李 政, 顧貴洲, 趙朝成, 趙東風(fēng), 楊 磊

(1. 遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部, 遼寧 撫順 113001; 2. 中國(guó)石油大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 山東 青島 266555)

高相對(duì)分子質(zhì)量多環(huán)芳烴的生物共代謝降解

李 政1, 顧貴洲1, 趙朝成2, 趙東風(fēng)2, 楊 磊1

(1. 遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部, 遼寧 撫順 113001; 2. 中國(guó)石油大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 山東 青島 266555)

為了研究高相對(duì)分子質(zhì)量多環(huán)芳烴(PAHs)芘的生物共代謝降解，考察了低相對(duì)分子質(zhì)量PAHs芴和菲的加入對(duì)芘產(chǎn)生的影響，并采用GC-MS測(cè)定了生物降解后代謝產(chǎn)物的組成。結(jié)果表明，單一PAHs的生物降解中，芴在培養(yǎng)的第5 d已被完全降解，生成5種代謝產(chǎn)物，菲在第7 d降解率達(dá)到98.93%，生成10種代謝產(chǎn)物，芘在第9 d時(shí)降解率僅為65.73%，生成較多代謝產(chǎn)物，其中6種可基本定性； 3種PAHs混合降解時(shí)，芴、菲和芘分別在第3 d、5 d和8 d完全被除去，共產(chǎn)生8種代謝產(chǎn)物，其中芘在第8 d時(shí)只產(chǎn)生了3種代謝產(chǎn)物。芴和菲的存在不僅促進(jìn)了芘的完全快速降解，而且能夠促進(jìn)芘代謝產(chǎn)物的去除，芘的存在也促進(jìn)了芴和菲的降解和代謝產(chǎn)物的去除。

多環(huán)芳烴；共代謝；生物降解

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由2個(gè)或2個(gè)以上芳香環(huán)稠合在一起的一類化合物[1]，主要來源于石油污染、油輪泄漏、汽車尾氣，以及煤、石油等天然燃料的不完全燃燒等。由于部分PAHs對(duì)生物具有“三致”作用，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署將其中16種確定為優(yōu)先控制的有機(jī)污染物[2]。PAHs在環(huán)境中的去除途徑包括揮發(fā)、光氧化、化學(xué)氧化、生物積累、土壤吸附、浸濾作用、微生物降解等，其中，微生物降解占有重要地位[3]。PAHs的微生物降解有2種方式[4]。一是4個(gè)苯環(huán)以下的低相對(duì)分子質(zhì)量PAHs被作為唯一的碳源和能源而完全礦化；二是4個(gè)苯環(huán)及以上高相對(duì)分子質(zhì)量PAHs被微生物以共代謝的方式降解[5]。所謂的共代謝作用，就是在外加碳源情況下，難生物降解污染物有可能被微生物轉(zhuǎn)化，甚至完全降解[6]。共代謝作用由微生物細(xì)胞分泌的關(guān)鍵酶決定，與被降解底物的結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系[7]。為了提高目標(biāo)污染物降解性能，投加它的類似物，利用類似物誘導(dǎo)細(xì)胞酶的產(chǎn)生，提高酶活性，促進(jìn)目標(biāo)污染物的降解[8]。近年來，為了有效提高PAHs的降解，共代謝被廣泛應(yīng)用在PAHs污染的生物修復(fù)中，共代謝機(jī)理的研究逐漸成為目前PAHs降解研究的熱點(diǎn)之一。但由于共代謝過程涉及到許多因素以及因素間的相互作用[6]，其相關(guān)研究并不深入，有些解釋還是假設(shè)性質(zhì)的，有待于進(jìn)一步探索。筆者通過考察低相對(duì)分子質(zhì)量PAHs芴和菲的加入對(duì)高相對(duì)分子質(zhì)量PAHs芘產(chǎn)生的影響，運(yùn)用GC-MS測(cè)定單一PAHs生物降解和混合PAHs降解的降解速率和代謝產(chǎn)物組成的變化，來研究高相對(duì)分子質(zhì)量PAHs的生物共代謝降解過程，為共代謝機(jī)理的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和試劑

1.1.1 試劑

芴、菲、芘(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%)，美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硝酸鈉(NaNO3)、硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈣(CaCl2)、硫酸亞鐵(FeSO4)、無(wú)水硫酸鈉、丙酮、環(huán)己烷，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；酵母粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)

分別將0.6 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、4.0 g NaNO3、0.3 g MgSO4、0.01 g CaCl2、0.01 g FeSO4和0.5 g 酵母粉按順序逐一溶解，用蒸餾水定容至1000 mL。

