楊 琴， 柴志欣， 姬秋梅， 張成福， 信金偉， 宋喬喬， 鐘金城

(1.西南民族大學(xué)，四川 成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850000)

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西藏牦牛mtDNAATP8全序列測(cè)定及遺傳多樣性分析

楊 琴1， 柴志欣1， 姬秋梅2， 張成福2， 信金偉2， 宋喬喬1， 鐘金城1

(1.西南民族大學(xué)，四川 成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850000)

對(duì)西藏16 個(gè)牦牛類群共367 頭個(gè)體的mtDNAATP8(Adenosine Triphosphate 8)基因進(jìn)行克隆及序列分析。結(jié)果表明，西藏牦牛mtDNAATP8基因全長(zhǎng)201～203 bp，T、C、A和G 4種核苷酸的平均比例分別為29.3%、23.0%、41.8%和6.0%，A+T含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出一定的堿基偏倚性；在367 頭牦牛中，共檢測(cè)到19 個(gè)變異位點(diǎn)，其中單一信息位點(diǎn)15 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4 個(gè)，存在轉(zhuǎn)換和插入2 種變異類型，堿基替換中存在轉(zhuǎn)換73 次，以A/G、T/C為主，占98.63%；在插入變異類型中以A堿基插入為主；367 頭牦牛共撿出20 種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.332和0.001 89，說(shuō)明西藏牦牛具有較貧乏的遺傳多樣性；聚類分析顯示，西藏牦?？煞譃? 類，其中桑日牦牛、類烏齊牦牛和桑日牦牛為1 類，其余牦牛類群為另1 類。20 種單倍型可以分為2 個(gè)聚類簇(I和Ⅱ)，其中聚類簇I包含17 種單倍型，占全部單倍型數(shù)的77.27%，包含了本次研究中的所有西藏牦牛類群；聚類簇Ⅱ中有3 種單倍型，囊括了除錯(cuò)那、嘉黎、康布和帕里類群外的12 個(gè)類群，顯示西藏牦牛存在2 個(gè)母系起源。

西藏牦牛；線粒體DNA；58基因；遺傳多樣性

擁有“高原之舟”美稱的牦牛(Bosgrunniens)是分布于海拔3 000 m的青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的珍稀牛種，在長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇作用下，不管是其形態(tài)結(jié)構(gòu)還是生理功能都能很好地適應(yīng)高寒、低氧以及強(qiáng)紫外輻射的環(huán)境。全世界現(xiàn)有牦牛1 420余萬(wàn)頭，其中中國(guó)有1 330多萬(wàn)頭，占牦牛總量的93.67%；西藏作為牦牛的主產(chǎn)區(qū)之一，現(xiàn)有牦牛492.3 萬(wàn)頭，占中國(guó)牦?？倲?shù)的37%，位居全國(guó)第2[1，2]。牦牛能夠?yàn)槟撩裉峁┤?、奶等生產(chǎn)、生活必需品，是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)中不可缺少的畜種，在遺傳上是一個(gè)極為寶貴的基因庫(kù)。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生態(tài)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)。動(dòng)物線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)因具有母系遺傳、多態(tài)性豐富、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，被認(rèn)為是研究物種起源、演化和分類最好的分子遺傳標(biāo)記[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者張成福、趙上娟、姬秋梅和姜雪鷗等[4-7]通過(guò)測(cè)定西藏11個(gè)牦牛類群的D-loop區(qū)、COⅢ、Cytb、12SrRNA基因的核苷酸序列對(duì)西藏牦牛的遺傳多樣性、類群間的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了研究。但利用ATP8基因?qū)ξ鞑仃笈５倪z傳多樣性及其類群間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究尚屬空白。哺乳動(dòng)物編碼ATP合成酶F0亞基部分結(jié)構(gòu)的ATP8基因位于線粒體基因組上，是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈基因的重要成員之一[8,9]。本研究以西藏16個(gè)牦牛類群為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定mtDNAATP8全基因序列，探討牦牛遺傳多樣性及其類群間的親緣關(guān)系，以期為進(jìn)一步的保護(hù)牦牛遺傳資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從16 個(gè)西藏牦牛類群中，選取健康成年的牦牛367頭(表1)，采集其耳組織，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇保存帶回實(shí)驗(yàn)室，存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2 基因組DNA的提取及檢測(cè)

運(yùn)用動(dòng)物組織基因組提取試劑盒(TianGen生物技術(shù)公司)提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與序列擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中公布的牦牛ATPase8基因的核苷酸序列(GenBank:AY684273.2)，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物序列為：F：GTTAGAGATTGAGAGCAGTATGCT；R：AAACCACATGGCTAAGCCGG，由英濰捷基(上海)生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL；其中，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2×long Taq DNA預(yù)混酶12.50 μL(0.625 U)，無(wú)菌ddH2O 9.50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

