文帥，胡曉紅，張小容，黃勇，賀偉峰，羅高興，吳軍

真核起始因子(eIF6)對(duì)M2型巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)表達(dá)的影響

文帥，胡曉紅，張小容，黃勇，賀偉峰，羅高興，吳軍

目的探討真核細(xì)胞起始因子(eIF6)基因?qū)2型巨噬細(xì)胞纖維化相關(guān)因子分泌及重要蛋白酶表達(dá)的影響。方法采用eIF6野生型(eIF6+/+)及敲降型(eIF6+/-)C57BL/6雄性小鼠，腹腔灌洗獲得巨噬細(xì)胞，通過白介素4(IL-4)誘導(dǎo)形成M2型巨噬細(xì)胞。應(yīng)用基因芯片比較eIF6+/+與eIF6+/-小鼠M2型巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，并通過RT-PCR及ELISA對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，與eIF6+/-小鼠組比，eIF6+/+小鼠M2型巨噬細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)基因表達(dá)顯著下調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)基因表達(dá)顯著上調(diào)。RT-PCR及ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2型巨噬細(xì)胞中VEGF、TIMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，而MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。結(jié)論eIF6可能通過抑制VEGF生成而防止血管及肉芽組織過度增生，同時(shí)通過調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的比例以平衡細(xì)胞外基質(zhì)的降解與沉積，從而緩解瘢痕形成。

真核細(xì)胞起始因子6；巨噬細(xì)胞；纖維化

瘢痕形成(纖維化)是傷口或創(chuàng)面自然愈合過程中的一種正常的、必然的生理反應(yīng)，但它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是臨床上急需解決的難題之一。在創(chuàng)面愈合及纖維化過程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要作用[1]。Lucas等[2]研究發(fā)現(xiàn)，清除巨噬細(xì)胞后創(chuàng)面肉芽組織顯著減少，再上皮化過程受阻，創(chuàng)面愈合延遲。Sindrilaru等[3]將創(chuàng)面巨噬細(xì)胞分離后進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞對(duì)創(chuàng)面局部不同的微環(huán)境刺激可產(chǎn)生不同的表型。巨噬細(xì)胞在整個(gè)創(chuàng)面愈合過程中均表達(dá)經(jīng)典激活(classic activation)型(M1型)和選擇性激活(alternative activation)型(M2型)表面標(biāo)記，其中在炎癥反應(yīng)早期主要是M1型，在修復(fù)期主要是M2型[4-5]。M2型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是一種促纖維化細(xì)胞，可分泌大量的細(xì)胞因子激活成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肉芽組織增生、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，進(jìn)而促進(jìn)瘢痕形成[6]。

真核細(xì)胞起始因子6(eukaryotic initiation factor-6，eIF6)可對(duì)真核生物的翻譯起始階段進(jìn)行調(diào)控。在細(xì)胞核內(nèi)，eIF6與核糖體60s亞基結(jié)合，抑制核糖體80s亞基形成[7]。蛋白翻譯起始階段，作為真核起始因子的eIF6在CK1-PKC作用下發(fā)生磷酸化，從核糖體60s亞基解聚下來，促進(jìn)40s亞基和60s亞基結(jié)合形成80s亞基，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯[8]。實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)比較了eIF6+/+與eIF6+/-小鼠創(chuàng)面愈合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF6+/-小鼠創(chuàng)面肉芽組織、膠原明顯增多，提示eIF6對(duì)皮膚纖維化具有抑制作用(結(jié)果尚未發(fā)表)。但eIF6通過何種機(jī)制對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生作用，進(jìn)而影響創(chuàng)面愈合及瘢痕形成目前尚未見報(bào)道。本研究通過基因芯片技術(shù)對(duì)eIF6+/+與eIF6+/-小鼠M2型巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，尋找相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 eIF6野生型(eIF6+/+)及敲降型(eIF6+/-)C57BL/6雄性小鼠(8～10周齡，體重15～20g)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，小鼠重組白介素4(IL-4)購(gòu)于R&D公司，anti-F4/80-Percp、anti-CD11b-FITC、anti-Cd11c-PE、anti-CD206 (MR)-FITC、anti-CD16/32購(gòu)于三箭公司，RNeasy Mini kit購(gòu)于Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒AMV3.0購(gòu)于大連TaKaRa公司，基因芯片(Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array)購(gòu)于Affymetrix公司，檢測(cè)由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠引頸處死，75%乙醇消毒后打開腹腔，用10ml預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)基反復(fù)灌洗腹腔。收集灌洗液于無(wú)菌離心管中(置冰上)，4℃下1000r/min離心10min獲得細(xì)胞沉淀，用2ml RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸，接種于6孔板中，每孔5×106個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，洗去未貼壁細(xì)胞，獲得的貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞[9]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示F4/80、CD11b雙陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)94%(圖1f)。刺激組加入IL-4(40ng/ml)刺激24h，獲得M2型巨噬細(xì)胞，未刺激組加等量PBS，余培養(yǎng)條件一致。

