孟令寬，鐘小莉，潘瓊，葉鈞，尚楊楊，郭靖，汪榮泉

·臨床研究·

結(jié)腸癌組織miR-200c/141定量表達(dá)的臨床病理學(xué)意義

孟令寬，鐘小莉，潘瓊，葉鈞，尚楊楊，郭靖，汪榮泉

目的探討結(jié)腸癌組織miR-200c/141定量表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征之間的聯(lián)系。方法實(shí)時定量PCR檢測49例結(jié)腸癌患者癌組織和癌旁組織中的miR-200c/141的表達(dá)水平。分析miR-200c/141表達(dá)量、聯(lián)合miR-200c和miR-141表達(dá)量與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，以及miR-200c/141表達(dá)量在判斷患者術(shù)后1年預(yù)后中的意義。結(jié)果結(jié)腸癌組織中miR-200c/141表達(dá)水平較癌旁組織明顯降低(P=0.0002，P=0.0058)。miR-141表達(dá)量與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床Ⅲ-Ⅳ期患者結(jié)腸癌組織中miR-141的表達(dá)量明顯低于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床Ⅰ-Ⅱ期患者癌組織的表達(dá)量(P=0.035，P=0.042)。miR-200c/141表達(dá)量與腫瘤大小之間明顯相關(guān)(P<0.05)。miR-200c/141的表達(dá)量與患者術(shù)后1年的生存率無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)的miR-200c/141與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。

結(jié)腸腫瘤；病理學(xué)，臨床；微RNAs

結(jié)腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢，在西方發(fā)達(dá)國家，發(fā)病率居第二位[1]。近年來結(jié)腸癌的治療有較大進(jìn)展，但患者生存率的改善并不明顯[2]。選取有效腫瘤標(biāo)記物并根據(jù)結(jié)腸癌患者臨床預(yù)后進(jìn)行個體化治療，減少結(jié)腸癌病死率，提高生存率是該領(lǐng)域的前沿問題[3-4]。microRNAs(miRNAs)是高度保守的小分子非編碼RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能，可通過結(jié)合到靶基因所表達(dá)的mRNA的3'-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。miRNAs參與管理人類大約30%的基因，在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中至關(guān)重要[5]。很多腫瘤的發(fā)生過程都存在miRNAs的異常表達(dá)[6-7]，例如，結(jié)腸癌組織在miRNAs表達(dá)圖譜方面存在顯著改變，通過檢測大量相關(guān)的miRNAs的異?？梢詢?yōu)化結(jié)腸癌患者個性化治療方案并改善患者的臨床預(yù)后[8-10]。在腫瘤干細(xì)胞的干性維持及分化方面，miRNAs調(diào)節(jié)功能顯著，被認(rèn)為是癌基因或抑癌基因[11]，例如我們發(fā)現(xiàn)miR-200參與Ascl2介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)之間的可塑性調(diào)節(jié)[12-13]。文獻(xiàn)報道，miR-200c/141與EMT有關(guān)，miR-200c參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14-15]。本研究探討結(jié)腸癌組織中miR-200c/141定量表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，為miR-200c/141參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究收集的標(biāo)本為2014年4月－2015年4月第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化科內(nèi)鏡下活檢或普外科手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者(術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療等治療)的腫瘤組織和癌旁組織，癌旁組織為距腫瘤病灶3cm的結(jié)腸黏膜組織。所有患者在確診后均行結(jié)腸癌外科根治手術(shù)治療，具有完整的臨床病理資料，其中，男性29例，女性20例，年齡<65歲30例，年齡>65歲19例，其他臨床病理資料參見表1。結(jié)腸癌TNM分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)(第7版)。獲取的組織標(biāo)本立即放入液氮凍存，用于實(shí)時定量PCR檢測結(jié)腸癌組織及癌旁組織中miR-200c/141的表達(dá)水平。本研究獲得西南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲取標(biāo)本前經(jīng)患者知情同意。

1.2 實(shí)時定量PCR檢測miR-200c/141的表達(dá) 收集上述29例結(jié)腸癌及其癌旁組織內(nèi)鏡下活檢標(biāo)本，20例結(jié)腸癌及其癌旁組織手術(shù)切除標(biāo)本，采用實(shí)時定量PCR檢測miR-200c/141的相對表達(dá)量。miRNAs實(shí)時定量PCR所需引物、引物相應(yīng)序列、序列長度(bp)以及退火溫度(℃)如下。U6 RT引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，PCR上游引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，退火溫度60℃，長度89bp；hsa-miR-200c的RT引物序列為5'-TCGTATCCAGTGCGTGTCGTGAGTCGG CAATTGCACTGGATACGACTCCATC-3'，PCR上游引物為5'-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3'，下游引物為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，退火溫度60℃，長度65bp；hsa-miR-141的RT引物序列為5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAA TTGCACTGGATACGACCCATCT-3'，PCR上游引物為5'-GGGGTAACACTGTCTGGTAA-3'，下游引物為5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'，退火溫度60℃，長度63bp。結(jié)腸癌及其癌旁組織RNA的提取與質(zhì)量控制、cDNA的合成與擴(kuò)增嚴(yán)格按TaKaRa說明書進(jìn)行操作，并采用相對循環(huán)閾(Ct)的方法進(jìn)行評估[10]。miRNA的相對表達(dá)量以U6為內(nèi)參，按2–ΔΔCt公式進(jìn)行計算。

