韓亞利，任 妍，程西永，謝科軍，張艷林，朱保磊，詹克慧

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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小麥穗發(fā)育障礙的遺傳及cDNA-AFLP分析

韓亞利，任 妍，程西永，謝科軍，張艷林，朱保磊，詹克慧

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

在2個(gè)雜交組合周麥16/豫農(nóng)2593和豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)的F2群體中，發(fā)現(xiàn)小麥穗發(fā)育障礙植株。該植株所有的穗發(fā)育障礙，小穗變長(zhǎng)，小穗數(shù)減少，且排列間距明顯增大，花藥癟瘦，花絲稀疏不伸長(zhǎng)，不能正常開(kāi)花，雌蕊發(fā)育萎縮，且這些性狀在世代間可穩(wěn)定遺傳。對(duì)2個(gè)組合F3∶4和F4∶5分離株系中穗發(fā)育正常植株和穗發(fā)育障礙植株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比例均符合3∶1，表明穗發(fā)育障礙是由1對(duì)隱性等位基因控制的，并非受環(huán)境的影響。利用cDNA-AFLP技術(shù)，通過(guò)109對(duì)引物組合對(duì)正常型和發(fā)育障礙型材料在幼穗分化的單棱期和二棱期的表達(dá)譜進(jìn)行分析，共獲得17 486個(gè)轉(zhuǎn)錄衍生片段(TDF)，其中有20個(gè)TDFs在正常型和障礙型之間表現(xiàn)出差異。對(duì)這些差異TDFs進(jìn)行克隆測(cè)序并利用生物信息學(xué)比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，有10個(gè)TDFs與已知功能的基因具有高度相似性，功能主要涉及脅迫響應(yīng)、細(xì)胞和組織代謝、促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)調(diào)節(jié)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；有6個(gè)TDFs與功能未知的基因相似性較高；其余4個(gè)TDFs未匹配到序列相似性，可能是一些新的基因。

小麥; 穗發(fā)育障礙; 性狀表現(xiàn); 遺傳分析; cDNA-AFLP; 生物信息學(xué)

