周翼虎,霍秀文,劉向宇,邰麗華,苗慧琴,張靈超

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010019; 2.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022)

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河南鐵棍山藥的染色體數(shù)目及核型分析

周翼虎1,霍秀文1,劉向宇1,邰麗華2,苗慧琴1,張靈超1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010019; 2.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022)

以根尖為材料采用酶解去壁低滲法，對河南鐵棍山藥(DioscoreaoppositaThunb.)染色體進(jìn)行制片、計數(shù)，并進(jìn)行了核型分析。結(jié)果表明，河南鐵棍山藥的染色體數(shù)目為120；核型公式為2n=120=96 m(6 SAT)+18 sm(4 SAT)+4 st+2 T，染色體相對長度組成為16 L+26M2+60M1+18 S。染色體的絕對長度范圍0.688～2.628 μm，為微小型染色體或小型染色體。相對長度范圍為0.869%～3.319%。核型不對稱系數(shù)為58.13%。最長染色體長度是最短染色體長度的3.819倍，臂比大于2∶1的比例為11.67%，核型類別屬于2B型，系統(tǒng)演化上屬于較原始的植物。

山藥；染色體數(shù)目；核型分析

山藥為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)薯蕷(D.oppositaThunb.)的俗稱，主要分布于中國，周邊國家也有少量分布，英文俗名為Chinese yam；纏繞性藤本植物，雌雄異株；其塊莖既是一種營養(yǎng)豐富的蔬菜，又是滋補的上等藥材。在中國種質(zhì)資源豐富，從東北到廣西均有分布，北方溫帶地區(qū)普遍栽培。在眾多地方栽培品種中，河南懷山藥的藥用價值最高，藥典中言其“補中益氣，溫養(yǎng)肌肉”“益腎氣，健脾胃”[1-3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)報道其含有“抗氧化、抗衰老、抗腫瘤”“降血糖、降血脂”的成分[2,3]，以古懷慶府一帶(今河南省焦作市沁河兩岸)所產(chǎn)的懷山藥為道地藥材，在懷山藥中又以鐵棍山藥品質(zhì)最好。河南鐵棍山藥是山藥中的精品，是受國家保護(hù)的地理標(biāo)志產(chǎn)品[4]，是重要的種質(zhì)資源。染色體是遺傳物質(zhì)的載體，植物染色體數(shù)目和核型是植物相對穩(wěn)定的物種特征，對研究植物演化、資源評價、遠(yuǎn)緣雜交、育種工作都具有重要意義[5]。國內(nèi)外對薯蕷屬植物的栽培、成分分析、離體培養(yǎng)等方面已有了廣泛的研究。近年來，隨著對該屬植物的深入研究，染色體倍性方面及分子遺傳學(xué)方面的研究也漸熱。但關(guān)于山藥(D.oppositaThunb.)染色體方面的報道較少，尤其是對河南鐵棍山藥這一品種的染色體研究未見報道。為此，本研究對河南鐵棍山藥染色體進(jìn)行了染色體數(shù)目及核型分析，旨在為薯蕷屬植物品種親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)創(chuàng)新及利用、新品種培育等提供細(xì)胞學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的2份山藥材料分別為2012年引種的河南鐵棍山藥塊莖(HNTGH 39)和2013年引種的河南鐵棍山藥零余子(LYZ 60)，皆引自于河南溫縣，種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)山藥種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 染色體標(biāo)本制備 在山藥生長旺盛時期，澆水后次日上午9:00—10:00取不同個體的幼嫩白色根尖。用自來水沖洗，剪取根尖材料，置于預(yù)處理液中，14 ℃處理1 h；預(yù)處理液為0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉溶液與0.05 g·L-1的秋水仙素溶液等量混合液。用蒸餾水沖洗后放入卡諾固定液[V(無水乙醇)∶V(冰乙酸) =3∶1]中4 ℃固定24 h。將根尖沖洗后置于0.075 mol·L-1氯化鉀溶液中，室溫低滲處理30 min。沖洗，置于0.25 mol·L-1的鹽酸溶液37 ℃水浴12 min。沖洗10 min后用酶解液37 ℃水浴18 min，酶解液中纖維素酶(Cellulose Onozuka R-10)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，果膠酶(Pectolyase Y-23)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。蒸餾水中進(jìn)行后低滲處理30 min以上，切取分生區(qū)，用鑷子尖將材料稍壓分散，滴改良品紅染液染色2 min。蓋上蓋玻片后用解剖針尖輕敲，使細(xì)胞溫和地逐步分散后用拇指輕壓。