1.1.3 菌源

從新疆克拉瑪依油田黑油山公園的油泥中分離得到一組石油降解菌群。該菌群包含12株可分離培養(yǎng)的單菌，來自假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)6個(gè)不同的菌屬。在無(wú)菌條件下制備石油降解菌群的菌懸液，最終使液體中菌含量為1.0×108CFU/mL。

1.2 單一PAHs的降解

取10 mg芴完全溶解于丙酮中，加入100 mL已滅菌的MSM，最終使芴質(zhì)量濃度為100 mg/L。置于搖床中過夜使丙酮揮發(fā)完全，接種1%(體積分?jǐn)?shù))菌懸液，然后于30℃、轉(zhuǎn)速160 r/min的搖床中避光振蕩培養(yǎng)，在第3、5、7、9 d分別取樣測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣品，同時(shí)設(shè)不接種菌懸液的對(duì)照樣品。菲和芘的降解方法同上。

1.3 混合PAHs的降解

分別取10 mg芴、菲、芘完全溶解于丙酮中，加入100 mL已滅菌的MSM，最終使混合PAHs中每種PAHs質(zhì)量濃度為100 mg/L，具體降解方法同1.2節(jié)。

1.4 降解菌降解多環(huán)芳烴的紫外光度分析

待測(cè)樣品經(jīng)10000 r/min轉(zhuǎn)速離心除去菌體，用環(huán)己烷萃取上清液中的多環(huán)芳烴。萃取3遍，合并萃取液，并用無(wú)水硫酸鈉脫水，定容至10 mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到降解后芴、菲、芘的質(zhì)量濃度。

1.5 降解菌降解PAHs的中間代謝產(chǎn)物分析

采用Agilent5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析PAHs降解中間產(chǎn)物。色譜儀進(jìn)樣口溫度290℃；接口溫度290℃；色譜柱DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)； 60℃保持2 min，以6℃/min升到270℃，保持20 min；氦氣作載氣，流速1.10 mL/min，壓力65.2 kPa；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜儀離子源溫度為200℃，溶劑延遲時(shí)間6 min，檢測(cè)器電壓1 kV，電子轟擊源(EI)，電離電壓70 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一多環(huán)芳烴的生物降解率和降解產(chǎn)物

2.1.1 單一多環(huán)芳烴的生物降解率

對(duì)降解菌分別降解質(zhì)量濃度為100 mg/L的芴、菲和芘進(jìn)行了紫外光度法分析，其降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化示于圖1。由圖1可以看出，降解菌對(duì)芴的降解效果最好，降解率也最高，在培養(yǎng)的第5 d，芴已經(jīng)被完全降解(降解率為100%)；對(duì)菲的降解效果也很好，在第7 d降解率達(dá)到98.93%；對(duì)芘的降解效果最差，第9 d時(shí)降解率僅為65.73%。由此可見，隨著PAHs苯環(huán)數(shù)的增加，降解菌對(duì)其降解效率逐漸下降，這主要是因?yàn)楦呦鄬?duì)分子質(zhì)量PAHs分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性高，疏水性強(qiáng)，水溶性低，生物可利用性低，對(duì)微生物的毒性大，難以被微生物利用。

圖1 微生物降解單一多環(huán)芳烴的降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

2.1.2 芴的微生物降解產(chǎn)物

芴降解中間產(chǎn)物的GC-MS總離子流色譜如圖2所示。經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并結(jié)合人工譜圖解析，對(duì)相對(duì)豐度較高并且能夠基本定性的色譜峰進(jìn)行了鑒定。由圖2可知，芴降解后產(chǎn)生5種可基本確定的代謝物。峰2為9-芴酮(9-Fluorenone)，峰3、4和5的保留時(shí)間不同，但是具有相同的質(zhì)譜離子(質(zhì)荷比為254、239、165、73)，說明是羥基取代位置不同的單羥基芴[9]，分別為9-羥基芴(9- Hydroxy fluorene)、1-羥基芴(1- Hydroxy fluorene)和3-羥基芴(3- Hydroxy fluorene)。峰6是4-羥基-9-芴酮(4- Hydroxy-9- fluorenone)。