小麥?zhǔn)侵袊?guó)的主要糧食作物之一，隨著耕地資源不斷減少，進(jìn)一步提高小麥品種的產(chǎn)量潛力對(duì)提高小麥產(chǎn)量至關(guān)重要，也關(guān)系到國(guó)家的糧食供需平衡和安全。從河南省的育種情況看，小麥的穗粒數(shù)對(duì)產(chǎn)量的影響越來(lái)越大，已成為品種產(chǎn)量潛力突破的瓶頸[1]，因此，研究小麥穗部發(fā)育及其相關(guān)基因?qū)μ岣咝←溒贩N的產(chǎn)量潛力極為重要。前人對(duì)小麥穗部發(fā)育的研究多集中在栽培和生理方面，如通過(guò)外源激素對(duì)溫光敏型核不育小麥育性的研究[2]，發(fā)現(xiàn)在育性敏感期用外源IAA，GA3和ABA處理溫光敏核雄不育小麥的不育株和可育株，花粉育性和自交結(jié)實(shí)率都有不同程度提高，且降低不育植株的不育度，提高可育植株的可育度。朱云集等[3]研究認(rèn)為，拔節(jié)期、孕穗期施氮可延長(zhǎng)穗花發(fā)育的時(shí)間，減少穗花退化，增加穗粒數(shù)；發(fā)育中后期施氮還可以提高小麥生育后期的光合速率，延長(zhǎng)灌漿高峰期的時(shí)間，顯著提高粒重和子粒產(chǎn)量。小麥缺乏微量元素鋅、鐵、硒時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量都會(huì)受到不同程度的影響[4]。春季低溫導(dǎo)致冬小麥不育小穗數(shù)增加，穗粒數(shù)明顯減少，粒重降低[5]。在遺傳研究方面，前人曾報(bào)道了多效基因SDA1，該基因使小麥的抽穗期延遲，花器官發(fā)育畸形且影響植株的糖分轉(zhuǎn)化與利用[6]。DISTELFELD等[7]研究了春化基因VRN1，VRN2，VRN3以及光周期基因PPD1之間的相互作用機(jī)制以及它們?nèi)绾握{(diào)控小麥、大麥的開(kāi)花期。還有一種特殊類(lèi)型的小麥材料三粒小麥，這種小麥的雌蕊有3個(gè)柱頭，在1個(gè)小花內(nèi)可以結(jié)3粒種子[8]，這種結(jié)實(shí)特點(diǎn)和花器官組成的小麥勢(shì)必會(huì)在選育高產(chǎn)小麥品種、雜種優(yōu)勢(shì)利用和研究植物花器官發(fā)育等方面提供幫助。有關(guān)穗發(fā)育研究方面，對(duì)水稻類(lèi)似控制生長(zhǎng)發(fā)育基因的研究較多。文雯等[9]曾報(bào)道了一個(gè)由1對(duì)隱性等位基因控制的水稻雙子房突變體TOR。該突變體表現(xiàn)為植株矮化且高度不育，通過(guò)編碼F-box蛋白來(lái)調(diào)控水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖發(fā)育的基因AP01[10]。其突變體的穗明顯短小、心皮畸形、雄蕊轉(zhuǎn)化為漿片。還有基因DDF1[11]的突變導(dǎo)致水稻植株矮化、花器官變異。該基因編碼的F-box 蛋白同時(shí)控制水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖發(fā)育[12]。綜合以上研究結(jié)果，作為產(chǎn)量形成重要器官的穗，其發(fā)育的遺傳機(jī)制研究較少，一方面是由于穗的發(fā)育過(guò)程和遺傳機(jī)制可能比較復(fù)雜，另一方面也缺乏相應(yīng)的遺傳材料，因此，發(fā)掘更多穗發(fā)育的相關(guān)基因有助于揭示穗發(fā)育的遺傳機(jī)制。2010年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種后代圃中發(fā)現(xiàn)2個(gè)雜交組合的F2代出現(xiàn)了一些穗發(fā)育障礙的植株，大約占到10%，這些植株小穗排列間距明顯增大，小穗數(shù)減少，整株小花發(fā)育障礙，雌蕊育性嚴(yán)重降低，雄性高度不育，收獲F2代部分正常植株種植后，次年發(fā)現(xiàn)部分F2∶3家系也出現(xiàn)這種現(xiàn)象，表現(xiàn)出能夠穩(wěn)定遺傳。為了進(jìn)一步了解該穗發(fā)育障礙材料的遺傳特點(diǎn)，對(duì)這兩個(gè)雜交組合后代的障礙株和正常株進(jìn)行了表型差異和遺傳分離研究，并運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)控制該小麥穗發(fā)育障礙的相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料為出現(xiàn)小麥穗發(fā)育障礙植株的雜交組合周麥16/豫農(nóng)2593和豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)的F3∶4和F4∶5家系。

1.2 田間試驗(yàn)與調(diào)查

田間試驗(yàn)于2011—2012年度和2012—2013年度在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州科教試驗(yàn)園區(qū)進(jìn)行。2011—2012年度，選取2個(gè)雜交組合上年度出現(xiàn)表現(xiàn)型差異的F2∶3家系中的正常株種子種植，各種植4行，行長(zhǎng)1 m，行距23 cm，單粒點(diǎn)播，株距10 cm，并從各組合均選取10個(gè)分離株系，每個(gè)株系從小區(qū)中間區(qū)域隨機(jī)選取5株穗發(fā)育障礙株和5株正常株，調(diào)查株高、穗長(zhǎng)、脖長(zhǎng)、穗下節(jié)長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)、旗葉寬、小穗數(shù)和單株穗數(shù)等性狀，并計(jì)算小穗排列密度(小穗數(shù)/穗長(zhǎng))。2012—2013年度，選取2個(gè)雜交組合上年度出現(xiàn)基因分離的F3∶4家系中的正常株種子種植，每個(gè)單株種植6行，行長(zhǎng)1 m，行距23 cm，單粒點(diǎn)播，株距10 cm。小麥抽穗后，觀察各株系的表型分離情況，并調(diào)查各分離株系中正常株和障礙株的株數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將每個(gè)株系中的5株穗發(fā)育障礙株和5株正常株分別計(jì)算平均數(shù)，然后采用配對(duì)的t測(cè)驗(yàn)方法進(jìn)行性狀差異分析。遺傳分離比例的確定采用卡方測(cè)驗(yàn)方法。數(shù)據(jù)分析是利用Excel進(jìn)行的。