1.4 目的基因克隆測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段大小，然后用DNA膠回收試劑盒(TianGen)進(jìn)行分離純化，再連接到pMDTM19-T載體(TaKaRa公司)上，并轉(zhuǎn)化到高效感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，LB平板培養(yǎng)基(含有2%X-Gal，1%IPTG和1%Amp)上37 ℃培養(yǎng)12～16 h，篩選陽(yáng)性克隆在700 μL LB液體培養(yǎng)基(含1%Amp)中37 ℃振蕩培養(yǎng)6～7 h。重組子經(jīng)菌液PCR鑒定后，用ABI3730XL型DNA測(cè)序儀進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用DNAMAN 5.2.2軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行拼接，比對(duì)并進(jìn)行人工校對(duì)；用MEGA5.05軟件統(tǒng)計(jì)序列的長(zhǎng)度、堿基組成、氨基酸組成，以及計(jì)算類群間的Kimura雙參數(shù)距離并以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ) 構(gòu)建品種間聚類關(guān)系；用DnaSP5.10軟件進(jìn)行變異位點(diǎn)、核苷酸多樣性以及單倍型多樣性分析；用Network4.6.1.1(http://www. fluxus-engineering.com/sharenet.htm)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏牦牛mtDNAATP8基因的核苷酸和氨基酸組成

表1 供試牦牛類群、數(shù)量及采樣地點(diǎn)

經(jīng)測(cè)序得到西藏16 個(gè)牦牛類群367 個(gè)個(gè)體的ATP8基因全序列，基因全長(zhǎng)201～203 bp，起始密碼子為AUG(ATG)，終止密碼子為UAA(TAA)，編碼66個(gè)氨基酸。T，C，A和G 4種核苷酸的平均比例分別為29.3%、23.0%、41.8%和6.0%；A+T 含量71.1%，G+C 含量29.0%，表明西藏牦牛ATP8基因具有明顯的堿基偏倚性，這與線粒體蛋白編碼基因的典型特征相符。根據(jù)脊椎動(dòng)物線粒體中密碼子編碼規(guī)律[10]，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：ATP8基因所編碼各氨基酸平均含量差異較大，不含半胱氨酸(Cys)、精氨酸(Arg)和纈氨酸(Val)，而亮氨酸和絲氨酸的平均含量較高，分別為15.64%和11.31%。

2.2 西藏牦牛ATP8基因的遺傳多樣性

在367 頭牦牛中，全序列共有19 個(gè)可變位點(diǎn)，其中單一信息位點(diǎn)(Singleton variable sites)15 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony informative sites)4 個(gè)。所測(cè)序列與下載的參考序列(GenBank：AY684273.2)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)換和插入2 種變異類型，其中轉(zhuǎn)換74 次，以A->G，T->C為主，占98.64%；存在4 個(gè)插入位點(diǎn)(SS5：2223；DQ38：3031；DQ46，SS5：7576；BQ1，JD2：196197)。西藏牦牛ATP8基因核苷酸多樣性為0.001 91(表2)。在16 個(gè)西藏牦牛類群中，桑桑和斯布牦牛的核苷酸多樣性較高，分別為0.004 33和0.003 00。而康布、帕里和嘉黎牦牛的核苷酸多樣性最低均為0.0000。對(duì)所有突變點(diǎn)進(jìn)行Tajima’s中性檢驗(yàn)，Tajima’s D值為-2.195 93，P<0.01，差異顯著，進(jìn)化方式不平衡，為負(fù)向選擇，說(shuō)明西藏牦?？赡艹霈F(xiàn)了群體擴(kuò)張模式。

表2 西藏牦牛ATP8基因單倍型多樣性和核苷酸多樣性

根據(jù)西藏牦牛ATP8全序列19 個(gè)變異位點(diǎn)，從367 條序列中共撿出20 種單倍型(表3)，其中單倍型1和單倍型2所占比例最多，分別達(dá)73%和13%以上。西藏牦?？傮w的單倍型多樣性為0.332(表2)，各類群的平均單倍型多樣性值在0.000～0.711，其中桑桑牦牛的單倍型多樣性最高。在西藏牦牛ATP8單倍型序列變異位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用NetWork4.6.1.1構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)。結(jié)果顯示，20 種單倍型被分為2 個(gè)聚類簇(I和II)，其中聚類簇I包含17 種單倍型，占全部單倍型的90%，包含了本研究中的所有西藏牦牛類群；聚類簇II中有3種單倍型，囊括了除錯(cuò)那、嘉黎、康布和帕里類群外的12 個(gè)類群。

