張賽賽，席章營，安云權(quán)，李明娜，謝慧玲，張瑩瑩，崔新建，陳彥惠，吳連成

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

?

玉米雄穗結(jié)實(shí)基因Ts9的初步定位

張賽賽，席章營，安云權(quán)，李明娜，謝慧玲，張瑩瑩，崔新建，陳彥惠，吳連成

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

利用具有Mu9轉(zhuǎn)座子的材料和豫82雜交，從M2分離群體中得到1株雄穗結(jié)實(shí)突變株，表現(xiàn)型為雄穗上的雄花中雄蕊發(fā)育受到抑制，雌蕊不發(fā)生退化，雄花轉(zhuǎn)化為雌花。遺傳分析表明，該突變性狀受1對顯性基因控制，初步命名為Ts9。以玉米自交系B 73與突變體材料雜交構(gòu)建BC1分離群體，利用SSR標(biāo)記將Ts9定位在第1染色體的1.09 bin區(qū)域，位于SSR標(biāo)記umc2047和umc1431之間，距這2個標(biāo)記之間遺傳距離分別為4.2和2.0 cM。

玉米；雄穗結(jié)實(shí)；遺傳分析；基因定位

玉米是通過敗育雄穗中的雌蕊和抑制雌穗中雄蕊進(jìn)而形成功能性單性花[1]。雌、雄穗的分化與形成是個連續(xù)的過程。根據(jù)變化過程中形態(tài)發(fā)育特點(diǎn)可分為生長錐未伸長期、生長錐伸長期、小穗分化期、小花分化期、性器官發(fā)育形成期等5個時期。在性別決定程序啟動之前雌、雄花序的發(fā)育幾乎是相同的,早期的雌性和雄性小花都具有相同的花器官原基,包括外稃和內(nèi)稃、1對漿片、3枚雄蕊原基和由3片心皮聚合成的1枚雌蕊原基。在小花分化期，正常發(fā)育的雄花會在小花基部形成3個雄蕊原始體，中間形成1個雌蕊原始體，稱為雌雄蕊形成期，隨后雄蕊繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生藥隔，雌蕊原始體便逐漸退化。