1.4 cDNA-AFLP分析

根據(jù)小麥發(fā)育的外部形態(tài)指標(biāo)，確定小麥穗發(fā)育的時(shí)期，于2013年3月隨機(jī)選取周麥16/豫農(nóng)2593和豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)2個(gè)雜交組合的F4∶5代群體中穗軸節(jié)片原基分化期和小穗原基分化期即單棱期和二棱期的小麥幼穗，由于此時(shí)正常株與障礙株無(wú)法在形態(tài)上分離，取穗時(shí)依據(jù)行號(hào)進(jìn)行掛牌標(biāo)記，抽穗以后進(jìn)行調(diào)查驗(yàn)證。取回的幼穗在冰上迅速剝離(保持其幼穗活性，減少RNA的降解)，并盛于對(duì)應(yīng)標(biāo)記的1.5 mL離心管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。待小麥抽穗之后，?013年5月對(duì)正常植株與障礙植株的表現(xiàn)型進(jìn)行鑒定，并將同一雜交組合的正常幼穗與障礙幼穗分別進(jìn)行混合，為總RNA提取做準(zhǔn)備。

1.4.1 樣品總RNA提取和雙鏈cDNA的合成 參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取各材料的總RNA。經(jīng)過(guò)瓊脂糖變性膠進(jìn)行總RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)后，利用雙鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa)合成雙鏈cDNA。

1.4.2 雙鏈cDNA純化濃縮、限制性雙酶切和接頭連接 采用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)溶液純化雙鏈cDNA，無(wú)水乙醇沉淀后濃縮，加適量的滅菌蒸餾水，依據(jù)A260值將對(duì)照和各種低磷處理的雙鏈cDNA含量調(diào)整至相同濃度。常規(guī)方法進(jìn)行MseI和PstI限制性雙酶切。其后，在反應(yīng)體系中加入1 μL的T4 DNA連接酶，PstI接頭和MseI接頭各1 μL，以及1 μL 10×T4連接酶緩沖液，進(jìn)行接頭連接。其中，MseI接頭序列為5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’(正向)和5’-TACTCAGGACTCAT-3’(反向)；PstI接頭序列為5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’(正向)和5’-TGTACGCAGTCTAC-3’(反向)。

1.4.3 cDNA-AFLP預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增 參照DAE等[13]的方法，將完成限制性雙酶切和連接接頭的產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)程序?yàn)?5 ℃下2 min，隨后為30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)中包括95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min。完成后將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存。其中，用于預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的引物為M00(5’-GATGAGTCCTGAGTA-3’)和P00(5’-AGACTGCGTACATGCAG-3’ )，分別與MseI和PstI的接頭序列相匹配。選用12條M引物和15條P引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。其中，12條M引物分別與MseI的預(yù)擴(kuò)增引物匹配，15條P引物分別與PstI的預(yù)擴(kuò)增引物匹配，但上述引物的3’端較預(yù)擴(kuò)增引物均增加3個(gè)隨機(jī)堿基。每條M引物分別與P引物進(jìn)行組合，共有180個(gè)引物對(duì)組合，但其中有71對(duì)擴(kuò)增效果不理想，最終選用了109對(duì)引物組合進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。用于選擇性擴(kuò)增的M引物和P引物如表1所示。cDNA-AFLP 的選擇性擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃下5 min后進(jìn)行13個(gè)下述熱反應(yīng)循環(huán)；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，13個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.7 ℃；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，24個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。不同材料的各引物組合均重復(fù)4次。

