景舉偉，李 順，趙 艷，白學(xué)貴，陳宣欽，李昆志，徐慧妮＊

（1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明650500；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，昆明650201）

外源H2S對NO3－脅迫下番茄幼苗生理生化特性的影響

景舉偉1，李 順1，趙 艷2，白學(xué)貴1，陳宣欽1，李昆志1，徐慧妮1＊

（1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明650500；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，昆明650201）

采用營養(yǎng)液水培方法，通過外源施加H2S供體NaHS（100μmol／L），研究了信號分子H2S對100mmol／L NO3－脅迫下番茄幼苗生理生化特性的影響。結(jié)果表明：（1）NO3－脅迫下，隨著處理時間的延長，番茄幼苗的株高、根長、鮮重和干重顯著降低，葉綠素（a、b）含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均顯著降低，而胞間CO2濃度以及丙二醛（MDA）、H2O2含量增加，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性顯著降低，抗壞血酸（AsA）和還原性谷胱甘肽（GSH）含量顯著降低。（2）與NO3－脅迫處理相比，外源NaHS處理1、3、5d后，番茄幼苗的株高、根長、鮮重和干重顯著增加，葉綠素（a、b）含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均顯著升高，而胞間CO2濃度顯著降低；MDA和H2O2含量降低，SOD、POD、CAT和APX活性顯著增強(qiáng)，AsA和GSH含量顯著增加，而且幼苗的硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶的活性顯著增強(qiáng)；L－半胱氨酸脫巰基酶活性和內(nèi)源H2S含量增加。研究認(rèn)為，外源H2S可能通過提高抗氧化物酶的活性和增加抗氧化物質(zhì)含量來緩解NO3－對番茄幼苗造成的傷害，從而增強(qiáng)其對NO3－脅迫耐性。

土壤次生鹽漬化；硫化氫；光合特性；氮代謝；抗氧化物酶

設(shè)施作物生長周期短，復(fù)種指數(shù)高，種植結(jié)構(gòu)單一，生產(chǎn)中普遍存在超量不平衡施用化肥現(xiàn)象，加之土壤得不到雨水淋洗，并長期處于高溫高濕的環(huán)境中，蒸騰量大，使得大量鹽分集聚在土層表層，一般在5～8年后，會發(fā)生不同程度的土壤次生鹽漬化［1］。土壤次生鹽漬化是溫室蔬菜生長的主要障礙之一，研究表明其土壤的鹽分組成特點(diǎn)和濱海、內(nèi)陸鹽土不同，其陰離子主要是NO3－，陽離子主要是Ca2＋和K＋［2］。NO3－離子濃度過高會將土壤固相中的Ca2＋等置換出來形成各種硝酸鹽，提高土壤溶液的濃度和滲透壓，降低土壤－植物根系－植物葉片的水勢梯度，引起葉片氣孔關(guān)閉，同時，過量NO3－還會妨礙作物對鐵的吸收利用，引起葉片黃化［3］。

H2S是繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子，在植物生長發(fā)育和脅迫環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。研究表明，一定濃度的外源H2S能夠緩解鹽脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫等對植物的傷害。鹽脅迫下H2S參與調(diào)節(jié)植物活性氧（ROS）代謝，提高抗氧化物酶的活性［4］。滲透脅迫引起的番薯（Ipomoea batatas）葉綠素含量下降，噴施NaHS顯著提高其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，降低脂氧合酶（LOX）、H2O2和MDA的含量，從而緩解滲透脅迫［5］。

番茄是中國設(shè)施栽培的主要蔬菜之一，其幼苗若受高濃度鹽危害，會引起幼苗老化并產(chǎn)生畸形果，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量［6－7］。番茄在3年以上的保護(hù)地內(nèi)栽培，每年產(chǎn)量會降低10%～20%，且病害逐年加重［8］。目前外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗生理和生化特性的影響鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)研究了外源添加H2S的供體NaHS對NO3－脅迫下番茄生長、碳氮代謝和氧化脅迫的影響，旨為豐富氣體信號分子H2S在鹽脅迫下對植物調(diào)控作用的資料并為解決設(shè)施土壤次生鹽漬化傷害奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

