李曉婷

摘 要：目的：通過體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，給予抗proBDNF血清，觀察其對(duì)體外海馬神經(jīng)元發(fā)育及存活的影響。方法：取新生0～1h的SD大鼠海馬組織，體外培養(yǎng)神經(jīng)元，給予抗proBDNF羊血清處理進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，通過細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法觀察。結(jié)果：體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)有明顯的階段性。給予抗proBDNF處理后，其表達(dá)量與神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)、存活細(xì)胞數(shù)成正比。培養(yǎng)1d組的表達(dá)水平高于3d、7d組，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：給予外源性抗proBDNF羊血清處理后，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好且突起數(shù)目增多，提示內(nèi)源性的proBDNF抑制神經(jīng)元的發(fā)育，促進(jìn)凋亡，給予外源性抗體后，減弱其生物學(xué)作用，神經(jīng)元發(fā)育抑制因素減弱，存活細(xì)胞數(shù)、突起數(shù)增多。

關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元 proBDNF p75NTR sortilin

中圖分類號(hào)：R651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）05（b）-0241-02

神經(jīng)元的發(fā)育對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成及信號(hào)的傳導(dǎo)等神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行非常關(guān)鍵。在神經(jīng)元發(fā)育過程中，細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、遷移、與其他細(xì)胞建立功能性聯(lián)系，以及神經(jīng)再生過程中軸突的生長(zhǎng)等，除了受內(nèi)源性程序的調(diào)控，還受到局部環(huán)境因素的影響。例如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。

BDNF是一類多肽，通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化及存活而影響海馬的神經(jīng)發(fā)生，與活動(dòng)依賴性突觸可塑性有關(guān)，在學(xué)習(xí)與記憶過程中發(fā)揮重要作用[1]。外源性BDNF還可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的新生鼠海馬顆粒細(xì)胞（DGCs）的存活及分化。與體內(nèi)其他蛋白質(zhì)的合成和分泌一樣，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子由分子量為30-35kDa的前體物質(zhì)--腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體（precursor of brain derived neurotrophic factor， proBDNF）蛋白水解而來。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體是無活性的，但2001年，Lee等首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[1]。此后進(jìn)一步的研究表明，proBDNF可能有著與BDNF相反的功能，Teng等發(fā)現(xiàn)proBDNF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡。

1 方法

1.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

取新生0-1h的SD大鼠，在細(xì)胞培養(yǎng)間取出兩大腦半球，制成細(xì)胞懸液，靜置后取上層懸液，進(jìn)行計(jì)數(shù)后按照實(shí)驗(yàn)要求以1×105/mL密度接種于包被好的培養(yǎng)板或玻片上。37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及實(shí)驗(yàn)要求，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況。

1.2 分組

將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分為抗proBDNF羊血清處理組、羊血清對(duì)照組及正常未處理組。各組選取1d、3d、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察（給予干預(yù)組以加干預(yù)為0d計(jì)算）。

1.3 神經(jīng)元鑒定

選取3d的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，倒置相差顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算出神經(jīng)元純度：[NeuN陽性細(xì)胞數(shù)/著色細(xì)胞數(shù)（總細(xì)胞數(shù)）]×100%=神經(jīng)元陽性率（即神經(jīng)元純度）。

1.4 數(shù)據(jù)收集

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選取不同時(shí)間點(diǎn)、不同條件的細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察。用于免疫組化的細(xì)胞顯色后于鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示。組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析。凡P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)情況

普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，接種0h，大多數(shù)細(xì)胞呈圓球型懸浮于培養(yǎng)基中，折光性較好，單個(gè)散在分布。接種12～24h貼壁后，神經(jīng)元周圍長(zhǎng)出類似于偽足的包裹體，邊界不整齊；培養(yǎng)3d，包裹體周圍開始有一些向外生長(zhǎng)的突起，其中一個(gè)突起較其它突起迅速生長(zhǎng)延伸，發(fā)育成較長(zhǎng)的軸突，其余幾個(gè)短小的突起則形成樹突，神經(jīng)元之間逐漸形成網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)7d，軸突繼續(xù)延伸，樹突分支增多，神經(jīng)元軸突和樹突相互交叉、連接，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

2.2 處理組海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育情況

體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，當(dāng)1d組給予抗proBDNF與DMEM/F12以1：20比例稀釋濃度處理時(shí)，所選取的處理組培養(yǎng)1d、3d、7d的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、存活細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對(duì)照及正常對(duì)照組，且多突起神經(jīng)元明顯增多；濃度過高或過低都不利于神經(jīng)元的生長(zhǎng)。同時(shí)，當(dāng)神經(jīng)元形態(tài)穩(wěn)定后也就是7d時(shí)給予抗proBDNF血清處理，無突起神經(jīng)元出現(xiàn)空泡樣變化。生長(zhǎng)3d的神經(jīng)元給予抗proBDNF處理后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，生長(zhǎng)狀態(tài)影響不大，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