表1 cDNA-AFLP預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增引物

1.4.4 cDNA-AFLP產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯影 參考鄭宏遠(yuǎn)等[14]的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色和顯影。室溫下自然干燥膠板，拍照進(jìn)行數(shù)據(jù)保存。

1.4.5 差異條帶的PCR擴(kuò)增和克隆 用刀片從聚丙烯酰胺凝膠上切下重復(fù)間穩(wěn)定一致的差異條帶，置于1.5 mL離心管中，加100 μL蒸餾水，以96 ℃處理10 min，12 000 r·min-1離心20 min后，吸取上清液100 μL作為再次PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)體系及程序與前述選擇性擴(kuò)增相同，其中，各TDF再次擴(kuò)增時(shí)選用的引物，與cDNA-AFLP中鑒定該特異表達(dá)TDF的引物一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行二次膠回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體(上海sangon)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株DH5α。菌液PCR無(wú)誤后進(jìn)行測(cè)序(上海Sangon)，獲得TDF序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥穗發(fā)育障礙植株的形態(tài)特征和育性表現(xiàn)

在小麥抽穗后對(duì)穗發(fā)育障礙的植株觀察后發(fā)現(xiàn)(圖1-a ～ b)，與正常植株相比，障礙植株的所有麥穗均發(fā)育異常，抽穗稍晚，小穗變長(zhǎng)且排列間距明顯增大，小穗數(shù)減少。在偏光顯微鏡(Nikon Eclipse Soi)下觀察發(fā)現(xiàn)(圖1-c, 1-d, 1-e)，障礙株植株的花藥發(fā)育障礙，花藥癟瘦且畸形，花絲稀疏不伸長(zhǎng)，不能正常開(kāi)花，雌蕊發(fā)育萎縮。連續(xù)2 a利用其與多個(gè)親本進(jìn)行了人工雜交授粉，作為父本均沒(méi)有得到雜交種子，作為母本絕大多數(shù)雜交穗沒(méi)有得到雜交種子，偶有雜交穗結(jié)1粒種子，對(duì)其剪去部分穎殼進(jìn)行開(kāi)放授粉也是類(lèi)似結(jié)果，說(shuō)明其花粉完全敗育和雌蕊高度不育。

注：a. 抽穗表現(xiàn)；b.穗部形態(tài)特征；c.雄蕊形態(tài)特征；d.正常植株雌蕊形態(tài)特征；e.障礙植株雌蕊形態(tài)特征。

2.2 小麥穗發(fā)育障礙植株和正常植株的性狀差異

為了搞清穗發(fā)育障礙對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育的影響，對(duì)2個(gè)雜交組合的F3∶4分離株系的穗發(fā)育障礙植株和正常植株的部分性狀進(jìn)行了比較分析(表2)。從表2可以看出，雜交組合周麥16/豫農(nóng)2593的穗發(fā)育障礙植株與正常植株在株高、穗長(zhǎng)、脖長(zhǎng)、穗下節(jié)長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)、旗葉寬、小穗數(shù)、小穗密度都存在極顯著差異，雜交組合豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)的穗發(fā)育障礙植株與正常植株在穗長(zhǎng)、脖長(zhǎng)、穗下節(jié)長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)、小穗數(shù)、小穗密度都存在極顯著差異，在株高上存在顯著性差異，2個(gè)雜交組合小穗數(shù)和小穗排列密度的差異顯著程度明顯高于其他性狀。障礙植株與正常植株相比，株高、穗長(zhǎng)、脖長(zhǎng)、穗下節(jié)長(zhǎng)降低，旗葉變長(zhǎng)，主要是小穗數(shù)和小穗密度降低特別明顯，而單株穗數(shù)變化不大。

表2 小麥F3∶4代中障礙株與正常株性狀差異比較

注：*為障礙株減去正常株的差值。

Note： *means the difference between abnormal plants and normal plants.