2.3 西藏牦牛ATP8基因單倍型序列同源性比較分析

運(yùn)用DNAMAN5.2.2軟件對(duì)西藏牦牛ATP8基因20 種單倍型序列進(jìn)行同源性比較，其結(jié)果如表4所示。同源性范圍值98.48%～99.50%，單倍型Hap-1序列與其他單倍型序列相比，其與單倍型Hap-2和單倍型Hap-11、Hap-13的同源性要明顯低于其他序列；而單倍型Hap-2序列與Hap-1和Hap-11、Hap-13的同源性明顯高于其他序列，這說(shuō)明單倍型Hap-11、Hap-13是在單倍型Hap-2的基礎(chǔ)上演變來(lái)的，而Hap-2又起源于單倍型Hap-1。

2.4 西藏牦牛類群間的遺傳距離及聚類分析

運(yùn)用Mega軟件對(duì)西藏16 個(gè)牦牛類群的分子遺傳距離進(jìn)行計(jì)算(表5)，表明西藏16 個(gè)牦牛類群間的遺傳距離變異范圍在0.0000～0.0034，其中康布(KB)、嘉黎(JL)和帕里(PL)之間任意2 個(gè)的遺傳距離均為0.0000，桑日(SR)、類烏齊(LWQ)和桑桑(SS)牦牛與其他類群間的平均遺傳距離較其他類群間的距離大，其中桑日牦牛與其他類群間的遺傳距離最遠(yuǎn)，可作為選育的優(yōu)先考慮對(duì)象。根據(jù)ATP6基因的遺傳距離，用鄰接法(NJ)對(duì)西藏牦牛16 個(gè)類群進(jìn)行聚類分析(圖2)，結(jié)果顯示桑日、類烏齊和桑桑牦牛為一類，其他牦牛類群則為另一類。

表3 西藏牦牛16個(gè)類群ATP8基因的單倍型分布

注：每個(gè)圓圈代表一種單倍型，其大小與該種單倍型出現(xiàn)的頻率成正比。

Note： Each circle represents one kind of haploid type, its size and the frequency is proportional to the haploid form.

圖1 西藏牦牛mtDNAATP8基因20種單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

Fig.1 Networt relationship chart of 22 haplotypes of mtDNAATP8 in Tibetan yak

表4 西藏牦牛ATP8基因20種單倍型序列的同源性比較

表5 西藏牦牛16個(gè)類群間的雙參數(shù)遺傳距離

注：表中數(shù)據(jù)均要乘以10-3。

Note： Data in the table have to be multiplied by 10-3.

圖2 基于Kimura 雙參數(shù)距離的西藏牦牛類群間的NJ 聚類關(guān)系

3 結(jié)論與討論

3.1 西藏牦牛ATP8基因單倍型及核苷酸多樣性分析

由單倍型分析可知，不僅73%的個(gè)體屬于單倍型Hap-1，而且每個(gè)群體中都含有單倍型Hap-1，由此推斷單倍型Hap-1應(yīng)是西藏牦牛類群的主要單倍型，其他單倍型是在此基礎(chǔ)上演變而來(lái)，這與圖1所表示的結(jié)果一致。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性常作為衡量群體DNA水平上遺傳多樣性的重要指標(biāo)，其值越小，群體的多態(tài)程度就越低，遺傳多樣性就越貧乏。動(dòng)物的遺傳多樣性是動(dòng)物持續(xù)進(jìn)化和適應(yīng)外界環(huán)境變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，群體的遺傳多樣性越豐富，則其適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)；反之，不穩(wěn)定的外界環(huán)境將成為群體滅絕的最大威脅，因此，對(duì)西藏牦牛類群之間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳多樣性分析，不僅有利于保持各品種的優(yōu)勢(shì)基因，還對(duì)牦牛資源的開發(fā)和管理有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)平均核苷酸的多樣性分析發(fā)現(xiàn)，桑桑牦牛在16 個(gè)類群中相對(duì)較高，其單倍型多樣性達(dá)到0.711，說(shuō)明類烏齊牦牛的遺傳多樣性較其他類群豐富；而帕里牦牛、康布牦牛和嘉黎牦牛無(wú)論是核苷酸多樣性還是單倍型多樣性都為零，說(shuō)明以上3 種牦牛類群是很純的類群。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，西藏16 個(gè)牦牛類群的總體單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為0.332和0.001 89，位于被認(rèn)為線粒體多態(tài)低范圍(0.15%～0.47%)[11]。由此可見，西藏牦?？傤惾壕€粒體遺傳多樣性較為貧乏。這一結(jié)果較張成福等[4,12,13]對(duì)D-loop區(qū)，姬秋梅等[5]對(duì)cytb基因，及趙上娟等[6]對(duì)COIII基因和姜雪歐等[7]對(duì)12SrRNA的研究結(jié)果均要低；其核苷酸多樣性與D-loop區(qū)和12SrRNA相比較低，卻稍高于COIII和cytb，這表明，西藏牦牛具有較貧乏的遺傳多樣性。