番茄（Solamum lycopersicumL.）品種為‘中蔬4號’NaHS為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 幼苗培養(yǎng)及處理

選取籽粒飽滿、大小均勻、無病蟲害的番茄種子，3%次氯酸鈉溶液消毒10min，蒸餾水沖洗3～5次，播種在墊有2層濾紙的直徑為9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)催芽。種子80%露白后，將其均勻地播種到珍珠巖上，并覆蓋1層珍珠巖，噴透水。番茄幼苗長至1片真葉時移栽于4L方盆，每盆12株幼苗，添加華南農(nóng)業(yè)大學(xué)水培番茄營養(yǎng)液配方進(jìn)行培養(yǎng)［9］。當(dāng)番茄幼苗長至三葉一心時開始處理，試驗(yàn)共設(shè)3個處理：（1）正常培養(yǎng)（CK）：番茄營養(yǎng)液栽培；（2）NO3－脅迫（NO3－）：在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，營養(yǎng)液中添加100 mmol／L NO3－溶液進(jìn)行高濃度NO3－處理，NO3－溶液采用1mol／L KNO3和0.5mol／L Ca（NO3）2等體積配制；（3）NO3－脅迫＋NaHS（NO3－＋H2S）：在番茄營養(yǎng)液中同時添加100mmol／L NO3－溶液和100μmol／L NaHS溶液。分別在處理1、3、5d后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的分析測定。培養(yǎng)溫室條件為：每天光照16h，光強(qiáng)為300μmol·m－2· s－1，白天溫度為25～32℃，夜間溫度為15～20℃，空氣相對濕度為65%左右。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 株高、根長、鮮重和干重 用直尺測量番茄幼苗株高（莖基部到生長點(diǎn)的長度）和根長（根莖結(jié)合處到主根根尖的長度）；番茄幼苗用去離子水沖洗干凈并吸干水分，從根莖結(jié)合處剪斷，分為地上部和地下部，分別稱得鮮重；再在烘箱中105℃下殺青15min后，75℃烘干至恒重，稱得干重。

1.3.2 葉綠素含量 收集各處理相同部位番茄葉片，在液氮中充分研磨成粉末狀，以95%乙醇對葉綠素進(jìn)行抽提。葉綠素含量采用紫外分光光度法進(jìn)行測定［10］。

1.3.3 光合參數(shù) 采用Yaxin－1102便攜式光合蒸騰儀，于晴天上午9：00～11：00測定植株光合參數(shù)。取第3片完全展開的功能葉，測定其凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率。測定時的光量子通量密度為800μmol·m－2·s－1，環(huán)境CO2濃度為（380±10）μmol·mol－1，葉室溫度為25℃。

1.3.4 MDA和H2O2含量 番茄葉片中MDA含量根據(jù)Han等［11］的方法測定，H2O2含量根據(jù)李忠光等［12］方法測定。

1.3.5 抗氧化酶活性 粗酶液提取按照Gossett等［13］的方法，取0.2g番茄葉片樣品，加1mL酶提取液（50mmol／L、pH 7.8的磷酸緩沖液，含1 mmol／L EDTA、1mmol／L AsA與1%PVP），冰浴研磨，研磨后加1mL磷酸緩沖液，倒入離心管中，4℃、12 000r／min離心20min，上清即為酶粗提液，離心后－20℃保存，可直接用于SOD、POD、CAT、APX活性的測定。SOD活性測定按照Beauchamp等［14］的方法，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化學(xué)反應(yīng)50%為一個酶活性單位。POD活性測定參照Tatiana等［15］的方法，取粗酶液20μL加入比色皿中，加3mL反應(yīng)液，內(nèi)含50mmol／L pH 7.0的磷酸緩沖液、2.7mmol／L愈創(chuàng)木酚和2mmol／L H2O2，馬上記錄吸光度值（A470）的連續(xù)變化值。CAT活性測定參照Aebi的方法［16］，取粗酶液100μL加入比色皿中，加入3mL反應(yīng)液，內(nèi)含有50mmol／L pH 7.0磷酸緩沖液和10μL 30%H2O2，記錄A240的連續(xù)變化值。APX活性測定參照Nakano等［17］的方法進(jìn)行，取粗酶液100μL，加入3mL反應(yīng)液，內(nèi)含50mmol／L pH 7.0磷酸緩沖液，1mmol／L AsA和2.5mmol／L H2O2，記錄A290的連續(xù)變化值。