1.2.2 巨噬細(xì)胞純度檢測(cè) 將培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞用0.5%胰酶消化計(jì)數(shù)，5×105個(gè)/管，PBS洗1次，100μl PBS重懸，加入1μl anti-CD16/32孵育10min，阻斷Fc受體，再加入1μl anti-F4/80-Percp和1μl anti-CD11b-FITC室溫孵育30min，1ml PBS洗去游離抗體后，用0.3ml PBS重懸，Attune流式細(xì)胞儀(ABI公司)檢測(cè)細(xì)胞表面F4/80、CD11b的表達(dá)。

1.2.3 M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè) 將刺激后的巨噬細(xì)胞用0.5%胰酶消化計(jì)數(shù)，5×105個(gè)/管，PBS洗1次，100μl PBS重懸，加入1μl anti-CD16/32 孵育10min，阻斷Fc受體，再加入anti-F4/80-Percp、anti-CD11c-PE、anti-CD206(MR)-FITC各1μl室溫孵育30min，1ml PBS洗去游離抗體后，用0.3ml PBS重懸，Attune流式細(xì)胞儀(ABI公司)檢測(cè)細(xì)胞表面F4/80、CD11c、CD206的表達(dá)。

1.2.4 基因芯片檢測(cè) 分別取來自eIF6+/+與eIF6+/-小鼠的M2巨噬細(xì)胞，抽提RNA，行基因芯片檢測(cè)，重復(fù)3次。具體信息見http://www.affymetrix. com。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè) 應(yīng)用RNeasy Mini kit試劑盒提取巨噬細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、精氨酸酶1(arginase-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。引物由上海生工生物有限公司合成，序列如下：GAPDH正義3'-GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5'，反義3'-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-5'；TGF-β1正義3'-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-5'，反義3'-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-5'；精氨酸酶1正義3'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-5'，反義3'-GGAGCTGTCATTAGGGACATCA-5'；MMP-2正義3'-ACCTGAACACTTTCTATGGCTG-5'，反義3'-CTTCCGCATGGTCTCGATG-5'；TIMP-2正義3'-GCAACCCCATCAAGAGGATTC-5'，反義3'-GGGGCCGTGTAGATAAACTCG-5'；VEGF正義3'-GCCAGACAGGGTTGCCATAC-5'，反義3'-GGAGTGGGATGGATGATGTCAG-5'。以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果以2-ΔΔCt法表示。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6 ELISA檢測(cè) 收集IL-4刺激24h后的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用VEGF、MMP-2、TIMP-2、ELISA試劑盒(武漢博士德公司)檢測(cè)VEGF、MMP-2、TIMP-2的表達(dá)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 M2型巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)及純度檢測(cè) 巨噬細(xì)胞經(jīng)IL-4刺激24h后，其形態(tài)發(fā)生明顯改變，樹枝狀分支減少，細(xì)胞逐漸變圓，且折光性下降。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未刺激組比較，IL-4刺激組CD206表達(dá)明顯增強(qiáng)，而CD11c表達(dá)無(wú)明顯改變(圖1G、H)。所獲M2巨噬細(xì)胞純度為72.9%(圖1E)。

圖1 巨噬細(xì)胞純度及M2表面標(biāo)志物檢測(cè)情況Fig. 1 Purity of macrophage and expression of M2 macrophage surface markers

2.2 M2型巨噬細(xì)胞功能檢測(cè) 在體外培養(yǎng)條件下，參照經(jīng)典方法以IL-4刺激巨噬細(xì)胞24h誘導(dǎo)形成M2型巨噬細(xì)胞[10]。RT-PCR檢測(cè)顯示，經(jīng)IL-4刺激后，eIF6+/+與eIF6+/-小鼠巨噬細(xì)胞精氨酸酶1、TGF-β1的表達(dá)均明顯上升(P<0.05，圖2)。

