楊軍英，劉慧兵，閆永峰

(1．河南師范大學(xué)體育學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007;2.河南師范大學(xué)省部共建細(xì)胞分化調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007;3.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘 476000)

永城煤礦塌陷區(qū)水塘污染狀況及鯽魚血液對(duì)其的指示研究

楊軍英1，劉慧兵2，閆永峰3*

(1．河南師范大學(xué)體育學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007;2.河南師范大學(xué)省部共建細(xì)胞分化調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007;3.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘 476000)

為了評(píng)估永城煤礦塌陷區(qū)重金屬污染情況，用水生生物指示水污染程度，采用pH計(jì)和原子吸收光譜法結(jié)合石墨消解法，檢測永城煤礦塌陷區(qū)土壤和水體樣本的pH值和重金屬含量,以污染區(qū)的鯽魚(實(shí)驗(yàn)組)和天沐湖自然保護(hù)區(qū)的鯽魚(對(duì)照組)作為樣本，觀察脅迫條件下鯽魚血常規(guī)和形態(tài)的變化.結(jié)果表明，煤礦塌陷區(qū)土壤和水體都呈弱酸性，符合土壤和地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).塌陷區(qū)土壤和水體中五種重金屬Cu,Cd,Pb,Cr和 Zn濃度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).實(shí)驗(yàn)組鯽魚白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞百分率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、中性粒細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞百分率均明顯減少(P<0.01).實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，該塌陷區(qū)域水體和土壤均有不同程度的重金屬污染.鯽魚的血細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)均發(fā)生了顯著變化.

永城；煤礦塌陷區(qū)；重金屬；鯽魚；血細(xì)胞

伴隨著煤礦工業(yè)的發(fā)展和資源的過度開采導(dǎo)致的大面積土地塌陷，已成為目前煤礦工業(yè)最嚴(yán)重的地質(zhì)災(zāi)害，環(huán)境問題和社會(huì)問題尤為嚴(yán)峻和突出.而塌陷區(qū)地勢低洼，雨水和地下水蓄積形成了常年的積水區(qū)，周圍的陸地生態(tài)環(huán)境變成了水生生態(tài)環(huán)境和濕地環(huán)境[1].由于毒性的持久性和生物蓄積性，重金屬污染成為煤礦塌陷區(qū)的另一嚴(yán)重危害[2]，進(jìn)一步造成了土壤、水體甚至動(dòng)植物體污染[3].因此，塌陷區(qū)的水土和生物監(jiān)測是有效評(píng)價(jià)礦區(qū)環(huán)境質(zhì)量和環(huán)境治理規(guī)劃必不可少的工作.魚的生理生化活動(dòng)易受環(huán)境因素的影響，尤其是對(duì)重金屬特別敏感，常常被作為重金屬污染的敏感生物指示物(Sensitive bio-indicator)用以評(píng)價(jià)水生生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況[4].有研究表明，在Cu2+，Cr6+污染條件下，鯽魚白細(xì)胞、紅細(xì)胞等顯著增多，以對(duì)抗可能由Cu2+污染引起的感染[5,6]. 永城市地處豫東平原，是我國重要的無煙煤基地.永城全市耕地約占總面積的70%.截至2005年底，永城市礦區(qū)塌陷面積已達(dá)2.67×107m2，覆蓋5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，87個(gè)村莊，塌陷區(qū)一半以上形成積水.近些年，雖然相關(guān)部門針對(duì)重金屬污染對(duì)該區(qū)域進(jìn)行了治理，但水土資源能否被利用還需要進(jìn)行評(píng)估.本研究對(duì)該地區(qū)的水體和土壤的pH和重金屬含量以及鯽魚血液進(jìn)行檢測，為永城市煤礦塌陷區(qū)的污染監(jiān)測和治理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

火焰原子吸收光譜儀，CWH-20 石墨消解儀，雷磁 PHS-3BW 高精度臺(tái)式酸度計(jì)，聚四氟乙烯消解罐，濃硝酸、高氯酸、氫氟酸、濃鹽酸、硝酸鑭等試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)樣地

研究樣地為河南省永城市十八里鎮(zhèn)劉崗村(33°57′N，116°21′E),此塌陷區(qū)形成于2006年，面積近30 hm2.

對(duì)照樣地為天沐湖自然保護(hù)區(qū)(34°35′N，115°41′E),屬于商丘市黃河故道的一部分.大面積的濕地、草灘構(gòu)成了典型的河谷自然景觀,附近沒有廠礦企業(yè)和其他污染源.