1.2.2 核型分析 用OLYMPUS BX 51顯微鏡觀察染色體制片，在100×物鏡下對染色體充分分散的中期分裂細(xì)胞進(jìn)行拍照。對河南鐵棍山藥材料取40個中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體計數(shù)。選擇背景清晰、染色體形態(tài)清晰的5個細(xì)胞進(jìn)行染色體長度的測量，用于核型分析。圖像采集和指標(biāo)測量均使用奧特光學(xué)顯微圖像處理系統(tǒng)OPTPro 2008 v 2.0完成。按染色體形態(tài)大小和著絲粒位置進(jìn)行染色體配對，并根據(jù)染色體臂長計算出染色體絕對長度、相對長度和臂比等核型參數(shù)。使用Karyo 3.1染色體分析軟件進(jìn)行染色體核型圖的制作，運用Microsoft office Excel制作核型模式圖。核型分析參照李懋學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)[6]，核型分類依據(jù)Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)劃分[7]。根據(jù)LIMA-de-FARIA的染色體場理論[8]，絕對長度小于1 μm屬于微小型染色體，絕對長度在1～4 μm屬于小型染色體。核型不對稱系數(shù)的計算按照ARANO的方法，即核型不對稱系數(shù)=長臂總長/全組染色體總長[9]。著絲粒位置按照LEVAN的方法[6]劃分，相對長度指數(shù)(index of relative length，IRL=染色體長度/全組染色體平均長度)，按照KUO[10]的方法計算并對染色體進(jìn)行分類。憑證標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜遺傳育種實驗室。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南鐵棍山藥的染色體數(shù)目

對河南鐵棍山藥根尖有絲分裂中期細(xì)胞的觀察統(tǒng)計結(jié)果表明，40個中期分裂相細(xì)胞中有35個細(xì)胞染色體數(shù)為120條，所占比例為87.5%。依照李懋學(xué)等[6]的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計的細(xì)胞中85%以上具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認(rèn)為是該植物的染色體數(shù)目。綜上所述，確定河南鐵棍山藥的體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=120。

2.2 染色體核型分析

河南鐵棍山藥材料的染色體中期分裂相圖像和核型圖見圖1，核型模式圖見圖2，染色體的臂長、臂比等核型參數(shù)見表1。

河南鐵棍山藥核型公式為2n=96 m(6 SAT)+18 sm(4 SAT)+4 st+2 T。其中中部著絲粒染色體占到80%，亞端部著絲粒染色體有2對，端部著絲粒染色體有1對；有5對染色體有隨體，分別為第1對、第3對、第5對、第6對、第7對染色體。染色體的絕對長度范圍為0.688～2.628 μm，根據(jù)LIMA-dE-FARIA的染色體場理論[8]，屬于微小型染色體或小型染色體，全組染色體絕對長度的全長為79.185 μm，均值為1.320 μm。相對長度范圍為0.869%～3.319%。根據(jù)相對長度指數(shù)劃分，河南鐵棍山藥的染色體組成為16 L+26M2+60M1+18 S。核型不對稱系數(shù)=長臂總長/全組染色體總長，即得58.13%。最長染色體長度是最短染色體長度的3.819倍，臂比大于2∶1的比例為11.67%，核型不對稱性屬于2B型。

圖1 河南鐵棍山藥中期染色體圖及核型圖

圖2 河南鐵棍山藥的核型模式圖

表1 河南鐵棍山藥染色體的核型參數(shù)

續(xù)表

注： 1，*：具隨體染色體；m：中部著絲粒； sm：近中部著絲粒； st：近端部著絲粒； T：端部著絲粒； 2，隨體長度計入染色體全長。

Note： 1.*: chromosome with satellite; m:median region; sm: submedian region; st: subterminal region; T: terminal point.2.the total length and arm ratio include the length of satellite.

