陳光朋，付萬壘，楊坤富，孫建國，朱海振，江飛龍，彭麗娜，陳正堂

miR-182調(diào)控RECK信號通路在非小細胞肺癌進展中的作用

陳光朋，付萬壘，楊坤富，孫建國，朱海振，江飛龍，彭麗娜，陳正堂

目的 探討miR-182在非小細胞肺癌(NSCLC)發(fā)展中的作用及其相關(guān)機制。方法 采用實時定量PCR檢測NSCLC細胞系以及30組配對的NSCLC患者癌組織和癌旁組織樣本中miR-182的表達水平。在NSCLC細胞株A549和H1299中過表達miR-182后，測定細胞增殖活性及侵襲轉(zhuǎn)移能力。利用熒光素酶活性實驗鑒定miR-182的預(yù)測靶基因(RECK)。采用qRT-PCR和Western blotting分別檢測轉(zhuǎn)染miR-182類似物和miR-182抑制物后RECK mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果 miR-182在NSCLC細胞系和癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者癌組織中的表達水平明顯高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。過表達miR-182可增強NSCLC細胞株A549 和H1299的增殖、侵襲和遷移能力。雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，RECK的翻譯水平受miR-182直接調(diào)控。qRT-PCR和Western blotting 檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-182類似物后，RECK表達水平降低，轉(zhuǎn)染miR-182抑制物后，RECK表達水平升高。結(jié)論 miR-182可調(diào)控RECK的表達，促進NSCLC的進展。

癌，非小細胞肺；微RNAs；基因，RECK

非小細胞肺癌(NSCLC)包括腺癌和鱗癌。在世界范圍內(nèi)，肺癌為惡性腫瘤死亡的首要原因，而NSCLC占所有確診肺癌的80%～85%[1]。盡管肺癌的臨床診斷和治療技術(shù)不斷發(fā)展[2-5]，但確診為NSCLC患者的5年總生存率(約11%)在過去10年中并未得到實質(zhì)性提高[6]。因此，深入理解NSCLC發(fā)生發(fā)展的機制，對NSCLC的診斷和治療具有重要的臨床意義。

MicroRNAs (miRNAs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼RNA分子，長20～25個核苷酸，通過與靶mRNAs 3'非翻譯區(qū)互補結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控作用[7]。miRNAs在發(fā)育、分化、細胞增殖及凋亡、代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]。研究表明，miRNAs 作為一類新的癌基因或抑癌基因，其表達失衡與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如乳腺癌[9]、肝癌[10]、結(jié)腸癌[11]、肺癌等[12]。近年來，miRNAs與NSCLC的關(guān)系越來越受關(guān)注，已證實miR-128[13]、miR-195[14]、miR-483[15]、miR-451[16]、miR-630[17]等參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-182在NSCLC中的表達顯著上調(diào)[18]，提示其作為一種OncomiR可能參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展，但其具體分子生物學(xué)機制尚未闡明。

本研究旨在明確miR-182在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中表達的差異，探討過表達miR-182能否促進NSCLC細胞系的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并通過生物信息學(xué)預(yù)測和靶基因鑒定實驗，探討miR-182 在NSCLC中與抑癌基因RECK表達的相關(guān)性及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象及材料 選擇2014年度在第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院接受NSCLC切除手術(shù)的30例患者，年齡50～70歲，均經(jīng)病理診斷確認，其臨床資料見表1。在病理醫(yī)師的指導(dǎo)下，切除適量NSCLC組織以及鄰近的癌旁正常肺組織(距離癌組織5cm以上)。手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本立即置于液氮中冷凍保存?；颊呔炇鹬橥鈺?。本實驗已通過第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。人胚腎細胞HEK293，人NSCLC細胞系A(chǔ)549、H1299、PC9、NCI-H460以及人胎兒肺成纖維細胞系MCR-5均購自中國上海細胞研究所。miR-182對照質(zhì)粒(miR-NC)、miR-182類似物(miR-182 mimics)和miR-182抑制物(miR-182 inhibitor)購自廣州銳博生物技術(shù)公司。HEK293和MCR-5細胞用含10%胎牛血清的DMEM/H(Hyclone)培養(yǎng)基培養(yǎng)，A549、H1299、PC9和NCI-H460細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640(Hyclone)培養(yǎng)基，均在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