2.3 基因芯片檢測(cè) 通過基因芯片對(duì)eIF6+/+及eIF6+/-小鼠的M2巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，最終篩選出1716個(gè)差異表達(dá)基因，其中與eIF6+/+小鼠比較，在eIF6+/-小鼠M2巨噬細(xì)胞中下調(diào)的基因有851個(gè)，上調(diào)的基因有865個(gè)(圖3)。與eIF6+/-相比，eIF6野生型小鼠M2巨噬細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因VEGF顯著下調(diào)(eIF6+/+/eIF6+/-=0.75，P<0.05)、MMP-2顯著上調(diào)(eIF6+/+/eIF6+/-=1.3，P<0.05)、TIMP-2顯著下調(diào)(eIF6+/+/eIF6+/-=0.65，P<0.05)，其他與創(chuàng)面愈合及纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、TGF-β1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生因子(PDGF)等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

2.4 RT-PCR驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2巨噬細(xì)胞中VEGF、TIMP-2表達(dá)下降(P<0.05)，MMP-2表達(dá)上升(P<0.05)，與基因芯片結(jié)果吻合(圖4)，而EGF、TGF-β1、FGF、PDGF等兩組之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

圖2 M2巨噬細(xì)胞中精氨酸酶1、TGF-β1的表達(dá)(RT-PCR)Fig. 2 Expression of arginase-1 and TGF-β1in M2 macrophages (RT-PCR)

圖3 芯片檢測(cè)色碼圖Fig. 3 The cluster of gene chip

圖4 M2巨噬細(xì)胞中TIMP-2、MMP-2和VEGF mRNA(RT-PCR)及蛋白(ELISA)的表達(dá)Fig. 4 Expression of TIMP-2, MMP-2 and VEGF mRNA (RT-PCR) and protein (ELISA) in M2 macrophages

2.5 ELISA驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果 分別收集eIF6+/+與eIF6+/-M2巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2巨噬細(xì)胞中VEGF、TIMP-2表達(dá)明顯下降(P<0.05)，MMP-2表達(dá)明顯上升(P<0.05，圖4)，與基因芯片結(jié)果吻合。

3 討 論

eIF6是一種具有抑制纖維化作用的基因，但其作用機(jī)制尚不明確，而巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面愈合及纖維化過程中具有重要作用，為此本研究觀察了eIF6對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，旨在探討其影響纖維化過程的具體機(jī)制。

巨噬細(xì)胞作為一種具有可塑性的多功能細(xì)胞群體，可分泌大量細(xì)胞因子激活成纖維細(xì)胞，同時(shí)能調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡，參與ECM的代謝[11]。在體外培養(yǎng)條件下，采用Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-13)可誘導(dǎo)產(chǎn)生M2型巨噬細(xì)胞[5-6]。細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的差異是鑒定不同類型巨噬細(xì)胞的重要方法。文獻(xiàn)報(bào)道F4/80+CD11c–CD206+的巨噬細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞[12-13]。M2巨噬細(xì)胞能表達(dá)精氨酸酶1，參與精氨酸酶代謝，介導(dǎo)其損傷修復(fù)功能，另外還能分泌抗炎因子(IL-10、TGF-β1等)[14]。本實(shí)驗(yàn)通過分離腹腔巨噬細(xì)胞，加入IL-4(40ng/ml)刺激24h獲得M2型巨噬細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及RT-PCR對(duì)其標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD206、精氨酸酶1、TGF-β1的表達(dá)與創(chuàng)面中M2型巨噬細(xì)胞一致[5]。

肉芽組織主要由成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、新生血管、ECM等組成[15]，在創(chuàng)面愈合前期可填補(bǔ)創(chuàng)面缺損并促進(jìn)創(chuàng)面愈合，最終轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織，因此肉芽組織的多少?zèng)Q定了后期瘢痕的嚴(yán)重程度[16]。血管生成對(duì)肉芽組織的形成具有重要作用[17]。VEGF的一個(gè)重要功能就是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，加快創(chuàng)面中血管的形成[18-19]，而巨噬細(xì)胞能夠分泌VEGF，啟動(dòng)血管生成[20]。研究顯示，在增生性瘢痕中有大量微血管形成，同時(shí)VEGF的表達(dá)也明顯上升[21]。另外有研究發(fā)現(xiàn)抑制VEGF能通過PI3K-Akt信號(hào)通路阻斷TGF-β1產(chǎn)生，從而抑制肺纖維化的形成[22]。上述研究表明VEGF在瘢痕形成及纖維化過程發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與eIF6+/-小鼠比較，eIF6+/+小鼠M2型巨噬細(xì)胞中VEGF的表達(dá)明顯下降，表明eIF6能抑制巨噬細(xì)胞中VEGF的產(chǎn)生，從而減少血管生成，影響瘢痕組織的形成。