1.3 術(shù)后隨訪 所有患者術(shù)后隨訪1年。1年隨訪期內(nèi)對每位患者至少進(jìn)行5次隨訪，無失訪病例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間差異的比較采用單因素方差分析，采用直線相關(guān)分析結(jié)腸癌樣本中miR-200c/141的相關(guān)性，采用秩和檢驗(yàn)比較等級資料的差異性，患者總體生存率采用Kaplan-Meier和logrank進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌及其癌旁組織中miR-200c/miR-141的定量及相關(guān)性分析 結(jié)腸癌組織中miR-200c 和miR-141的相對表達(dá)量分別為1.4307±1.6828和1.1802±0.8218，癌旁組織中兩者的相對表達(dá)量分別為1.7939±1.4149和1.7614±1.5102。與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中miR-200c/141相對表達(dá)量顯著降低(圖1A、B，P=0.0002，P=0.0058)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-200c的表達(dá)量與miR-141的表達(dá)量呈正相關(guān)(圖2)，提示miR-200c 和miR-141作為一個染色體上連續(xù)排列的基因簇，在結(jié)腸癌組織中聯(lián)合表達(dá)。

圖1 實(shí)時定量PCR檢測miR-200c(A)和miR-141(B)在人結(jié)腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-200c (A) and miR-141 (B) in human colon cancer and peri-cancerous tissues (RT-PCR)N. Peri-cancerous mucosa; CA. Colon cancer

圖2 結(jié)腸癌組織中miR-200c與miR-141表達(dá)水平的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of expression levels of miR-200c and miR-141 in colon cancer tissues

2.2 miR-141表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 在結(jié)腸癌患者腫瘤組織中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的miR-141表達(dá)量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.9295±0.5860vs1.4230±0.9478，P=0.035)，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期組的miR-141表達(dá)量低于臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期組(0.9474±0.5806vs1.4228±0.9682，P=0.042)，但在年齡、性別、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等方面兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。直徑大于5cm的腫瘤組織miR-141表達(dá)量低于小于5cm的腫瘤組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。T3和T4期患者相對于T1和T2期患者，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者相對于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其結(jié)腸癌中miR-141的表達(dá)量均有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.3 miR-200c表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床病理學(xué)特征的聯(lián)系 不同臨床病理特征患者分組中，miR-200c表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。但是有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者與沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者相比，其miR-200c表達(dá)有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 miR-200c/141表達(dá)量與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 對比結(jié)腸癌組織中miR-200c高表達(dá)與低表達(dá)(相對表達(dá)量以1.0878為界限)，miR-141高表達(dá)與低表達(dá)(相對表達(dá)量以1.2228為界)的患者臨床病理特征差別。結(jié)果顯示，與miR-141高表達(dá)相比，miR-141低表達(dá)組的腫瘤直徑一般大于5cm且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示miR-141表達(dá)量與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)。但是與患者的年齡、性別、腫瘤分化、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期之間無關(guān)(表2)。與miR-200c高表達(dá)相比，miR-200c低表達(dá)的結(jié)腸癌患者其腫瘤直徑多數(shù)大于5cm且多為女性，但是與腫瘤分化、侵襲轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無相關(guān)性。

2.5 聯(lián)合miR-200c和miR-141表達(dá)定量與患者臨床病理學(xué)特征之間的聯(lián)系 根據(jù)miR-200c和miR-141表達(dá)量將所有患者劃分成3組，即miR-200c/141低表達(dá)組(miR-200c≤1.0878同時miR-141≤1.2228)；miR-200c/141高表達(dá)組(miR-200c>1.0878同時miR-141>1.2228)；miR-200c/141中等表達(dá)組(miR-200c/141其中之一低于臨界值)。對比3組患者的臨床病理學(xué)特征，結(jié)果表明miR-200c/141聯(lián)合定量表達(dá)與患者的腫瘤大小存在明顯關(guān)聯(lián)(P=0.021，表3)。