3.2 西藏牦牛類群的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

近年來(lái)，西藏牦牛的遺傳多樣性、系統(tǒng)分化以及品種的分類一直是研究的熱點(diǎn)。趙上娟等[6]研究認(rèn)為，西藏11 個(gè)牦牛類群(111頭)可分為三大類，即帕里牦牛系、巴青牦牛系、斯布牦牛系；姬秋梅等[5]認(rèn)為西藏11 個(gè)牦牛類群(110頭)可以分為五大類，既帕里牦牛系，江達(dá)牦牛系，巴青牦牛系，桑日牦牛系和類烏齊牦牛系。本研究結(jié)果表明，西藏牦?？梢苑譃閮纱箢?，桑日牦、類烏齊牦牛和桑桑牦牛為1 類，其余13 個(gè)牦牛類群為另一類。這與文獻(xiàn)[5]和[6]的研究結(jié)果有很大的不同，究其原因可能是：1)本研究所涉及的樣本類群多，總體數(shù)量大，對(duì)于遺傳多樣性的研究更具有可靠性；2)試驗(yàn)研究的目的基因不同。這一結(jié)果與陳智華等[14]根據(jù)西藏牦牛染色體及血液蛋白多態(tài)性將西藏牦牛劃分為藏東南山地牦牛與藏西北草地牦牛的結(jié)果基本一致；結(jié)合本次試驗(yàn)，牦牛類群樣品的地理分布與類群間的聚類關(guān)系圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，分布在藏北的嘉黎牦牛與分布在藏南的康布、帕里牦牛為1類，而藏東北的類烏齊牦牛和藏西的桑桑牦牛為1類，說(shuō)明了人類的干預(yù)將會(huì)提升品種間的基因交流概率，從而逐漸降低牦牛遺產(chǎn)分化受地理隔離的影響程度。

西藏牦牛的20種單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖分為Ⅰ和Ⅱ2個(gè)聚類簇，其中聚類簇Ⅰ包含有17 種單倍型，囊括了本研究的所有牦牛類群；聚類簇Ⅱ中有3種單倍型，囊括了除錯(cuò)那、嘉黎、康布和帕里類群外的12個(gè)類群，這說(shuō)明了西藏牦?？赡芫哂? 個(gè)母系起源，這與張成福等[4]的研究結(jié)果相一致。

從西藏牦牛ATP8基因的單倍型多樣性和核苷酸多樣性來(lái)看，其具有較貧乏的遺傳多樣性；聚類分析表明，西藏牦牛16個(gè)類群可以分為兩大類，既桑日牦牛、類烏齊牦牛和桑桑牦牛為1類，其余12個(gè)類群為另1類；單倍型分析表明，西藏牦牛具有2個(gè)母系起源。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

Sequence analysis and genetic diversity of mtDNAATP8 of Tibet yaks

YANG Qin1, CHAI Zhixin1, JI Qiumei2, ZHANG Chengfu2, XIN Jinwei2,SONG Qiaoqiao1, ZHONG Jincheng1

(1.Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041,China; 2.Institute of Animal Science and Veterinary, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850000,China)

In order to investigate the genetic diversity and clustering relationships of Tibet yak, the mitochondrialATP8 (Adenosine Triphosphate 8) gene from 367 yaks in 16 populations were sequenced and analyzed. The results showed that the length of yak groups’ATP8 complete sequences were 201 bp～203 bp, and the average nucleotide composition of all sequences was 29.3%T, 23.0%C, 41.8%A and 6.0%G, and the average nucleotide content of A+T (71.1%) was obviously higher than that of G+C (28.9%). There were 19 polymorphic sites within sequences. Among these polymorphic sites, 15 were singleton variable sites and 4 were parsimony-informative sites. Conversion and insertions were detected in nucleotide sequences. A total of 20 haplotypes from 70 polymorphic sites were identified, and the nucleotide diversities and the haplotypes diversities were 0.00189 and 0.332, indicating a relatively poor genetic diversity in Tibetan yaks. The NJ phylogenetic tree revealed that the Tibet yak could be divided into two types. Network relationship chart of 20 haplotypes presented two clusters, indicating that Tibet yaks may be derived from two separate maternal lineages.

Tibet yak; mitochondrial DNA;ATP8 gene; genetic diversity

2014-06-17

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD03B02)、西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(2013XWDS071007)

楊 琴(1987-)，女，四川遂寧人，碩士研究生，主要從事基因組與生物信息學(xué)方面的研究。

鐘金城(1963-)，男，四川成都人，教授，博士。

1000-2340(2015)03-0368-06

S 513

A