2.3 小麥穗發(fā)育障礙基因的遺傳分析

為了研究該穗發(fā)育障礙的遺傳機(jī)制，對(duì)2個(gè)組合的F3∶4和F4∶5群體進(jìn)行了穗發(fā)育障礙株和正常株的調(diào)查(表3)。在雜交組合周麥16/豫農(nóng)2593中，調(diào)查了31個(gè)F3∶4代分離株系和22個(gè)F4∶5代分離株系，F(xiàn)3∶4代共1 071株，其中797株表現(xiàn)正常，274株表現(xiàn)障礙，經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，符合3∶1的分離比例；F4∶5代共1 738株，正常植株有1 309株，障礙植株有429株，也符合3∶1的分離比例。在雜交組合豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)的中，調(diào)查了22個(gè)F3∶4代分離株系和27個(gè)F4∶5代分離株系，F(xiàn)3∶4代共706株，其中530株表現(xiàn)正常，176株表現(xiàn)障礙，經(jīng)卡平方測(cè)驗(yàn)，符合3∶1的分離比例；F4∶5代共982株，正常植株有721株，障礙植株有261株，也符合3∶1的分離比例。綜合上述結(jié)果表明,該性狀是由1個(gè)隱性單基因控制的。

對(duì)周麥16/豫農(nóng)2593雜交組合F3∶4代的797個(gè)正常單株進(jìn)行F4∶5代株系鑒定，有520個(gè)株系發(fā)生分離，277個(gè)株系不出現(xiàn)分離，符合2∶1的分離比率(P=0.416)。對(duì)豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)雜交組合F3∶4代的482個(gè)正常單株進(jìn)行F4∶5代株系鑒定中，有310個(gè)株系發(fā)生分離，172個(gè)株系不出現(xiàn)分離，符合2∶1的分離比率(P=0.295)。這一結(jié)果也表明該性狀是由單基因控制的。

結(jié)合對(duì)2個(gè)雜交組合的F3∶4和F4∶5群體鑒定結(jié)果，說(shuō)明小麥穗發(fā)育障礙是受隱性單基因控制的。

表3 小麥穗發(fā)育障礙株和正常株的遺傳分離統(tǒng)計(jì)分析

2.4 小麥穗發(fā)育障礙基因的cDNA-AFLP分析

2.4.1 穗發(fā)育障礙基因表達(dá)相關(guān)的差異TDFs的cDNA-AFLP分析 為了尋找引起穗發(fā)育障礙的基因，利用cDNA-AFLP的技術(shù)對(duì)穗發(fā)育障礙植株和正常植株的表達(dá)譜進(jìn)行研究。在幼穗分化的單棱期和二棱期從周麥16/豫農(nóng)2593和豫農(nóng)2593/新麥9號(hào)的F4∶5代群體隨機(jī)選取障礙植株與正常植株，通過(guò)109對(duì)MseI和PstI酶切引物組合對(duì)2個(gè)雜交組合2種表現(xiàn)型小麥的2個(gè)分化時(shí)期分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，共觀測(cè)到17 486條清晰可見(jiàn)的片段，如圖2所示，是P14M8和P14M9引物的擴(kuò)增結(jié)果，每1對(duì)引物擴(kuò)增8個(gè)試驗(yàn)材料，其中正常型與發(fā)育障礙型各4個(gè)重復(fù)，平均每一泳道可以獲得20.1條片段。其中26個(gè)TDFs在障礙植株與正常植株間表現(xiàn)出差異，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分布為100～550 bp，將這26個(gè)差異TDFs分為6種類(lèi)型(表4)，既有有帶和無(wú)帶的差異，也有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的差異。將擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)基因表達(dá)差異分為以下3類(lèi)：(1)Ⅰ和Ⅱ類(lèi)型在正常株與障礙株的2個(gè)分化時(shí)期都存在差異，說(shuō)明這類(lèi)基因可能在穗分化早期即開(kāi)始表達(dá)，并持續(xù)表達(dá)了幾個(gè)時(shí)期，占差異條帶總數(shù)的30.77%，這類(lèi)基因在正常型中表達(dá)，即類(lèi)型Ⅱ有6個(gè)，在障礙型中表達(dá)，即類(lèi)型Ⅰ有2個(gè)；(2)Ⅲ和Ⅵ類(lèi)型只在正常株或障礙株的單棱期存在差異，說(shuō)明這類(lèi)基因可能表達(dá)得較早，但在穗發(fā)育的過(guò)程中由于某些原因表達(dá)抑制了，占差異條帶總數(shù)的30.77%，這類(lèi)基因在正常型中，即類(lèi)型Ⅲ有5個(gè)，在障礙型中表達(dá)，即Ⅵ有3個(gè)；(3)Ⅳ和Ⅴ類(lèi)型只在正常株或障礙株的二棱期存在差異，說(shuō)明這類(lèi)基因可能在穗發(fā)育前期沒(méi)有表達(dá)，隨著穗分化的進(jìn)行，在單棱期到二棱期的過(guò)渡時(shí)期開(kāi)始表達(dá)，其中，在正常型中表達(dá)，即Ⅳ有9個(gè)，在障礙型中表達(dá)，即Ⅴ有1個(gè)。