1.3.6 還原型抗壞血酸（AsA）含量和還原型谷胱甘肽（GSH）含量 AsA和GSH含量按照J(rèn)iang等［18］的方法測定。（1）AsA含量測定：取0.1g番茄葉片在液氮中研磨成粉末，立即轉(zhuǎn)移至冰浴的6%TCA中。4℃、12 000r／min離心20min，取上清。上清液中加入0.2mL 150mmol／L NaH2PO4和0.2mL H2O。然后經(jīng)過以下反應(yīng)體系反應(yīng)：0.4 mL 10%TCA，0.4mL 44%正磷酸，溶于70%乙醇的0.4mL 4%a，a′－2聯(lián)吡啶，以及0.2mL 0.3%（W／V）FeCl3。混勻后，混合物在37℃下溫育60 min，然后在525nm處測其吸光度值。（2）GSH含量測定：取0.2g樣品在液氮中研磨成粉狀，再加入1mL 5%5－磺基水楊酸進(jìn)行充分研磨，勻漿轉(zhuǎn)移至2mL離心管，在4℃下12 000r／min離心15min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。取上清液0.25mL，加入150mmol／L NaH2PO4（pH 7.7）2.6mL、DNTB試劑0.18mL，以加磷酸緩沖液代替DNTB試劑作空白。搖勻后，于30℃保溫反應(yīng)5min，測定412 nm波長下的光吸收值。

1.3.7 氮代謝關(guān)鍵酶活性 硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）及谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的測定采用王月福等［19］的方法。

1.3.8 L－半胱氨酸脫巰基酶（LCD）活性和內(nèi)源H2S含量的測定 LCD活性和內(nèi)源H2S含量的測定參照Chen等［20］的方法。（1）LCD活性測定：取番茄葉片0.3g，加入研缽中，然后加入1mL Tris－HCl緩沖液（20mmol／L、pH 8.0）研磨，離心后取上清液。取該上清液500μL于試管中，加入2mL勻漿液，然后加入一定量醋酸鋅。之后在試管中加入100μL 30mmol／L FeCl3溶液（用1.2mol／L HCl配制）、100μL 20mmol／L N，N－二甲基－對苯二胺（用7.2mol／L HCl配制）。將試管用塞子塞好，37℃反應(yīng)30min，然后測定670nm下吸光度值。（2）內(nèi)源H2S含量測定：取0.3g番茄葉片在液氮中磨碎，迅速轉(zhuǎn)移到1mL 20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）中，于4℃轉(zhuǎn)速12 000r／min離心15 min，取出上清。反應(yīng)液體系：0.8mmol／L L－半胱氨酸，2.5mmol／L DTT，100mmol／L Tris－HCl（pH 9.0）和100μg（或10μg）0.1g／L蛋白樣品。再加入L－半胱氨酸后啟動反應(yīng)，37℃孵育30min；反應(yīng)完成后加入溶于1.2mol／L HCl的100μL 30 mmol／L FeCl3和溶于7.2mmol／L HCl的100μL 20mmol／L N，N－二甲基－對苯二銨終止反應(yīng)并顯色15min。形成的亞甲基藍(lán)在用分光光度計(jì)在670 nm處測定吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用相應(yīng)濃度的Na2S。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由3次重復(fù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差組成，采用Excel和DPS 7.05（Duncan法）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗生長的影響

表1顯示，與對照（CK）相比，100mmol／L NO3－脅迫處理1d后就嚴(yán)重抑制了番茄幼苗的生長，如NO3－處理1、3、5d后，番茄幼苗地上部鮮重分別顯著降低了14.5%、44.4%、71.8%，地下部的鮮重分別顯著降低了23.4%、49.1%、82.3%。外源施加100 μmol／L NaHS后，番茄幼苗生長抑制得到顯著緩解，其鮮重、干重、株高、根長均增加；處理5d后，與NO3－處理相比，地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重、根長和株高分別顯著增加了162.8%、188.2%、214.2%、280.0%、98.3%和41.3%，但仍顯著低于對照（表1）。以上結(jié)果表明，100mmol／L NO3－脅迫顯著抑制了番茄幼苗生長，外源施加100μmol／L NaHS能夠有效緩解NO3－脅迫對番茄幼苗生長造成的抑制作用。