2.1.3 菲的微生物降解產(chǎn)物

菲降解中間產(chǎn)物的GC-MS總離子流色譜如圖3所示。由圖3可知，菲降解后產(chǎn)生10種可基本確定的代謝物，有峰1的水楊酸(Salicylic acid)、峰2的鄰苯二甲酸(Phthalic acid)、峰3的二羥基萘(Dihydroxynaphthalene)、峰5的1-羥基-2-萘酸(1- Hydroxy-2- naphthalene)、峰6的7, 8-苯并香豆素(7, 8- Benzo coumarin)。此外，峰7、8分別鑒定為3-羥基菲(3-Hydroxyphenanthrene)和1-羥基菲(1-Hydroxyphenanthrene)，峰9(Dihydroxyphenanthrene)、峰10(DihydroxyphenanthreneⅡ)和峰11(Dihydroxyphenanthrene Ⅲ)是羥基取代位置不同的二羥基菲(保留時(shí)間不同，但是有相同的質(zhì)荷比354、339、266、236、73)[10]。

圖2 芴降解中間產(chǎn)物GC-MS總離子流色譜圖

圖3 菲降解中間產(chǎn)物GC-MS總離子流色譜圖

2.1.4 芘的微生物降解產(chǎn)物分析及其代謝途徑的推導(dǎo)

芘降解中間產(chǎn)物的GC-MS總離子流色譜圖如圖4所示。由圖4可知，芘降解后產(chǎn)生較多代謝物，有6種可基本定性。峰2和峰3分別確定為4-羥基菲(4-Hydroxyphenanthrene)和4-菲羧酸(4- Phenanthrene carboxylic acid)，峰4為1-羥基芘(1-Hydroxypyrene)，峰5為3, 4-二羥基菲(DihydroxyphenanthreneⅠ)。此外，存在2種羥基取代位置不同的二羥基芘(保留時(shí)間不同，但質(zhì)荷比相同378、290、260、73)[11-13]，即峰6(DihydroxypyreneⅠ)和峰7(DihydroxypyreneⅡ)。

圖4 芘降解中間產(chǎn)物GC-MS總離子流色譜圖

2.2 混合多環(huán)芳烴的共代謝降解

混合PAHs中每種組分的降解效果如圖5所示。由圖5可知，經(jīng)過8 d的培養(yǎng)，3種PAHs均得到完全的降解，其中芴在第3 d時(shí)就已經(jīng)完全去除，菲在第5 d時(shí)得到全部降解，較單一芴和單一菲為底物時(shí)降解效果更優(yōu)(見圖1)。同時(shí)，芴和菲的存在促進(jìn)了芘的降解，在培養(yǎng)的第8 d已經(jīng)得到完全去除，而單一芘為底物時(shí)在培養(yǎng)的第9 d降解率僅為65.73%(見圖1)?？梢?，容易被微生物利用的芴和菲促進(jìn)了難降解芘的共代謝降解，增強(qiáng)了降解菌降解芘的能力，同時(shí)芴和菲的降解也沒有因?yàn)檐诺拇嬖谑艿截?fù)面影響。

混合PAHs降解中間產(chǎn)物的GC-MS總離子流色譜圖如圖6所示。由圖6可知，混合PAHs降解后產(chǎn)生8種可基本確定的代謝物。其中峰5的4-羥基-9-芴酮(4- Hydroxy -9- fluorenone)為芴的代謝產(chǎn)物，峰1的水楊酸(Salicylic acid)、峰2的鄰苯二甲酸(Phthalic acid)、峰3的1-羥基-2-萘酸(1- Hydroxy -2- naphthalene acid)和峰7的二羥基菲Ⅱ(DihydroxyphenanthreneⅡ)在單一菲的降解產(chǎn)物中存在，峰6的二羥基菲Ⅰ(DihydroxyphenanthreneⅠ)在單一菲和單一芘的代謝產(chǎn)物中均出現(xiàn)過，峰4的4-羥基菲(4-Hydroxyphenanthrene)和峰8的二羥基芘(DihydroxypyreneⅡ)在單一芘的降解產(chǎn)物中存在。而當(dāng)芴、菲和芘單獨(dú)降解時(shí)，分別產(chǎn)生5種、10種和6種代謝物，可見，3種PAHs混合降解有利于代謝產(chǎn)物的去除。