注：A.正常植株二棱期；B.正常植株單棱期；a.障礙植株二棱期；b.障礙植株單棱期；1.重復(fù)1；2.重復(fù)2 。

Note： A.The double ridge stage of the normal spike; B.The single ridge stage of the normal plants; a. Two ridge stages of the abnormal plants; b. Single ridge stage of the abnormal plants; 1&2. Two replicates.

圖2 小麥穗發(fā)育調(diào)控基因cDNA-AFLP電泳結(jié)果

Fig.2 Representative electropherograms of cDNA-AFLP revealing the differential fragments between the abnormal and normal spikes in common wheat

表4 穗發(fā)育障礙基因表達(dá)相關(guān)的差異TDFs的帶型分類(lèi)

2.4.2 穗發(fā)育障礙基因表達(dá)相關(guān)的差異TDFs的克隆、測(cè)序及同源性分析 為了研究穗發(fā)育障礙和正常之間的差異基因，對(duì)cDNA-AFLP所檢測(cè)的差異條帶進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序，成功獲得20個(gè)TDFs，其大小及所屬類(lèi)型見(jiàn)表5。Blastx結(jié)果表明，匹配到已知確切功能的差異TDFs有10個(gè)，占成功回收差異片段總數(shù)的50.00%；6個(gè)TDFs與未知功能或假定的蛋白有較高同源性，占成功回收差異片段總數(shù)的30.00%；4個(gè)TDFs未找到序列同源性，可能是一些尚未被發(fā)現(xiàn)的新基因。

2.4.3 小麥穗發(fā)育障礙基因表達(dá)相關(guān)的差異TDFs的功能分類(lèi) 把分析得到的20個(gè)已知確切功能的差異TDFs按功能分成以下7類(lèi)：脅迫響應(yīng)、細(xì)胞和組織代謝、促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、未知功能以及無(wú)同源性等，每一類(lèi)所包含的TDFs編號(hào)見(jiàn)表6。

在這些TDFs中，有許多TDFs的功能可能與植物的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。如P1M5同二穗短柄草的E3泛素蛋白連接酶RIN2-like基因相似，前人研究發(fā)現(xiàn)，水稻粒寬和粒重GW2基因編碼一個(gè)未知的RING型E3泛素連接酶[15]，將其底物錨定到蛋白酶體進(jìn)行降解，從而負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂，GW2 的WY3等位基因顯著地增加粒寬和千粒重，從而增加單株產(chǎn)量，該等位基因同時(shí)也能增加每株穗數(shù)、延長(zhǎng)生育期，并顯著地降低每穗粒數(shù)和主穗長(zhǎng)度，P1M5可能對(duì)小麥的子粒發(fā)育也存在影響。P1M8與ARF-GAPs基因的功能相似，而最近研究結(jié)果表明，AGDs 在激素信號(hào)、極化細(xì)胞生長(zhǎng)及器官分裂過(guò)程中具有重要的意義[16-18]。辣椒中CaAGD8基因在莖、葉、花組織中均為上調(diào)表達(dá)，而在根中的表達(dá)量下降，這表明CaAGD8 基因可能在辣椒的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用[19]。玉米的DSC1基因也編碼了一個(gè)ARF-GAP蛋白，該基因?qū)е掠衩装l(fā)育遲緩，籽粒皺縮，組織退化[20]。推測(cè)P1M8可能是影響小麥穗發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵基因。P4M8-2與水稻中的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源性較高，近年來(lái), 研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA介導(dǎo)的染色質(zhì)水平的基因沉默涉及植物的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答、表觀遺傳多態(tài)性, 并對(duì)植物的表型多樣化、生理適應(yīng)性以及植物進(jìn)化具有顯著影響[21]。