2.2 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗葉片光合特性的影響

由圖1可看出，與對照相比，NO3－脅迫下處理1、3、5d后，番茄幼苗葉片葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量均不同程度下降。其中，葉綠素a含量分別降低23.3%、38.7%、69.2%，葉綠素b含量分別降低了31.2%、58.1%、79.0%，總?cè)~綠素含量分別降低了17.0%、37.3%、62.6%，并大多達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。外源施加NaHS后，與NO3－脅迫相比，番茄幼苗中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均增加，但未達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。其中，葉綠素a含量在處理1、3、5d時分別增加19.4%、26.3%、37.0%，葉綠素b含量分別增加了10.0%、26.0%、27.0%，總?cè)~綠素含量分別增加了13.0%、17.3%、30.2%。

表1 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗生長的影響Table 1 Effect of exogenous NaHS on the growth of tomato seedlings under NO3－stress

圖1 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的影響Fig.1 Effect of exogenous NaHS on chlorophyll a，chlorophyll b and total chlorophyll content of tomato seedling under NO3－stress

同時，NO3－脅迫處理1、3、5d后，番茄葉片的凈光合速率，氣孔導(dǎo)度，蒸騰速率均顯著下降（P＜0.05），而胞間二氧化碳濃度顯著增加（圖2）；施加外源NaHS后，與NO3－脅迫相比，幼苗凈光合速率、氣孔導(dǎo)度顯著增加（P＜0.05），蒸騰速率有所增加，但未達(dá)顯著水平（P＜0.05），胞間二氧化碳濃度卻顯著降低，并接近對照水平。其中，凈光合速率分別增加了16.0%、30.4%、64.2%，氣孔導(dǎo)度分別增加了45.0%、57.9%、75.0%，蒸騰速率分別增加了21.6%、35.9%、59.5%，胞間二氧化碳濃度（Ci）分別降低了33.1%、31.6%、34.2%。以上結(jié)果說明，外源施加NaHS可以緩解NO3－脅迫對番茄葉片光合作用造成的傷害。

2.3 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗膜脂過氧化水平和H2O2含量的影響

如圖3所示，與對照相比，NO3－脅迫1、3、5d后，番茄幼苗葉中的MDA含量和H2O2含量均顯著增加（P＜0.05）。施加外源NaHS后，與NO3－脅迫相比，葉中MDA含量和H2O2含量均一定程度降低，但未達(dá)顯著水平（P＜0.05）；其中MDA含量在處理1、3、5d后分別降低了25.2%、16.8%、29.8%，H2O2分別降低了10.9%、15.9%、11.5%。以上結(jié)果說明，外源施加NaHS可以一定程度上緩解NO3－脅迫對番茄幼苗膜脂過氧化和氧化脅迫的傷害。

2.4 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗抗氧化物酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響

圖2 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗凈光合速率（A）、氣孔導(dǎo)度（B）、蒸騰速率（C）和胞間二氧化碳濃度（D）的影響Fig.2 Effect of exogenous NaHS on net photosynthesis rate（A），gas conductance（B），transpiration rate（C）and cellular CO2concentration（D）of tomato seedling under NO3－stress

圖3 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗MDA和H2O2含量的影響Fig.3 Effect of exogenous NaHS on the MDA and H2O2contents of tomato seedling under NO3－stress