在玉米的性別決定過程中，根據(jù)不同功能基因突變產(chǎn)生的表現(xiàn)型將相關(guān)的突變體分為2類：雄性化突變體和雌性化突變體[2]。玉米雄穗小花性別反轉(zhuǎn)的異常株系稱為tassel seed(ts)突變體，共有的表現(xiàn)型特征是具雄穗結(jié)實(shí)(tassel seed)現(xiàn)象[3]。1955年，NICKERSON等[4]詳細(xì)描述了8種雄穗結(jié)實(shí)突變體(ts1～ts8)的表型，其中ts1，ts2，ts4，ts8為隱性基因，Ts3，Ts5，Ts6為顯性基因，ts7的研究僅限于表現(xiàn)型的描述。在ts1突變體中，雄花完全轉(zhuǎn)換為雌花，雌穗中子粒排列雜亂。ts1基因被定位在第2染色體短臂bin 2.04區(qū)域，編碼脂氧化酶，并影響植物激素茉莉酸的生物合成，阻止雌蕊正常退化過程而形成有功能的雌蕊[5]。ts2突變體的表現(xiàn)型類似ts1，被定位在第1染色體的bin 1.03區(qū)域，已被DELONG等[6]克隆出來。ts2基因編碼一個短鏈乙醇脫氫酶，ts2功能的喪失阻止了玉米植株中雄穗和雌穗中雌蕊的敗育，可能是產(chǎn)生雌蕊細(xì)胞凋亡的信號或者代謝一種細(xì)胞生活力的底物[7]。ts1和ts2也影響了雌穗中雌蕊的發(fā)育，次級小花器官退化受阻，結(jié)實(shí)小穗中產(chǎn)生功能正常的2個雌花，經(jīng)授粉后形成雙種子，使谷粒擁擠且排列不規(guī)則[8]。ts4的突變體表現(xiàn)為雄穗直立，有大量花絲，花序內(nèi)有大量不規(guī)則分支，結(jié)實(shí)子粒排列無規(guī)則。ts4基因被定位在第3染色體bin 3.04區(qū)域，編碼一個mir 172的microRNA，靶定APETALA2同源異型轉(zhuǎn)錄因子，不僅促進(jìn)雄花的發(fā)育，還調(diào)控小穗分生組織的分化[9]。Ts6的突變體性狀與ts4的類似，Ts6基因被定位在第1染色體bin 1.11區(qū)域，編碼一個類似于APETALA2的轉(zhuǎn)錄因子，它是TS4的一個靶位點(diǎn)[10]。Ts6和ts4突變體共有的特征是花序中小穗分支增加以及每個小穗產(chǎn)生多個小花[11]。ts8基因是si1的1個等位基因，位于第6染色體bin 6.02區(qū)域，突變性狀為雄性不育且長有花絲，雌穗生長有大量增生的花絲[12]。Ts5基因位于第4染色體bin 4.03區(qū)域，突變體表現(xiàn)為雄穗直立緊湊，有分支，附著的花絲較短，大多數(shù)雄穗分支基部有雌花生成，雄穗上有很少的子粒形成[13]，也有研究稱該突變基因?yàn)榘腼@性[14]。Ts3的雄穗上由雄花和雌花間隔排列，雌穗中次級小花發(fā)育正常，被定位在第1染色體bin 1.09區(qū)域[15]。近年來，對已發(fā)現(xiàn)的8個玉米雄穗雌性化突變體中部分基因進(jìn)行了克隆和功能研究，深化了人們對玉米性別決定過程的認(rèn)識。但玉米性別決定調(diào)控途徑中有哪些基因以及這些基因是如何相互作用等還有待深入研究。本研究前期利用Mu9作為mutator轉(zhuǎn)座子供體材料，以優(yōu)良玉米自交系豫82為受體材料，并從其后代中得到一個雄穗結(jié)實(shí)突變體，初步將其命名為ts9。該突變體表現(xiàn)為雄穗中的雄蕊發(fā)育受到抑制，雌蕊不發(fā)生退化，雄穗長有大量花絲，完全轉(zhuǎn)化為雌花。為此，針對該突變性狀進(jìn)行了表現(xiàn)型特征和遺傳規(guī)律的研究，利用SSR分子標(biāo)記對突變體雄穗結(jié)實(shí)性狀進(jìn)行了初步的基因定位，以期為該基因的克隆、功能分析及玉米性別分化的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含Mu9活性轉(zhuǎn)座子的玉米材料由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賴錦盛教授饋贈；豫82是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的具有緊湊株型、良好抗病性以及很強(qiáng)適應(yīng)性的優(yōu)良玉米自交系。2011年夏用含Mu9轉(zhuǎn)座子的玉米材料作父本與豫82雜交，隨后通過自交獲得M2分離群體，觀察鑒定得到雄穗結(jié)實(shí)突變株Ts9，并從2011冬開始通過回交產(chǎn)生了具有Mu9轉(zhuǎn)座子的豫82近等基因系。

1.2 定位群體的構(gòu)建及表型特征觀察

2013年夏用雄穗結(jié)實(shí)突變株做母本，自交系B 73為父本，雜交獲得F1，2013年冬從F1中選雄穗結(jié)實(shí)突變株做母本，B 73做父本，構(gòu)建BC1分離群體。2014年夏通過BC1分離群體對突變體進(jìn)行表型鑒定與基因定位。在玉米小花分化期，取正常植株和突變體的雌穗和雄穗，將所取樣品用4%戊二醛固定，用于掃描電鏡觀察其穗分化；在抽雄期調(diào)查分離群體中的突變個體數(shù)和正常個體數(shù)，用χ2測驗(yàn)確定其分離比例。

1.3 基因組DNA提取及基因的初定位

2014年夏天，在玉米5～6片葉時采用CTAB法提取BC1分離群體中單株葉片的基因組DNA，并選取10株雄穗結(jié)實(shí)突變單株的DNA和10株表型正常單株的DNA，等量混合后，分別構(gòu)建 “突變池”和“對照池”。利用玉米基因組數(shù)據(jù)庫選擇的均勻覆蓋10條染色體的535對SSR引物，采用分離群體分組分析法(Bulked segregant analysis, BSA)[18]進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，利用與目標(biāo)基因連鎖的SSR標(biāo)記對基因進(jìn)行初步定位。