瘢痕的另一個(gè)重要特征就是大量ECM沉積，ECM的代謝受基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的調(diào)節(jié)。MMPs是一類能夠降解ECM的蛋白質(zhì)，其中MMP-2又稱明膠酶，是MMPs家族成員之一，在ECM重塑中具有重要作用[23]，能水解Ⅰ/Ⅳ/Ⅴ型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白等ECM成分[24-25]。TIMPs為MMPs的特異性抑制因子，能與MMPs的鋅離子活性中心結(jié)合，形成MMP-TIMP復(fù)合物，從而阻斷MMP與底物結(jié)合，MMPs與TIMPs間的平衡是影響組織修復(fù)、新生表皮細(xì)胞爬行的重要影響因素。本研究觀察了MMP-2與TIMP-2之間的比例，結(jié)果顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2巨噬細(xì)胞中MMP-2表達(dá)上升而TIMP-2表達(dá)下降，提示eIF6能調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2之間的平衡，加快ECM的代謝，減少ECM沉積，減輕纖維化程度。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，eIF6能抑制VEGF產(chǎn)生，防止血管及肉芽組織過度增生，同時(shí)調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡，促進(jìn)ECM降解，減少ECM沉積，減輕纖維化(瘢痕)程度。eIF6作為一種新發(fā)現(xiàn)的抑纖維化基因，對(duì)其功能進(jìn)行研究可能為減輕瘢痕形成及纖維化提供新的途徑。

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Effects of eIF6 on the expression of pro-inflammatory mediators derived from M2 macrophages

WEN Shuai, HU Xiao-hong, ZHANG Xiao-rong, HUANG Yong, HE Wei-feng, LUO Gao-xing, WU Jun*
Institute of Burn Research, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China

*Corresponding author, E-mail: junwupro@126.com

This work was supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2012AA020504), and the National Natural Science Foundation of China (81372082)

ObjectiveTo explore the effects of eukaryotic translation initiation factor 6 (eIF6) on the expression of fibrotic cytokines and metabolic enzymes derived from M2 macrophages.MethodseIF6 wild type mice (eIF6+/+) and eIF6 knock out mice (eIF6+/-) were used. Macrophages were collected from peritoneal lavage fluid, and they were stimulated with IL-4 for enrichment of M2 macrophages. The differential gene expressions of eIF6+/+and eIF6+/-M2 macrophages were studied with gene chip. The differential expression of genes was further confirmed with both RT-PCR and ELISA.ResultsThe gene chip showed that the expressions of VEGF and TIMP-2 were down-regulated in eIF6+/+macrophages compared with those in eIF6+/-M2 macrophages, while the expression of MMP-2 was up-regulated in eIF6+/+M2 macrophages (P<0.05). The result of RT-PCR and ELISA had confirmed that the RNA and protein expressions of VEGF and TIMP-2 were decreased in eIF6+/+macrophages compared with those in eIF6+/-M2 macrophages, while the RNA and protein expressions of MMP-2 were up-regulated in eIF6+/+M2 macrophages (P<0.05).ConclusioneIF6 not only inhibits the expression of VEGF, reduces angiogenesis and granulation tissue formation, but also enhances the extracellular matrix degradation and deposition by regulating the balance of MMP2/TIMP2, and thus attenuating the degree of fibrosis (scar formation).

eukaryotic initiation factor-6; macrophages; fibrosis

R644

A

0577-7402(2015)02-0104-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.02.04

2014-11-05；

2015-01-18)

(責(zé)任編輯：胡全兵)

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(8 6 3計(jì)劃)項(xiàng)目(2012AA020504)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81372082)

文帥，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事燒傷創(chuàng)面愈合與瘢痕方面的研究

400038 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所(文帥、胡曉紅、張小容、黃勇、賀偉峰、羅高興、吳軍)

吳軍，E-mail：junwupro@126.com