表5 小麥穗發(fā)育障礙基因表達(dá)相關(guān)的cDNA片段

表6 小麥穗發(fā)育障礙基因表達(dá)相關(guān)的差異TDFs的功能分類(lèi)

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致穗發(fā)育障礙的基因是由1對(duì)隱性基因控制的，該基因在純合隱性狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為穗部和小花發(fā)育障礙，導(dǎo)致小穗數(shù)減少以及小穗密度降低，花粉完全敗育，雌蕊高度不育。盡管對(duì)抽穗期、植株株高、穗下節(jié)長(zhǎng)、脖長(zhǎng)和旗葉大小等性狀也產(chǎn)生影響，但可能都是穗發(fā)育障礙對(duì)抽穗進(jìn)程產(chǎn)生影響引起的，該基因本身不控制這些性狀的遺傳。由于該基因是在2個(gè)雜交組合中發(fā)現(xiàn)的，但由于突變概率極低，不可能同時(shí)發(fā)生類(lèi)似的突變，所以，該突變應(yīng)該是在雜交親本中存在或發(fā)生的。從2個(gè)雜交組合的親本看，有共同親本豫農(nóng)2593，可以推斷該基因來(lái)源于該材料。豫農(nóng)2593是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種課題組選育的一個(gè)高代穩(wěn)定品系，由于是隱性突變，純合隱性不能結(jié)實(shí)，不易被發(fā)現(xiàn)，一旦某個(gè)雜合單株與其他親本進(jìn)行了雜交，在F2代中就會(huì)分離出大量隱性純合單株，這是該突變被發(fā)現(xiàn)的主要原因。通過(guò)從后代中建立純合隱性和顯性混合池進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，沒(méi)有檢測(cè)到緊密連鎖的分子標(biāo)記，推斷該材料可能在某個(gè)基因位點(diǎn)產(chǎn)生突變。

本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)分析，獲得了20個(gè)TDFs在穗發(fā)育正常型和障礙型之間表現(xiàn)出差異，其中有10個(gè)TDFs與已知功能的基因具有高度相似性，功能主要涉及脅迫響應(yīng)、細(xì)胞和組織代謝、促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)調(diào)節(jié)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，有6個(gè)TDFs與功能未知的基因相似性較高，其余4個(gè)TDFs未匹配到序列相似性。大部分TDFs的功能都是與細(xì)胞和組織代謝相關(guān)的，因此，推測(cè)小麥穗發(fā)育障礙的機(jī)制可能是關(guān)鍵基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目或改變細(xì)胞形態(tài)，或是影響跨膜運(yùn)輸作用，從而影響了細(xì)胞分化的速度，導(dǎo)致性狀差異，當(dāng)然，這一推斷還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。由于關(guān)鍵基因?qū)π←溣姿敕只鞍l(fā)育有明顯影響，因此，搞清其遺傳機(jī)制有助于闡明其等位正?；虻闹匾δ埽云谠谧魑锔牧己瓦z傳研究中得以更好利用。