3 討論

河南鐵棍山藥在一定區(qū)域內(nèi)栽培歷史悠久，已經(jīng)形成較為穩(wěn)定的地方品種。懷山藥2006年成為山藥中首個國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。北緯34.48°～35.30°、東經(jīng)112.02°～113.38°的地理范圍，即焦作市的溫縣、武陟等縣所產(chǎn)河南鐵棍山藥和另一當(dāng)?shù)仄贩N為受國家保護(hù)的原產(chǎn)地產(chǎn)品[11]。本試驗首次以該地方品種為研究對象，對其進(jìn)行染色體數(shù)目的統(tǒng)計及核型分析。由于山藥主要以無性繁殖的方式栽培，不同個體有可能為同一株系的后代，如果單一使用1份該地方品種材料進(jìn)行統(tǒng)計，有可能造成對該地方品種染色體數(shù)目的錯誤概括。為了更準(zhǔn)確報道河南鐵棍山藥的染色體數(shù)目，本試驗對不同年份引種的2份河南鐵棍山藥材料進(jìn)行染色體觀察計數(shù)。結(jié)果表明，河南鐵棍山藥的體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=120。

薯蕷屬植物花單性，雌雄異株，多數(shù)分布于在熱帶和亞熱帶，西非國家有多個種作為糧食作物栽培。在中國的地理分布較廣，種類以云南高原地區(qū)最多[12]，主要有參薯(D.alata)和山藥(D.oppositaThunb.)作為糧食作物栽培。許多種是多倍體，在自然進(jìn)化或人工栽培的進(jìn)程中，經(jīng)歷了極其復(fù)雜的變異過程[4]。薯蕷屬栽培種由于長期營養(yǎng)繁殖導(dǎo)致多數(shù)可食用種不能產(chǎn)生花[13]，或者不可育，而且栽培種的倍性水平比野生種更復(fù)雜多樣。這種現(xiàn)象與長期栽培、人工選擇有關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者開展了對該屬作物栽培生產(chǎn)體系中的種質(zhì)之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系研究。其中SCARCELLI等[14]通過對包括栽培種和野生種在內(nèi)的213份該屬植物種質(zhì)材料進(jìn)行AFLP分子標(biāo)記分析，研究了貝寧共和國該屬栽培種的遺傳本質(zhì)，在分子水平上證明了在傳統(tǒng)栽培生產(chǎn)體系中人們對該屬野生種的使用，也揭示了在這個過程中種間雜交、品種間雜交的發(fā)生。

薯蕷屬許多種有多個染色體數(shù)。BAQUAR對尼日利亞9個種進(jìn)行染色體計數(shù)，其中4個有多個染色體數(shù)，其他的5個種又有2個有不同染色體數(shù)目的報道[13]。秦慧貞等采自海南吊羅山、福建南靖、云南蒙自的黃獨(D.bulbiferaL.)分別有40，60，80條染色體[4]；盾葉薯蕷(D.zingiberensis)有2n=20的野生種，也有2n=40的栽培品種[15]。山藥(D.oppositaThunb.)染色體數(shù)目更多，它的染色體在薯蕷屬已知染色體數(shù)目的種中數(shù)目最多[4]，長期以來，對其染色體數(shù)目有140，144，138～140等報道，最新的報道為144條[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，山藥有2n=120的品種，表明山藥(D.oppositaThunb.)也有多個染色體數(shù)目。