表1 30例NSCLC患者的臨床資料Tab.1 Clinical data of 30 patients with NSCLC

1.2 miR-182在NSCLC細胞系及組織中的表達檢測及其與NSCLC臨床病理轉(zhuǎn)移的關(guān)系 首先通過在線數(shù)據(jù)庫(http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/)分析篩選目的基因為miR-182，并進一步在肺癌細胞系和肺癌患者的肺癌組織中進行驗證。取NSCLC細胞系(A549、H1299、PC9、NCI-H460)和人胎兒肺成纖維細胞系(MCR-5)，行RNA提取，定量PCR檢測miR-182的表達水平。進一步檢測30例NSCLC患者癌組織及癌旁正常組織miR-182的表達水平，并結(jié)合患者的臨床資料(表1)對有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-182的表達水平進行比較。

1.3 miR-182的過表達及鑒定 在NSCLC細胞系A(chǔ)549、H1299細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-NC(陰性對照)和miR-182類似物，采用qRT-PCR檢測miR-182 mRNA的表達水平。

1.4 miR-182過表達對NSCLC細胞系增殖、侵襲、遷移的影響 在NSCLC細胞系A(chǔ)549、H1299細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-182類似物，于轉(zhuǎn)染后24、48、72h檢測細胞的增殖活性[采用CCK-8試劑盒檢測570nm波長處吸光度(A570)值]。采用Transwell方法ECM550系列和ECM220系列分別檢測穿過細胞濾膜的細胞數(shù)以反映細胞的侵襲、遷移能力的變化。

1.5 miR-182靶基因RECK的鑒定 采用生物信息學(xué)軟件(Targetscan)預(yù)測miR-182對應(yīng)的靶基因，同時構(gòu)建其3'UTR以及突變3'UTR的熒光報告載體，轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行鑒定。

1.6 miR-182過表達對RECK表達的調(diào)控作用 在A549、H1299細胞中轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-182類似物和miR-182抑制物，采用qRT-PCR法和Western blotting法分別檢測RECK及 RECK下游靶基因MMP9 mRNA和蛋白的表達變化。

1.7 實驗技術(shù)

1.7.1 總RNA提取 從液氮中取出NSCLC癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，置于DEPC處理過的預(yù)冷的勻漿器中，以100mg/ml比例加入Trizol試劑(Life Technology公司)勻漿，按Trizol試劑操作說明提取組織總RNA，溶于25μl DEPC中，分裝凍存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 參照TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit操作說明，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需試劑、miR-182 RT primer(廣州銳博公司)和總RNA進行反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 15min，85℃ 5s。以合成的cDNA作為模板進行qRT-PCR擴增，根據(jù)Premix ExTaq試劑盒說明加入premix、miR-182正向引物和miR-182反向引物進行反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 1min；95℃ 5s，58℃ 5s，72℃ 20s，共47個循環(huán)；72℃20s，采集熒光。采用20μl反應(yīng)體系，以U6作為內(nèi)參照。采用2–ΔΔCt法對目的基因在癌組織及癌旁組織中的表達量進行相對定量分析。

1.7.3 RECK 3'UTR熒光報告載體的構(gòu)建及熒光素酶活性檢測 首先合成野生型RECK-3'UTR以及突變的RECK 3'UTR(上海生工)寡核苷酸，經(jīng)退火、雙酶切后插入熒光素酶報告基因載體pMIRREPORT。接種HEK293細胞于96孔板，24h后細胞貼壁達50%時進行轉(zhuǎn)染。

將miR-182類似物及陰性對照miR-NC與構(gòu)建好的RECK 3'UTR熒光素酶報告基因及質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，按脂質(zhì)體2000說明進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)處理并裂解細胞，用GloMax20/20 Luminometer檢測熒光強度。