植物中廣泛存在控制其生長(zhǎng)發(fā)育的多效基因，且分別在不同水平起著調(diào)控作用。水稻中發(fā)現(xiàn)的AP01基因與該基因有相似之處，突變均導(dǎo)致穗部發(fā)生變異，現(xiàn)已研究表明，AP01編碼的F-box蛋白在植物光形態(tài)建成、自交不親和、生物鐘節(jié)律、花和葉片發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[22]。TOB1基因編碼的YABBY蛋白，在調(diào)控水稻葉片中脈發(fā)育的同時(shí)還控制著花器官分化[23,24]。在小麥中，發(fā)現(xiàn)一種穗部發(fā)育萎縮且花器官明顯退化，但莖葉等其他器官發(fā)育正常的突變體sda1，遺傳分析表明，該基因是由1對(duì)隱性基因控制的，并定位于小麥6B染色體上，在標(biāo)記WMC398和BARC136之間，與兩標(biāo)記的遺傳距離分別為2.2和2.1 cM，該基因使小麥的抽穗期延遲，花器官發(fā)育畸形且影響著植株的糖分轉(zhuǎn)化與利用[6]。sda1基因與本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控小麥穗發(fā)育基因功能相似，都是對(duì)小麥穗部發(fā)育產(chǎn)生了明顯影響，但對(duì)比形態(tài)特征，sda1基因?qū)π←湷樗肫诤退腴L(zhǎng)影響較大，穗長(zhǎng)只有正常的1/2左右，而本研究發(fā)現(xiàn)的基因影響較小，抽穗期稍晚，2個(gè)組合的穗長(zhǎng)分別值減少0.72和0.53 cM，應(yīng)該屬于不同的基因。

cDNA-AFLP是一種將RT-PCR和AFLP技術(shù)相結(jié)合、從轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)差異的技術(shù)，該技術(shù)被廣泛用于植物抗病、抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育等研究領(lǐng)域[25-28]。本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)分析了小麥穗部發(fā)育基因的表達(dá)差異，結(jié)果不僅表明cDNA-AFLP技術(shù)在目的基因研究上的可行性，而且表明小麥穗分化是一個(gè)復(fù)雜多控的發(fā)育過(guò)程。擴(kuò)增結(jié)果表明，存在3種差異表達(dá)類(lèi)型基因，綜合這3種類(lèi)型基因可以看出，不同基因在小麥穗發(fā)育的不同時(shí)期其表達(dá)及表達(dá)量存在差異，在這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中，它們共同調(diào)控小麥的穗分化。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

Genetic and cDNA-AFLP analysis of abnormal spike development in common wheat

HAN Yali, REN Yan, CHENG Xiyong, XIE Kejun, ZHANG Yanlin, ZHU Baolei, ZHAN Kehui

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

This study found some plants with abnormal ears in F2generations of two hybrid combinations Zhoumai 16/Yunong 2 593 and Yunong 2 593/Xinmai 9. All ears of these abnormal plants were dysplastic, spikelets got longer and arranged spacing increased obviously, the number of spikelets cut down, anthers were shriveled and thin, filaments were sparse and could not elongate, which resulted in abnormal blossom,and the development of pistil was atrophic, and all the traits could be inherited stably in different generations. The ratio of normal plants and abnormal plants from F3∶4and F4∶5of two hybrid combinations were 3∶1, which showed that the abnormal ear development was controlled by a pair of recessive genes, instead of environment. We screened a total of 17486 transcript derived fragments (TDF) in which 20 TDFs successfully got through 109 pairs of markers for single ridge stage and two stages of normal and abnormal type ear differentiation by cDNA-AFLP technology. And then these TDFs after cloning and sequencing were analyzed by bioinformatics. The result showed that 10 TDFs were identified of high similarity to known function genes, which functions included stress responding, metabolism of cellular and organization, transport facilitation, expression regular and signal transduction, 6 TDFs were identified of high similarity with unknown function or putative protein, and the remaining 4 TDFs were found to be of no sequence similarity which might be some new genes. These results have important theoretical guiding significance for the study of wheat spike developmental regulatory genes and the reveal of wheat spike differentiation process.

wheat; abnormal spike development; traits performance; genetic analysis; cDNA-AFLP; bioinformatics

2014-12-16

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2014CB138105)

韓亞利(1989-) 女，河南夏邑人，碩士研究生，主要從事小麥育種研究。

詹克慧(1964-)，男，河南商城人，教授，博士。

1000-2340(2015)03-0292-09

S 512.1

A