1.3 樣品采集與預(yù)處理

土壤樣本 在研究樣地的自然水塘和對(duì)照樣地的湖水附近隨機(jī)采集 20 cm 左右深度的濕土各 5 份，自然風(fēng)干后，研磨，過0.149 mm尼龍篩，混勻分裝后待檢.

水樣和生物樣本 在研究樣地的水塘和對(duì)照樣地的湖水中隨機(jī)采集水樣各 5 份.同時(shí)，選擇同一種且大小和質(zhì)量相似的鯽魚各10條，實(shí)驗(yàn)組樣本體長(20.8±2.3) cm，體重(197.6±18.1) g.對(duì)照組樣本體長(24.5±3.6) cm，體重(236.8±17.4) g.

1.4 pH檢測

土壤pH檢測 精確稱取風(fēng)干過濾的土樣，按1∶2.5的水土比例加去除CO2的水，劇烈攪拌5 min，使土粒分散均勻，放置1～3 h.試樣溶液搖勻后用pH計(jì)直接檢測.每個(gè)樣品重復(fù)測3次.

水樣pH檢測 用濾紙過濾后，用校準(zhǔn)好的pH計(jì)直接檢測.

1.5 重金屬含量檢測

土壤重金屬含量檢測 稱取土壤樣品0.5 g置于消解罐中(每個(gè)樣品做2個(gè)平行對(duì)照)，參照文獻(xiàn)[7]，用四酸消解法消解后，用少量1% HNO3溶液沖洗罐壁、溶解殘?jiān)?，定容?5 mL.使用火焰原子吸收分光光度計(jì)測定消解液中的銅、鎘、鉛、鉻、鋅含量.

水樣重金屬含量檢測 取0.45 μm 濾膜過濾的水樣各100 mL，加濃硝酸進(jìn)行消解，加蒸餾水定容至100 mL，測定其中銅、鋅、鉛、鎘、鉻的濃度.

1.6 鯽魚血細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)觀察

取鯽魚用紗布將其身體擦干，以體側(cè)穿刺尾動(dòng)脈取血法采血[8]，取少量血液制作血涂片，晾干,甲醇固定15 min，用瑞氏-吉姆薩染液染色30 min.中性樹膠封片，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù).

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPASS做統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果

2.1 水樣和土壤pH

永城煤礦塌陷區(qū)水樣和土壤的pH均偏酸性(圖1)，和對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，但符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(pH6-9)和土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).水樣pH略高于土壤pH，可能是由于礦物質(zhì)中含硫無機(jī)鹽溶解，改變了塌陷區(qū)魚塘的pH.

圖1 水樣和土壤pHFig 1pH of the water and soil

*P<0.05,和對(duì)照組相比(Compared to control group)

2.2 水樣重金屬含量

地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002 Ⅲ)規(guī)定，重金屬Cu,Cd,Pb,Cr和Zn的含量分別≤1.0,0.005,0.05,0.05和1.0 mg·L-1.對(duì)照組水樣中重金屬濃度均在 Ⅲ 類水標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的范圍內(nèi)，塌陷區(qū)水樣中重金屬含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).除 Cu 略高于標(biāo)準(zhǔn)值外，其余重金屬含量均遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)值(圖2).表明塌陷區(qū)水域受到Cr,Cd,Pb的污染比較嚴(yán)重，可能會(huì)對(duì)其中的水生生物產(chǎn)生影響.

圖2 水樣中重金屬的濃度Fig 2Concentration of heavy metals in the water

*P<0.05,和對(duì)照組相比(Compared to control group)

2.3 土壤重金屬含量

土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-1995Ⅰ)規(guī)定，重金屬Cu,Cd,Pb,Cr 和Zn的含量分別≤500,1.0,500,400和500 mg·kg-1.對(duì)照組土樣中重金屬濃度均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(圖3)，塌陷區(qū)土樣中五種重金屬濃度均高于Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)的約2倍，且顯著高于對(duì)照組(P<0.01).表明塌陷區(qū)的土壤被重金屬污染.

圖3 土樣中重金屬的濃度Fig 3Concentration of heavy metals in the soil

*P<0.05,和對(duì)照組相比(Compared to control group)

2.4 鯽魚血細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分率和嗜酸性粒細(xì)胞百分率顯著增多(P<0.01)(圖4)，而紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、單核細(xì)胞百分率、中性粒細(xì)胞百分率和嗜堿性細(xì)胞百分率都明顯減少(P<0.01).可能與塌陷區(qū)水中含有大量重金屬、鯽魚正常生長受到了脅迫、激活了應(yīng)激反應(yīng)有關(guān).