圖5 混合PAHs中每種PAHs的降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

圖6 混合多環(huán)芳烴降解中間產(chǎn)物的GC-MS總離子流色譜圖

為進(jìn)一步考察芴和菲的存在對(duì)芘降解產(chǎn)生的影響，將芘單獨(dú)降解的代謝產(chǎn)物與混合降解時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物峰面積進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果示于圖7。由圖7可知，當(dāng)芘單獨(dú)降解時(shí)，經(jīng)過9 d的培養(yǎng)檢測(cè)到6種代謝產(chǎn)物，包括初始氧化產(chǎn)物(二羥基芘Ⅰ、二羥基芘Ⅱ和1-羥基芘)和環(huán)裂解產(chǎn)物(4-菲羧酸和4-羥基菲)，其中初始氧化產(chǎn)物含量較大；而當(dāng)芴和菲存在時(shí)，芘在第8 d時(shí)只產(chǎn)生了3種代謝產(chǎn)物，初始氧化產(chǎn)物二羥基芘Ⅰ和1-羥基芘已經(jīng)檢測(cè)不到，二羥基芘Ⅱ峰面積減少，環(huán)裂解產(chǎn)物4-羥基芘峰面積有所增加。微生物利用不同的碳源作為生長(zhǎng)基質(zhì)共代謝芘時(shí)會(huì)誘導(dǎo)出不同的酶系[14]，因此，芴和菲的加入有可能誘導(dǎo)出新的降解芘及其代謝產(chǎn)物的酶系。此外，芴和菲較容易被微生物利用，能支持降解菌的快速增殖，從而分泌更多的降解酶來促進(jìn)芘和芘的代謝產(chǎn)物的降解，通過增大生物量來促進(jìn)難降解物的轉(zhuǎn)化[15]?？傊?，芴和菲的存在不僅促進(jìn)了芘的完全快速降解，而且能夠促進(jìn)芘代謝產(chǎn)物的去除，并且芘的存在也促進(jìn)了芴和菲的降解和代謝產(chǎn)物的去除。

圖7 芘單獨(dú)降解9 d與混合降解8 d時(shí)降解中間產(chǎn)物峰面積對(duì)比

3 結(jié) 論

(1) 單一多環(huán)芳烴的生物降解中，芴的降解效果最好，降解率也最高，在培養(yǎng)的第5 d，芴已經(jīng)被完全降解，有5種代謝產(chǎn)物生成；菲的降解效果也很好，在第7 d降解率達(dá)到98.93%，生成10種代謝產(chǎn)物；芘的降解效果最差，第9 d時(shí)降解率僅為65.73%，代謝產(chǎn)物較多，其中6種可基本定性。由此可見，隨著苯環(huán)數(shù)的增加，多環(huán)芳烴的降解效果逐漸下降，代謝產(chǎn)物逐漸增多。

(2) 3種多環(huán)芳烴混合降解時(shí)，芴、菲和芘分別在第3 d、5 d和8 d得到完全的去除，共產(chǎn)生8種代謝產(chǎn)物，其中芘在第8 d時(shí)只產(chǎn)生了3種代謝產(chǎn)物?？梢姡毯头频拇嬖诓粌H促進(jìn)了芘的完全快速降解，而且能夠促進(jìn)芘代謝產(chǎn)物的去除，并且芘的存在也促進(jìn)了芴和菲的降解，以及代謝產(chǎn)物的去除。

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Co-Metabolism Biodegradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons With High Relative Molecular Mass

LI Zheng1, GU Guizhou1, ZHAO Chaocheng2, ZHAO Dongfeng2, YANG Lei1

(1.CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandEnvironmentalEngineering,LiaoningShihuaUniversity,Fushun113001,China;2.CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266555,China)

In order to study the co-metabolism biodegradation of the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with high relative molecular mass, an influence of the addition of fluorene and phenanthrene, the PAHs with low relative molecular mass, on pyrene biodegradation was investigated and the composition of the biodegradation metabolites was determined by GC-MS. The results showed that in the biodegradation of single PAHs, fluorene was completely degraded throughout 5 d incubation to generate five metabolites, the degradation rate of phenanthrene reached 98.93% to generate ten metainbolites after 7 d incubation and only 65.73% of pyrene was degraded throughout 9 d incubation to generate more metabolites, six of which could be qualitative. In the degradation of mixture of fluorene, phenanthrene and pyrene, they were completely removed after 3 d, 5 d and 8 d incubation, respectively, and a total of eight metabolites were produced, and only three metabolites were produced from pyrene after 8 d incubation. Therefore, fluorene and phenanthrene not only promoted the degradation of pyrene rapidly and completely, but also promoted the removal of the metabolites of pyrene, meanwhile, the presence of pyrene also contributed to the degradation of fluorene and phenanthrene and the removal of their metabolites.

polycyclic aromatic hydrocarbons; co-metabolism; biodegradation

2014-02-18

遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(L2014148)資助

李政，女，講師，博士，從事石油污染土壤生物修復(fù)方面的研究；Tel: 024-53847679；E-mail: lizheng.zz@163.com

1001-8719(2015)03-0720-06

X172

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.03.016