一般認(rèn)為，亞洲的薯蕷屬植物以10為染色體基數(shù)[16]，那么，河南鐵棍山藥可能為12倍體。但近幾年里因同工酶、SSR、流式細(xì)胞儀等先進(jìn)技術(shù)的運用，SCARCELLI等[17]，GEMMA等[18],BOU-SALEM等[19]分別指出，薯蕷屬的D.rotundata，D.trifida，D.alata染色體基數(shù)為x=20，否定了傳統(tǒng)一直以來認(rèn)為的基數(shù)為10的學(xué)說。2012年NEMORIN等通過對1份D.alata(2n=80)的子代分析了基于SSR標(biāo)記的遺傳模式，確定了其多倍體類型為同源四倍體[20]。按薯蕷屬的染色體基數(shù)為x=20的理論，河南鐵棍山藥也可能為6倍體。至于是同源多倍體，還是異源多倍體有待進(jìn)一步分析研究。

本試驗核型分析觀察到，河南鐵棍山藥具有5對帶隨體的染色體。黃賢蘭等報道的來源于云南省的山藥的核型公式為：2n=144=57 m+84 sm+3 st，核型類型為2 B型[15]。本試驗中來源于河南焦作市的鐵棍山藥核型公式為：2n=120=96 m(6 SAT)+18 sm(4 SAT)+4 st+2 T，屬2 B型。雖然染色體數(shù)目、核型公式不同，但核型不對稱性同屬于2 B型，均說明了薯蕷是在系統(tǒng)演化上處于比較原始的植物。對比STEBBINS[7]核型分類指標(biāo)之一 “臂比大于2∶1的染色體百分比”，本試驗材料的數(shù)值為11.67%，小于黃賢蘭材料的29.16%；再有核型不對稱系數(shù)為58.13%，也小于黃賢蘭材料的63.95%[15]?？梢钥闯龊幽翔F棍山藥的不對稱性小于黃賢蘭報道的云南山藥的不對稱性。一般認(rèn)為，核型不對稱的植物比核型對稱的植物進(jìn)化程度高。因此，河南鐵棍山藥比云南山藥更為原始。相比自然變異多物種豐富的云南地區(qū)[12]，河南鐵棍山藥所處的環(huán)境更穩(wěn)定，推測河南鐵棍山藥在相對穩(wěn)定的自然環(huán)境中進(jìn)化速度較緩慢。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

Chromosome number and karyotype analysis of Henan Tiegun yam (DioscoreaoppositaThunb.)

ZHOU Yihu1, HUO Xiuwen1, LIU Xiangyu1, TAI Lihua2, MIAO Huiqin1, ZHANG Lingchao1

(1.College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019,China; 2.College of Life Science and Technology,Inner Mongolia Normal University,Hohhot 010022,China)

In this paper the chromosome number and karyotype of Henan Tiegun Yam (DioscoreaoppositaThunb.) were analyzed by the enzymatic hydrolysis and low osmotic method.The results indicated that the chromosome number was 2n=120 and karyotype formula was 2n=120=96 m (6SAT)+18 sm (4 SAT)+4 st+2 T.According to index of relative length,chromosomes are composed of 16 L+26M2+60M1+18 S.The absolute length was from 0.688 to 2.628 μm and the relative length was from 0.869% to 3.319%,which was classified into micro type and small type.The coefficient of asymmetric was 58.13%.The ratio of the longest chromosome to the shortest was 3.819 and the proportion of arm exceeding 2∶1 was 11.67%.The karytype belonged to “2 B” type and whose evolution was relatively original.

DioscoreaoppositaThunb.; chromosome number; karyotype analysis

2014-10-29

國家自然科學(xué)基金項目(31360480)

周翼虎(1986-)，男，山西翼城人，碩士研究生，從事蔬菜遺傳育種工作。

霍秀文(1968-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，教授，博士。

1000-2340(2015)03-0305-06

S 632.1

A