NO3－脅迫處理1、3、5d后，番茄幼苗葉片SOD、POD和CAT活性隨脅迫時間的增加而顯著降低（P＜0.05），而APX活性卻隨脅迫時間的增加而顯著增加（P＜0.05）。外源施加NaHS均增加了SOD、POD、CAT和APX的活性，但僅APX活性增加達(dá)到顯著水平；與NO3－脅迫相比，在處理5d后，幼苗葉片SOD、POD、CAT和APX的活性分別增加30.1%、54.5%、41.6%、20.2%（圖4，A～D）。同時，幼苗葉片重要的抗氧化物質(zhì)AsA和GSH含量在NO3－脅迫后顯著增加；在處理5d后，其含量分別比對照增加30.5%和19.6%。外源施加NaHS后，葉片AsA和GSH含量均不同程度增加，但僅GSH含量達(dá)到顯著水平；與NO3－脅迫相比，AsA和GSH含量在脅迫5d后分別增加13.1%和13.8%（圖4，E、F）。以上結(jié)果說明，外源施加100μmol／L NaHS能夠增加抗氧物酶活性及抗氧化物質(zhì)的含量，從而增強(qiáng)番茄幼苗抵御NO3－脅迫的能力。

2.5 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖5可知，NO3－脅迫處理1、3、5d后，氮代謝關(guān)鍵酶硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）活性隨脅迫時間的增加而顯著降低（P＜0.05），其在脅迫5d后分別比CK降低83.5%、57.4%、66.7%；外源施加NaHS處理顯著增加了NR、GS、GOGAT活性，其在處理5d后分別是NO3－脅迫下活性的3.0、2.4和2.3倍。以上結(jié)果說明，NO3－脅迫抑制了氮代謝過程中關(guān)鍵酶的活性，外源NaHS能有效緩解這種抑制作用。

2.6 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗L－半胱氨酸脫巰基酶活性及內(nèi)源H2S含量的影響

圖4 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗的SOD、POD、CAT、APX活性及AsA、GSH含量的影響Fig.4 Effect of exogenous NaHS on SOD，POD，CAT，APX activities and ASA，GSH content of tomato seedling under NO3－stress

圖5 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗的根系NR、GS和GOGAT活性的影響Fig.5 Effect of exogenous NaHS on NR，GS，GOGAT activities of tomato seedling under NO3－stress

L－半胱氨酸脫巰基酶是產(chǎn)生H2S的關(guān)鍵酶之一。由圖6可知，NO3－脅迫處理1、3、5d后，番茄幼苗葉片L－半胱氨酸脫巰基酶（LCD）活性均比對照顯著降低（P＜0.05）；外源施加NaHS后，與NO3－脅迫相比，處理1、3、5d后LCD活性分別顯著增加55.2%、30.3%、15.0%，但并未達(dá)到對照水平。同時，番茄幼苗葉片內(nèi)源H2S含量在NO3－脅迫后比對照有所降低，并有隨脅迫時間延長而增加的趨勢；外源施加NaHS后內(nèi)源H2S含量顯著增加，在處理1、3、5d后分別是NO3－脅迫處理下的2.4、1.7和1.3倍，但與對照無顯著性差異。以上結(jié)果說明，外源NaHS能夠顯著促進(jìn)NO3－脅迫番茄幼苗葉片中LCD酶活性，進(jìn)一步激發(fā)內(nèi)源H2S含量的增加。

圖6 外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗L－半胱氨酸脫巰基酶活性和內(nèi)源H2S含量的影響Fig.6 Effect of exogenous NaHS on LCD activity and H2S content of tomato seedling under NO3－stress

3 討 論

硫化氫（H2S）是繼NO和CO之后的第3種氣體信號分子，參與各種生理調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)動物心臟和神經(jīng)系統(tǒng)功能、舒張血管和消化道平滑肌以及抑制平滑肌細(xì)胞增殖等過程；H2S參與了植物生長發(fā)育及對外界逆境的抵御反應(yīng)，如促進(jìn)植物生長、調(diào)控氣孔運(yùn)動、促進(jìn)根的發(fā)育、增強(qiáng)光合作用、緩解逆境傷害（鹽脅迫、干旱脅迫、離子毒害、熱激傷害）提高幼苗的耐寒性及延緩果實(shí)等組織的成熟衰老等［21］。一定濃度的外源H2S能夠緩解NaCl脅迫對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制［22］。長期干旱脅迫降低了大豆品種Xu－1和Xu－6的葉和根的生物量，葉面噴施NaHS，增加了其生物量［23］。干旱脅迫下，甘薯幼苗子葉中的葉綠素含量顯著減少，噴施NaHS后，顯著減輕了幼苗葉片葉綠素含量的降低［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，NO3－脅迫處理后降低了番茄幼苗的株高、根長、干重、鮮重和葉綠素含量，外源施加NaHS使受脅迫番茄幼苗的株高、根長、干重、鮮重等增加，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量上升。