2.6 結(jié)腸癌組織中miR-200c/141表達(dá)量在判斷患者術(shù)后1年預(yù)后中的意義 根據(jù)患者結(jié)腸癌組織中miR-200c/141的表達(dá)水平將其分成高表達(dá)和低表達(dá)組，log-rank檢測和Kaplan-Meier曲線分析兩組患者總體生存率，結(jié)果顯示，miR-200c/141高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后1年的總體生存率無明顯差異(P=0.178，P=0.255，圖3)。

表1 不同臨床病理學(xué)特征患者腫瘤組織中miR-200c/141的表達(dá)量(±s)Tab.1 Expression of miR-200c/141 in the tumor tissues of patients with different pathological features (±s)

表1 不同臨床病理學(xué)特征患者腫瘤組織中miR-200c/141的表達(dá)量(±s)Tab.1 Expression of miR-200c/141 in the tumor tissues of patients with different pathological features (±s)

Variable n miR-200c miR-141 Pvalue Age (year) <65 30 1.3438±0.9796 1.2609±0.8525 0.654 ≥65 19 1.5679±2.4439 1.0527±0.7759 0.393 Tumor size (cm) <5 33 1.2912±0.8655 1.3204±0.9088 0.546 ≥5 16 1.7185±2.7078 0.8910±0.5164 0.086 Invasion depth T1+T2 7 1.8255±1.5529 1.8640±1.2157 0.508 T3+T4 42 1.3649±1.7121 1.0663±0.6937 0.137 Tumor differentiation Low 9 2.0023±3.6031 1.0213±0.9525 0.578 Medium-High 40 1.3021±0.8542 1.2160±0.7987 0.526 Distal metastasis Absent 44 1.5008±1.7581 1.2231±0.8362 0.392 Present 5 0.8135±0.4702 0.8026±0.6232 0.283 Metastasis of lymph node(s) Absent 25 1.2464±0.9490 1.4230±0.9478 0.440 Present 24 1.6227±2.2123 0.9295±0.5860 0.035 Clinical stage Ⅰ-Ⅱ 24 1.2498±0.9693 1.4228±0.9682 0.467 Ⅲ-Ⅳ 25 1.6043±2.1677 0.9474±0.5806 0.042

3 討 論

本研究首次觀察結(jié)腸癌組織中miR-200c/141的表達(dá)水平和患者的臨床病理特征以及術(shù)后短期生存率之間的聯(lián)系。本研究結(jié)果提示miR-200c/141在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，說明在正常結(jié)腸黏膜組織癌變過程中或癌細(xì)胞異型性維持過程中miR-200c/141是起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的，癌變的發(fā)生與維持降低了其表達(dá)量，而表達(dá)量的降低又削弱了其腫瘤抑制功能，進(jìn)而構(gòu)成腫瘤無限增殖的惡性循環(huán)。同時，本研究證實(shí)miR-200c/141的表達(dá)量與患者腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，這種相關(guān)性說明miR-200c/141的異常表達(dá)貫穿著腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)歸的全過程，與術(shù)后短期生存率可能不相關(guān)，這種不相關(guān)性可能受術(shù)后患者依從性差、隨訪時間短等因素影響。雖然結(jié)腸癌組織中miR-200c的表達(dá)情況并不能影響患者臨床病理特征，但是存在性別差異，男性患者miR-200c的表達(dá)量高(>1.0878)，女性患者miR-200c的表達(dá)量低(≤1.0878)，說明miR-200c在不同性別患者的結(jié)腸癌發(fā)生中所發(fā)揮的作用不同，在女性患者結(jié)腸癌的發(fā)生中可能更具主導(dǎo)地位。

表2 miR-200c/141表達(dá)量與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of miR-200c/141 and the clinic pathological features of patients

表3 聯(lián)合miR-200c和miR-141表達(dá)定量與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系Tab.3 Relationship between the clinic pathological features and the combined miR-200c and miR-141 expression levels

圖3 結(jié)腸癌患者術(shù)后1年的總體生存率Fig.3 Overall survival rate of colon cancer patients one year after surgery (Kaplan-Meier)A. According to miR-200c expression; B. According to miR-141 expression

關(guān)于結(jié)腸癌組織中miR-141定量的意義，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床晚期(Ⅲ-Ⅳ)的結(jié)腸癌患者，其miR-141表達(dá)量低，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床早期(Ⅰ-Ⅱ)的結(jié)腸癌患者其癌組織miR-141表達(dá)量高(P=0.035，P=0.042)，說明伴隨結(jié)腸癌臨床分期的進(jìn)展，miR-141在逐漸下降。我們進(jìn)一步分析miR-141表達(dá)量與患者臨床病理特征的相關(guān)性，當(dāng)結(jié)腸癌大于5cm且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，其miR-141低表達(dá)。對比結(jié)腸癌患者miR-200c/141的表達(dá)情況，當(dāng)腫瘤大于5cm時，miR-200c/141表達(dá)量有降低趨勢(P=0.021)。這些數(shù)據(jù)客觀反映了miR-200c/141與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小的相關(guān)性，其聯(lián)合定量檢測也許有助于結(jié)腸癌的診療和預(yù)防。

