用壽命等問題還有待解決。但隨著技術(shù)的不斷成熟，AChE 傳感器將會成為檢測毒死蜱殘留最簡便、有效的方法。

[1]汪家銘.毒死蜱市場競爭優(yōu)勢及發(fā)展建議[J].科學(xué)發(fā)展，2010（1）：43－47.

[2]楊 靜，曹海峰，徐 晶，等.毒死蜱在蔬菜上的應(yīng)用[J].吉林蔬菜，2014（3）：33－34.

[3]鄭 璐，盧振蘭.殺蟲劑毒死蜱的研究進展[J].輕工科技，2013，3（170）：77－79.

[4]唐鵬春.蔬菜農(nóng)藥殘留超標的危害及預(yù)防[J].新農(nóng)村，2014（6）：135.

[5]李亞楠，劉晶晶，陳少華，等.毒死蜱的應(yīng)用現(xiàn)狀及降解研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（6）：92－96.

[6]王 雪，徐 燕，丁永沖.氣相色譜法分析蔬菜中的農(nóng)藥殘留[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2013，6（3）：139－141.

[7]蘭珊珊，劉宏程，黎其萬，等.高效液相色譜法同時測定蔬菜和水果中8 種農(nóng)藥殘留[J].分析科學(xué)學(xué)報，2011，27（2）：171－174.

[8]曹殿潔，黃信龍.氣相色譜—質(zhì)譜法聯(lián)用快速檢測果蔬中常見農(nóng)藥殘留[J].食品工業(yè)科技，2013，34（3）：299－301.

[9]孫 霞，趙文蘋，劉中合，等.基于功能化多壁碳納米管的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備[J].食品科學(xué)，2012，33（4）：282－286.

[10]范軍領(lǐng)，石墨烯傳感器的研究進展[J].材料導(dǎo)報，2012，26（4）：31－35.

[11]陳 婷，田亮亮，張 進.基于石墨烯電化學(xué)傳感器的研究進展[J].材料導(dǎo)報，2014，28（2）：17－22.

[12]周 華，王輝憲，劉登友，等.基于碳納米管修飾的酶生物傳感器檢測有機磷農(nóng)藥[J].傳感器世界，2008，23（5）：23－27.

[13]薛 瑞，康天放，魯理平.層層自組裝納米金與乙酰膽堿酯酶電化學(xué)生物傳感器檢測有機磷農(nóng)藥[J].分析測試學(xué)報，2012，31（8）：940－944.

[14]余林海.有機磷農(nóng)藥酶傳感器的研究進展[J].檢驗檢疫科學(xué)，2007（17）：90－92.