1.7.4 Western blotting檢測方法 用細胞裂解緩沖液裂解細胞，12 000r/min離心15min，收集上清并進行蛋白濃度測定(BCA法)。取20μg蛋白經(jīng)10%SDSPAGE膠分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，根據(jù)marker標(biāo)示切下RECK、MMP-9和GAPDH條帶區(qū)域，5%脫脂奶粉封閉，分別用抗-RECK(1:500稀釋)、抗-MMP9(1:500稀釋)及抗-GAPDH(1:5000稀釋)的一抗孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育1h，用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate Reagent處理并曝光顯色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，以±s表示，兩組方差齊，采用配對t檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌患者miR-182表達情況 在線數(shù)據(jù)庫(http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/)顯示miR-182 在NSCLC肺癌組織中的表達高于正常肺組織(圖1A、B)。在細胞系中的驗證結(jié)果顯示：miR-182在A549、H1299、PC9和NCI-H460四種肺癌細胞系中的表達明顯高于胎兒肺成纖維細胞系MCR-5(圖1C)。在30例患者的肺癌組織及癌旁組織中的驗證結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-182的表達高于對應(yīng)的癌旁組織(P=0.0008，圖1D)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(n=17)癌組織中miR-182的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(n=13，P=0.003 24，圖1E)。

2.2 miR-182過表達的鑒定結(jié)果 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比(A549 1.013，H1299 1.024)，轉(zhuǎn)染miR-182類似物(A549 1.893，H1299 2.033)能明顯提高miR-182 mRNA在A549和H1299細胞中的表達。

2.3 miR-182過表達對NSCLC細胞系增殖、侵襲和遷移能力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-182后，A549和H1299細胞的A570值在48和72h時間點均明顯高于轉(zhuǎn)染miR-NC的細胞(A549：P=0.038，P=0.007；H1299：P=0.042，P=0.008；圖2A、B)。細胞侵襲和遷移實驗顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC的細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-182的細胞侵襲和遷移到Transwell小室的數(shù)目明顯增多(圖2C、D)。

2.4 miR-182靶基因RECK的鑒定 Targetscan軟件預(yù)測miR-182對應(yīng)的靶基因為RECK，構(gòu)建其3'UTR以及突變3'UTR的熒光報告載體(圖3A)。將構(gòu)建的載體miR-NC(對照)、miR-182、RECK 3'UTR-WT 和RECK 3'UTR-mutant分別轉(zhuǎn)染HE293細胞，熒光素酶活性實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-182和RECK 3'UTR-WT 組的熒光強度明顯低于共轉(zhuǎn)染miR-NC 和RECK 3'UTR-WT組(P<0.05)，表明miR-182對pMIR-RECK 3'UTR表達有抑制作用，且是通過miR-182與pMIR-RECK 3'UTR區(qū)結(jié)合實現(xiàn)的，提示RECK 是miR-182的靶基因(圖3B)。

2.5 miR-182對RECK表達的抑制作用 qRT-PCR結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-182類似物組RECK mRNA表達水平明顯降低(P<0.01，圖4A)，miR-182抑制物組RECK mRNA表達水平明顯升高(P<0.01，圖4A)；Western blotting結(jié)果顯示，RECK蛋白的表達也呈現(xiàn)同樣的趨勢(圖4B)。此外，與miR-NC組相比，MMP-9水平在miR-182類似物轉(zhuǎn)染組明顯升高，在miR-182抑制物轉(zhuǎn)染組明顯降低(圖4B)。

3 討 論

圖1 miR-182在NSCLC細胞系及組織中的表達水平比較Fig.1 Comparison of miR-182 expression in NSCLC cells and tissues

圖2 過表達miR-182對NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響Fig.2 Enhancement of proliferation, invasion and migration of NSCLC cell lines by over-expression of miR-182

本研究檢測了NSCLC細胞系以及30例NSCLC患者的肺癌組織和癌旁正常組織中miR-182的表達水平，結(jié)果顯示miR-182在NSCLC細胞系中的表達水平明顯高于胎兒肺成纖維細胞系MCR-5，同時其在NSCLC患者肺癌組織的表達水平明顯高于其對應(yīng)的癌旁正常組織，更重要的是在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中miR-182的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。體外實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)miR-182的過表達能顯著增強NSCLC細胞系的增殖、侵襲及遷移能力。本研究進一步利用生物信息學(xué)預(yù)測miR-182的靶基因為RECK，并通過熒光素酶活性實驗證實miR-182可直接靶向調(diào)節(jié)RECK 3'UTR區(qū)，轉(zhuǎn)染miR-182類似物能明顯抑制A549細胞中RECK mRNA和蛋白表達。因此，本研究證實了RECK是miR-182的靶基因，為NSCLC發(fā)生發(fā)展機制研究提供了新的線索。