圖4 鯽魚血細(xì)胞數(shù)量變化Fig 4The numbers of blood cell of crucian

**P<0.01,和對(duì)照組相比(Compared to control group)

對(duì)照組鯽魚各組之間差異很小，各類細(xì)胞分布均勻，可看到較大的單核細(xì)胞和數(shù)量最多的血細(xì)胞(圖5).實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞數(shù)目減少，有核細(xì)胞數(shù)目增加，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞，這與血液計(jì)數(shù)檢測的結(jié)果基本一致.

A,B分別為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組(Represent the experimental group and control group,respectively)

圖5 鯽魚全血瑞氏-吉姆薩染色

Fig 5The G-W staining of whole blood

3 討論

監(jiān)測煤礦及塌陷區(qū)周圍水土的重金屬污染十分重要，特別是進(jìn)行漁業(yè)養(yǎng)殖、用水等開發(fā)利用活動(dòng)時(shí)必須對(duì)該區(qū)域環(huán)境做有效評(píng)價(jià).本研究檢測了永城煤礦塌陷區(qū)的土壤和水域中五種重金屬含量，并參照地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 3838—2002)規(guī)定的 Ⅲ 類水和土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618—1995)規(guī)定的Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其污染程度進(jìn)行評(píng)價(jià).研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，塌陷區(qū)水樣和土壤均偏酸性，但尚在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi).水樣中Cr,Pb,Cd,Zn含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)，土壤中重金屬含量約是標(biāo)準(zhǔn)的約2倍,土壤和水均被不同程度污染.

魚類對(duì)于水污染敏感且種群龐大，被生物界稱為監(jiān)測水質(zhì)好壞的“活體機(jī)器”[9,10]，是毒性試驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測等研究中常選用的實(shí)驗(yàn)材料.生物體的生理和病理的變化往往會(huì)引發(fā)血液成分的改變，所以對(duì)血液成分的檢測具有十分重要的意義.血液是測定魚類免疫功能變化的重要指標(biāo)之一.結(jié)合全血生理指標(biāo)檢測和瑞氏-吉姆薩染色，我們發(fā)現(xiàn)塌陷區(qū)鯽魚的紅細(xì)胞和血紅蛋白減少，白細(xì)胞數(shù)增加.此結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5,6],提示鯽魚處于此脅迫狀態(tài)下，其血細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目均發(fā)生了變化.

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(責(zé)任編輯 俞詩源)

Pollution status and indicator effect ofCarassiusauratusblood in the water of Yongcheng coal mine subsidence area

YANG Jun-ying1，LIU Hui-bin2，YAN Yong-feng3

(1.College of Physical Education,Henan Normal University,Xinxiang 453007,Henan,China; 2.Key Laboratory for Cell Differentiation Regulation,Henan Normal University,Xinxiang 453007,Henan,China; 3.School of Life Sciences,Shangqiu Normal College,Shangqiu 476000,Henan,China)

In order to evaluate the heavy metal pollution and indicate the pollution status usingCarassiusauratusblood in the water of Yongcheng coal mine subsidence area,pH and the content of heavy metal of soil and water samples have been detected by pen pH meter and atomic absorption spectrometry combined with Graphite digestion system.Carassiusauratussamples are collected from Yongcheng subsidence area(experimental group) and Tianmu lake nature reserve(control group) to observe the change of the blood routine examination and morphological when it is under stress condition.The results show that both soil and water pH are faintly acidic and within the soil environment degree of quality standard and surface water quality standard.The contents of Cu,Cd,Pb,Cr and Zn are higher than that of control both in water and soil samples(P<0.05).The numbers of white blood cell,lymphocyte and eosinophilic granulocyte percentage of experiment group are higher than that of control group(P<0.01).Nevertheless,the numbers of red blood cell and hemoglobin,neutrophile granulocyte and basicyte percentage are lower than that of control group(P<0.01).The result imply that the water and soil in Yongcheng coal mine subsidence area have been polluted by heavy metals at varying degree. The number and morphological of blood cell have been changed significantly under this stress condition.

Yongcheng;coal mine subsidence area；heavy metals；Carassiusauratus；blood

2005-03-10;修改稿收到日期:2015-04-20

河南省基礎(chǔ)研究與前沿項(xiàng)目(122300410253，122300410033)

楊軍英(1971—)，女，陜西寶雞人，副教授，博士.主要研究方向?yàn)榧?xì)胞分化. E-mail:041146@htu.cn

*通訊聯(lián)系人，男，教授，博士.主要研究方向?yàn)閯?dòng)物生態(tài)學(xué).E-mail:yanyf01@sina.com

S 131.2

A

1001-988Ⅹ(2015)04-0086-04