1.4 突變基因的遺傳連鎖分析

將母本突變體材料基因型記為Aa，帶型記為3，父本B 73基因型記為aa，帶型記為1，缺失的單株記為0。利用Mapmaker 3.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算連鎖標(biāo)記之間的遺傳距離[16]，用MapDrawV 2.1繪制目標(biāo)基因組區(qū)段的染色體連鎖圖[17,18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離群體中雄穗結(jié)實(shí)突變株的表型特征

田間性狀調(diào)查顯示，在分離群體中，突變體株高與正常植株株高基本一致，突變個體在抽雄前植株頂端膨大變粗，包裹頂端雄穗的葉鞘變寬變長，與雌穗的苞葉類似，葉色較正常，植株略濃綠。雄穗抽出后，雄性小花完全轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄源菩孕』?，整個雄穗被花絲覆蓋；突變體的雄穗分枝數(shù)與正常植株相比變化不大，且緊緊圍繞主軸排列(圖1-A,B)。個別單株在雄穗頂端有成熟的雄花出現(xiàn)，并能產(chǎn)生可育花粉；植株較弱時需及時去頂端雌性化的雄穗后才能長出正常的雌穗；植株健壯時，上端的雌性化雄穗和植株中部的雌穗均能正常發(fā)育。突變材料的雄穗和雌穗在接受花粉時均可正常結(jié)實(shí)，無雙種子產(chǎn)生，子粒排列規(guī)則(圖1-C)。電鏡觀察顯示，突變體雄穗的雄花在小花分化期的初級小花雌蕊發(fā)育正常，而3個雄蕊的發(fā)育受到抑制(圖1-D)；在性器官形成期，突變體雄穗的雄花的雌蕊原基迅速增大，形成胚珠(圖1-E)。

A， B，C：突變株的雄穗； D，E：電鏡下突變株的雄穗；og-花穎，p-雌蕊，s-雄蕊，si-花絲，op-胚珠。

A,B,C: Tassel with feminized florets, as shown by presence of silks； D,E:SEM of the tassel of theTs9 mutant; og： the outer glume, p： the pistil primordial, s： stamen; si： silk; op： a single ovule primordium.

圖1 玉米突變體的形態(tài)特征

Fig.1 Phenotype of the maize mutants

2.2 雄穗結(jié)實(shí)突變基因的遺傳分析

由于絕大多數(shù)突變體不能產(chǎn)生花粉，不能產(chǎn)生純合的突變材料，2013年夏利用突變株做母本與B 73雜交，其F1群體發(fā)生性狀分離，雄穗結(jié)實(shí)突變體株數(shù)與正常植株株數(shù)分別為125和137株，符合1∶1的分離比例，初步表明，該突變基因?yàn)轱@性。2013年冬利用F1群體中的突變體為母本，與玉米自交系B 73回交，獲得其BC1種子。2014年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州科教園區(qū)將突變體與B 73所組配的BC1分離群體進(jìn)行田間表型性狀調(diào)查，其突變株數(shù)和正常株數(shù)分別為346株和368株，χ2檢驗(yàn)表明，群體中的突變單株與非突變單株的分離為1∶1(表1)，符合單基因控制的性狀分離規(guī)律，說明該突變性狀是受1對顯性基因控制。同時，因該突變體的表現(xiàn)型與已知的8個單基因雄穗結(jié)實(shí)ts突變體的表型不同，所以，初步將其命名為ts9。

表1 玉米突變體分離群體的χ2檢測

2.3 雄穗結(jié)實(shí)突變基因的初步定位

將均勻分布于10條染色體上的535對SSR引物在B 73和做母本的突變單株間擴(kuò)增，共篩選出30對在兩親本間多態(tài)性比較好的引物，然后，用這些引物分別在兩基因池間進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選到16對多態(tài)性引物。用在兩池間有多態(tài)的SSR標(biāo)記在BC1代群體中各單株間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)位于第1染色體上bin1.08～1.09的5對SSR標(biāo)記phi423298，bnlg2228，umc2047，umc2612，umc1431與突變基因連鎖。經(jīng)連鎖分析，將目的基因Ts9初步定為在SSR分子標(biāo)記umc2047和umc431之間，兩標(biāo)記之間遺傳距離為6.2 cM，其物理距離約為10 Mb。Ts9距SSR標(biāo)記umc2047的遺傳距離為4.2 cM，距umc1431的遺傳距離為2.0 cM(圖2)。