圖3 miR-182靶基因RECK的鑒定Fig. 3 Identification of RECK as one of miR-182 targeted genes

圖4 qRT-PCR 和Western blotting檢測RECK mRNA和蛋白的表達情況Fig.4 Expressions of RECK mRNA and protein determined by qRT-PCR and Western blotting

越來越多的研究報道m(xù)iR-182與多種腫瘤發(fā)展進程相關(guān)，包括乳腺癌[19]、胃癌[20]、結(jié)直腸癌[21]、腎癌[22]、前列腺癌[23]、卵巢癌等[24]。既往報道，在乳腺癌中miR-182能通過抑制MIM基因的表達而激活RhoA，促進乳腺癌轉(zhuǎn)移[25]。然而miR-182在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制并不清楚。本研究結(jié)果顯示miR-182在NSCLC患者癌組織中的表達水平明顯高于對應(yīng)的癌旁正常組織，更重要的是過表達miR-182能明顯促進NSCLC細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，提示miR-182可促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展。因此，降低miR-182的表達可能抑制NSCLC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

RECK蛋白是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的一種重要的抑制劑[26]，既往研究表明RECK在NSCLC癌組織中的表達水平明顯低于其對應(yīng)的癌旁正常組織[27]。MMPs在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，已有文獻報道MMP-9在NSCLC的組織和血清中顯著升高，并與腫瘤的分級和不良預(yù)后相關(guān)[28]。這些研究表明RECK-MMP-9信號通路在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本研究利用熒光素酶活性實驗確認了RECK是miR-182的靶基因，并明確了miR-182和RECK的調(diào)控關(guān)系，為闡明NSCLC的發(fā)生機制提供了新的線索。

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Effect of miR-182 in non small cell lung cancer via regulating the RECK signaling pathway

CHEN Guang-peng1, FU Wan-lei2, YANG Kun-fu3, SUN Jian-guo1, ZHU Hai-zhen4, JIANG Fei-long1, PENG Li-na1, CHEN Zheng-tang1*1Institute of Cancer,2Department of Pathology,3Department of Thoracic Surgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China
4Department of Oncology, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang 550002, China
*

, E-mail: czt05@163.com
This work was supported by the Key Project of Science and Technology Committee of Chongqing (CSTC2011AB5032)

ObjectiveTo explore the effect of miR-182 in non small cell lung cancer (NSCLC) and its mechanism.MethodsThe expression level and difference of miR-182 were detected by qRT-PCR in NSCLC cell line and matched tissues of 30 patients suffering from NSCLC. Cell proliferation, invasion and metastasis of A549 and H1299 via miR-182 was detected by miR-182 mimics. The predicted target gene (RECK) of miR-182 was identified via luciferase activation assay. The mRNA or protein expression of RECK after miR-182 mimic or inhibitor transfection was detected by qRT-PCR or Western blotting, respectively.ResultsExpression of miR-182 was significantly increased in NSCLC tissues and cell lines compared with that in the adjacent tissues (P<0.01), and it was correlated with the metastasis of NSCLC. The cell proliferation, invasion, and migration capacity was increased after miR-182 mimics transfection. Dual luciferase assay showed that miR-182 directly regulated the RECK translation level. RECK expression level was decreased after miR-182 mimics transfection in the A549 cells, while increased after miR-182 inhibitor transfection.ConclusionmiR-182 promoted tumor growth and metastasis of NSCLC by down-regulating the RECK expression.

carcinoma, non-small-cell lung; microRNAs; genes, RECK

R730.26

A

0577-7402(2015)04-0309-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.04.11

2014-12-21；

2015-03-20)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

重慶市科委重點攻關(guān)課題(CSTC2011AB5032)

陳光朋，碩士研究生。主要從事肺癌發(fā)病機制及臨床治療方面的研究

400037 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腫瘤研究所(陳光朋、孫建國、江飛龍、彭麗娜、陳正堂)，病理科(付萬壘)，胸外科(楊坤富)；550002 貴陽 貴州省人民醫(yī)院腫瘤科(朱海振)

陳正堂，E-mail：czt05@163.com