miRNAs是21～23nt的小非編碼RNA，大多可結(jié)合到mRNA的3'非編碼區(qū)域(3'-UTRs)管理其下游蛋白的表達(dá)[16]。近年來大量數(shù)據(jù)證實(shí)了miRNAs與腫瘤的相關(guān)性[17-19]。根據(jù)靶基因的不同，miRNA可抑制或促進(jìn)腫瘤形成。其中miR-200家族抑制腫瘤形成，包括miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c 和miR-141[20]。這些miRNAs可以維持結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮特征性[12]。通過作用于EMT抑制因子或轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2從而抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[21-22]。盡管在乳腺癌組織中miR-200表達(dá)情況不盡相同[23]，但是在結(jié)腸癌組織中miR-200的表達(dá)量是下降的[24]。另外，DNA甲基化是一種十分重要的表位修飾方式，調(diào)控miR-200c/141的轉(zhuǎn)錄激活[25]。一系列的轉(zhuǎn)錄因子都是通過調(diào)節(jié)miR-200家族來管理EMTMET[26-27]，我們以前證實(shí)miR-200可以由Ascl2進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，例如侵襲轉(zhuǎn)移能力[12]。miR-200c/141與胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)[13]，但是與結(jié)腸癌的相關(guān)性研究報道有限。在結(jié)腸癌患者血清中，miR-200c/141是提示預(yù)后及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)檢測標(biāo)記物。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在結(jié)腸癌EMT以及遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。也許miR-200c會成為結(jié)腸癌患者診斷的臨床標(biāo)記和治療的靶點(diǎn)。目前，我們的研究可能存在的不足是樣本量不多(n=49)，隨訪時間不長(術(shù)后1年)。因此，進(jìn)一步擴(kuò)大臨床病例樣本數(shù)和延長隨訪時間可能提供更加有價值的結(jié)論。

總之，在結(jié)腸癌發(fā)生中，miR-200c/141作為抑癌基因，其表達(dá)量與癌旁組織相比明顯下降，與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期密切相關(guān)，與患者的短期預(yù)后無關(guān)。

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Clinicopathological significance of quantitative expression of miR-200c /141 in colon carcinoma tissue

MENG Ling-kuan,ZHONG Xiao-li,PAN Qiong,YE Jun,SHANG Yang-yang,GUO Jing,WANG Rong-quan*
Institute of Gastroenterology,Southwest Hospital,Third Military Medical University of PLA,Chongqing 400038,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: rongquanw@hotmail.com

,E-mail: rongquanw@hotmail.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81372557)

ObjectiveTo explore the relationship between the miR-200c and miR-141 expression levels in the cancerous tissues of colon carcinoma and the clinicopathological features of the patients.MethodsThe quantitative real-time RT-PCR was used to determine the miR-200c and miR-141 expression levels in the cancerous tissues obtained from 49 colon carcinoma patients and their tissues adjacent to the cancer.ResultsCompared with the tissues adjacent to the cancer,the miR-200c and miR-141 expression levels in colon carcinoma samples were significantly reduced (P=0.0002 andP=0.0058). A negative correlation was found between miR-141 expression level and both the tumor size and the existence of lymph node metastasis in the colon carcinoma patients (P<0.05). The miR-141 expression levels in the cancerous tissues of colon carcinoma patients who had lymph node metastasis were significantly lower than those who did not have lymph node metastasis (P=0.035). At the same time,the miR-141 expression levels in the cancerous tissues of colon carcinoma patients who were at clinical Ⅲ-Ⅳ stages were significantly lower than in those who were at clinical Ⅰ-Ⅱ stages (P=0.042). There was a significant correlation between the miR-200c/141 expression levels and tumor size (P=0.021). However,no relationship was found between the miR-200c and miR-141 expression levels and the cumulative survival rate of patients one-year after surgical treatment (P>0.05).ConclusionThe down-regulation of miR-200c/141expression in colon carcinoma tissues is related to the tumor size,lymph node metastasis and clinical stages of colon carcinoma patients.

colonic neoplasms; pathology,clinical; microRNAs

R574.62

A

0577-7402(2015)12-0987-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.10

2015-07-03；

2015-08-13)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

國家自然科學(xué)基金(81372557)

孟令寬，碩士研究生。主要從事消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究

400038 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化內(nèi)科(孟令寬、鐘小莉、潘瓊、葉鈞、尚楊楊、郭靖、汪榮泉)

汪榮泉，E-mail: rongquanw@hotmail.com