圖2 玉米雄穗結(jié)實(shí)突變體基因Ts9在染色體上的位置

3 討論

本研究由前期構(gòu)建的Mu轉(zhuǎn)座子M2分離群體中篩選到1個與玉米性別決定有關(guān)的雄穗結(jié)實(shí)突變體，該突變體雄穗中小花在小花原基形成小花的過程中，初級小花的3個雄蕊并沒有生成藥隔，雌蕊原始體也沒有逐漸退化，反而是雌蕊原基迅速增大形成胚珠，3個雄蕊的發(fā)育受到抑制，雌蕊的發(fā)育完全正常，最終形成可育的雌花，抽雄后整個雄穗長滿花絲。但在田間調(diào)查(Ts9×B 73)×B 73群體的表現(xiàn)型時發(fā)現(xiàn)，在346個突變單株中有8株突變體的雄穗中上部有發(fā)育正常的雄花且能正常散粉結(jié)實(shí)，并有部分小花形成了1個花藥或2個花藥。其具體原因是遺傳背景、基因回復(fù)突變，還是環(huán)境問題，有待進(jìn)一步研究。

在已報(bào)道的顯性雄穗結(jié)實(shí)突變體中，已知的定位結(jié)果顯示，Ts3和Ts6分別位于1號染色體的bin1.09和bin1.11區(qū)域[11,15]。Ts3突變體雄穗中被一些不育的雌花隔開，常形成一個環(huán)，而不是成行排列，在頂部形成不育的雌蕊，而且雌穗中次級小花發(fā)育[18]。Ts6的典型特征是雌穗和雄穗均有增殖的分枝[11]。本研究發(fā)現(xiàn)的Ts9突變體表現(xiàn)為雄穗分支與正常分枝類似，但整個雄穗中小花都完全雌性化，能授粉結(jié)子，且雌雄穗的子粒排列規(guī)則，次級小花不能發(fā)育，與Ts6表型差異較大，并且定位區(qū)間不同，故與Ts6是不同的基因。PHIPPS[15]在1928年首次提到的ts3，EMERSON對其進(jìn)行了詳細(xì)的表型描述并將其定位在第1染色體[19]；從玉米基因組數(shù)據(jù)庫中了解到，最原始的材料已丟失，現(xiàn)有的Ts3材料是由DOONER發(fā)現(xiàn)的，表現(xiàn)型與EMERSON的描述類似，定位在bin1.09區(qū)域。本研究將該顯性突變基因初步定位在第1染色體上的bin1.09區(qū)域，包含距離Ts3最近的2個分子標(biāo)記TIDP6329和 IDP7685，物理距離約為5 Mb。Ts9與Ts3雖然同在bin1.09區(qū)域，但定位區(qū)間較大，而且兩者的表型不完全一致，又都沒有精細(xì)定位和功能研究，是否為同一基因或緊密連鎖的基因，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)并研究了與玉米性別決定有關(guān)的Ts9突變體。該突變體表型為雄穗上雄性小花轉(zhuǎn)化為雌性小花，并能正常結(jié)實(shí)。電鏡觀察得知，是由于在小花分化期，雄穗花序中雄蕊發(fā)育受到抑制，而雌蕊不退化造成的。遺傳分析及初定位表明，Ts9是受1對顯性基因控制，接下來將利用構(gòu)建的分離群體進(jìn)一步對Ts9基因進(jìn)行精細(xì)定位、克隆和功能研究，以期為探究玉米性別決定和進(jìn)化機(jī)制提供依據(jù)，為玉米性別決定在高產(chǎn)育種的應(yīng)用做出一定的貢獻(xiàn)。

[1] CHUCK G, MEELEY R, HAKE S. Floral meristem initiation and meristem cell fate are regulated by the maize AP2 genesids1 andsid1[J]. Development， 2008,135(18):3013-3019.

[2] EIT B, SCHMIDT R J, HAKE S, et al.Maize floral development:new genes and old mutants[J]. The Plant Cell, 1993,5(10):1205-1215.