3.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元的體外原代培養(yǎng)

新生鼠與胎鼠相比，神經(jīng)元分化程度高，神經(jīng)突起發(fā)育成熟，神經(jīng)元之間以及與纖維組織之間的連接比較緊密。而且有研究表明，通過透射電鏡觀察出生1d的新生大鼠海馬，偶見神經(jīng)元突觸，且結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全、突觸連接部位很短、突觸小泡極少。因此為提高神經(jīng)元的純度以及存活率，我們參照原有的比較權(quán)威的培養(yǎng)方法，取出新生0～1h的SD大鼠海馬組織，在解剖顯微鏡下剔除腦膜，精確定位取材，以保證組織的純度。經(jīng)機(jī)械吹打10～20次，使組織分散成單細(xì)胞懸液。以1×105/mL密度種植于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，24h后全量換液。培養(yǎng)3d后，經(jīng)NeuN鑒定，神經(jīng)元的純度可以達(dá)到90%以上。

3.2 proBDNF對(duì)海馬神經(jīng)元發(fā)育的影響

眾多研究發(fā)現(xiàn)，在猴、大鼠的大部分腦區(qū)，如大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核、基底核、小腦、丘腦、孤束核、下丘腦、中腦、腦橋、延髓和脊髓有proBDNF表達(dá)。在胞內(nèi)，proBDNF經(jīng)一些酶修飾轉(zhuǎn)變?yōu)锽DNF，然后以BDNF的形式分泌到胞外。

同時(shí)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，出生后的幾周內(nèi)proBDNF表達(dá)水平逐漸上升，且在幼年小鼠體內(nèi)proBDNF的總量要大于BDNF。小鼠海馬區(qū)proBDNF水平呈動(dòng)態(tài)變化，在軸突投射和突觸形成過程中表達(dá)水平最高[3]。這一結(jié)果提示proBDNF在神經(jīng)元發(fā)育早期有可能高表達(dá)。proBDNF作為抑制因子在脊髓損傷后神經(jīng)再生過程中發(fā)揮作用。對(duì)于突觸可塑性影響的研究則提示proBDNF與BDNF對(duì)突觸可塑性具有雙向調(diào)節(jié)作用。

在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在摸索給予抗proBDNF血清濃度時(shí)，相同時(shí)間點(diǎn)、相同接種濃度，給予不同濃度抗proBDNF血清時(shí)神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)表現(xiàn)各不相同，既可以表現(xiàn)為促進(jìn)生長(zhǎng)，也可以表現(xiàn)為抑制生長(zhǎng)。從中我們選取了神經(jīng)元形態(tài)變化最為明顯的一組做實(shí)驗(yàn)分析。根據(jù)神經(jīng)元素生長(zhǎng)的五個(gè)階段，培養(yǎng)7d時(shí)，軸突繼續(xù)延伸，樹突分支增多，神經(jīng)元軸突和樹突相互交叉、連接，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。給予抗proBDNF血清處理后，7d時(shí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的較為密集，且突起分支較多。繼續(xù)培養(yǎng)到14d、20d時(shí)，正常對(duì)照組出現(xiàn)懸浮細(xì)胞，干預(yù)組中出現(xiàn)空泡樣細(xì)胞。7d后縮短換液間隔，空泡樣改變未見改善。其原因未明確，因此該論文中統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果所選取的時(shí)間點(diǎn)最長(zhǎng)為7d。

因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)所給予的是外源性的干預(yù)，無法排除內(nèi)源性proBDNF的影響，所以對(duì)于proBDNF對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的影響及作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法給予明確的解答。

4 結(jié)語

給予外源性抗proBDNF羊血清處理后，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好且突起數(shù)目增多，提示內(nèi)源性proBDNF抑制神經(jīng)元的發(fā)育，促進(jìn)凋亡，給予外源性抗體后，減弱其生物學(xué)作用，神經(jīng)元發(fā)育抑制因素減弱，存活細(xì)胞數(shù)、突起數(shù)增多。

在神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的晚期，因其發(fā)育已成熟，細(xì)胞處于凋亡期，內(nèi)源性proBDNF表達(dá)增多，當(dāng)給予相同濃度抗proBDNF羊血清處理時(shí)，無法中和內(nèi)源性proBDNF的促凋亡作用，所以在培養(yǎng)7d的神經(jīng)元基礎(chǔ)上給予抗proBDNF羊血清干預(yù)后，表現(xiàn)出空泡樣變化。

參考文獻(xiàn)

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