[3] YANG T W, LI C H. Hormone regulation of sex determination in maize[J].Chinese Bulletin of Botany, 2012,47(1):65-73.

[4] NICKERSON N H, DALE E E. Tassel modifications in Zea mays[J].Ann Mo Bot Gard, 1955,42:195-212.

[5] ACOSTA I F, LAPARRA H, ROMERO S P, et al. Tasselseed1 is a lipoxygenase affecting jasmonic acid signaling in sex determination of maize[J]. Science, 2009, 323:262-265.

[6] DELONG A, CALDERON-URREA A, DELLAPORTA S L. Sex determination geneTASSELSEED2 of maize encodes a short-chain alcohol dehydrogenase required for stage-specific floral organ abortion[J]. Cell, 1993,74(4):757-768.

[7] CALDERPM-URREA A, DELLAPORTA S L. Cell death and cell protection genes determine the fate of pistils in maize[J]. Development, 1999,126(3):435-441.

[8] BORTIRI E, HAKE S. Flowering and determinacy in maize[J]. Journal of experimental botany, 2007,58(5):909-916.

[9] CHUCK G, MEELEY R, IRISH E, et al. The maize tasselseed4 microRNA controls sex determination and meristem cell fate by targeting tasselseed6/indeterminate spikelet1[J]. Nature genetics, 2007,39(12):1517-1521.

[10]CHUCK G, MEELEY R B, HAKE S. The control of maize spikelet meristem fate by the APETALA2-like gene indeterminate spikelet1[J]. Genes & development, 1998,12(8):1145-1154.

[11]IRISH E E, NELSON T M. Interactions between tassel seed genes and other sex determining genes in maize[J]. Developmental Genetics, 1994, 15:155-171.

[12]STINARD P S ,ROBERTSOND S.ts8 is allelic tosi1[J].MNL, 1991,65:18.

[13]DELLAPORTA L, CALDERON S. The sex determination process in maize. [J].Science，1994,266: 1501-1505.

[14]AMBROSE B. Molecular and genetic analyses of the silky1 gene reveal conservation in floral organ specification between eudicots and monocots.[J]Mol Cell, 2000,5(3):569-579

[15]PHIPPS. Heritable characters in maize XXXL tasselseed-4[J].The Journal of Heredity，1928, 19:399-404.

[16]AKKAYA M S , BHAGWAT A A , CREGAN P B. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean[J].Genetics, 2003, 132:1131-1139.

[17]LANDER E S, GREEN P, ABRAHAMSON J. Mapmaker:aninteractive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations[J].Genomics，1987, 1:174-181.

[18]劉仁虎,孟金陵.MapDraw在Excel中繪制連鎖圖譜的宏[J].遺傳,2003,25(3):317-321.

[19]EMERSON R A, BEADLE G W, FRASER A C.A summary of linkage studies in maize[J].Cornell Univ Agric Exp Sta Mem，1935, 180:1-83.

(責(zé)任編輯：常思敏)

Initial genetic mapping of a tassel seed geneTs9 in maize

ZHANG Saisai, XI Zhangying, AN Yunquan, LI Mingna, XIE Huiling, ZHANG Yingying,CUI Xinjian, CHEN Yanhui, WU Liancheng

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

From a Mutator inserted M2segregating population constructed by a cross between Mu9 and Yu 82, a tassel seed mutant was isolated, which shows that the pistil in male flowers on the tassel is not degraded. This makes stamen development restrained and leads to a transformation of tassel florets from stamination to pistillation. The genetic analysis indicated that the mutant trait was controlled by a single dominant gene, designated asTs9 (tasselseed9)．In addition，by using SSR markers and BC1segregating population derived from the cross between the maize inbreds B 73 and the mutant, theTs9 gene was mapped between umc2047 and umc1431, with the genetic distance of 4.2 cM and 0.8 cM at 1.09 bin of chromosome 1.

maize (ZeaMayL.); tassel seed; genetic analysis; gene mapping

2014-12-13

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2012AA10A300)；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(122102110039)

張賽賽(1988-)，女，河南沈丘人，碩士研究生，主要從事玉米遺傳育種研究。

吳連成(1971-)，男，河南確山人，碩士研究生導(dǎo)師。

1000-2340(2015)03-0301-04

S 513

A