鹽脅迫下膜質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致質(zhì)膜透性加大，離子平衡失調(diào)，代謝紊亂，生長發(fā)育受到抑制。在鹽脅迫下，植物葉片中MDA含量和H2O2含量會隨著鹽濃度的升高而增加。外源施加H2S的供體NaHS可以緩解干旱脅迫所已引起的甘薯幼苗H2O2和MDA含量的升高，從而提高甘薯幼苗抵抗干旱誘導(dǎo)的氧化脅迫的能力［25］。Wang等［26］研究發(fā)現(xiàn)，100μmol／L NaHS處理激活了SOD、CAT、POD和APX的同工酶活性或相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物，從而導(dǎo)致NaCl脅迫引起的氧化損傷減輕。同樣，Zhang等［27］研究表明，H2S供體NaHS可以提高Cr、Al和Cu脅迫下種子某些抗氧化酶的活性，進(jìn)而對種子的正常萌發(fā)起到一定的保護(hù)作用。銅脅迫增加了小麥種子中APX活性，外源NaHS預(yù)處理，則增加了AsA和GSH含量，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)AsA－GSH代謝減輕Cu脅迫對種子的氧化傷害作用［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，施加外源NaHS后，番茄幼苗MDA含量和H2O2含量顯著降低，SOD、CAT、POD、APX活性增強(qiáng)，AsA和GSH含量增加，從而緩解鹽害對番茄幼苗造成的氧化損傷作用，進(jìn)而對番茄幼苗生長起到保護(hù)作用。

硝酸還原酶（NR）是植物體內(nèi)控制氮代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，也是一種誘導(dǎo)酶，對作物光合、呼吸及碳代謝等有著重要影響，其活性受到NO3－含量的誘導(dǎo)［29］。NR是催化NO3－轉(zhuǎn)化為NH4＋過程中的限速酶，進(jìn)入植物體內(nèi)的NO3－必須還原為NH4＋后才可以參與氨基酸與蛋白質(zhì)的合成過程，進(jìn)而被植物吸收利用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NO3－脅迫下，番茄幼苗NR活性隨著處理時間的增加而降低，影響NO3－還原為NH4＋，導(dǎo)致了NO3－含量的大量積累，植物積累過多的離子，會導(dǎo)致離子毒害，影響植物的正常生長，這與孫菲菲等［30］、趙永福等［31］、李飛等［32］的研究結(jié)果一致。施加外源NaHS后，增加了番茄幼苗NR活性，進(jìn)而緩解了NO3－對植物的脅迫。葉綠體中GS／GOGAT循環(huán)是植物體內(nèi)NH4＋同化的主要途徑，GS對NH4＋有較高的親和力可避免NH4＋積累造成對植株的傷害，在植物氮代謝中起著非常重要的作用［33］，本研究發(fā)現(xiàn)，NO3－脅迫下，番茄中GS與GOGAT的活性顯著下降，說明了GS／GOGAT與NO3－含量有關(guān)，而施加外源的NaHS后，可能是GS／GOGAT活性得到了提高，加快了NH4＋同化速度，減弱了NO3－在植物體內(nèi)的積累，進(jìn)而緩解了NO3－對植物造成的傷害。

近年來發(fā)現(xiàn)植物體如黃瓜、玉米、大豆、擬南芥、油菜、水稻等植物葉中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源H2S的存在，它主要通過通過半胱氨酸脫巰基酶（cysteine desulphydrase）催化半胱氨酸降解生成H2S、丙酮酸鹽和NH3，也可以通過葉片吸收大氣中的H2S，或者在亞硫酸鹽還原酶的作用下，將SO32－直接還原成H2S。研究發(fā)現(xiàn)H2S能與乙烯、脫落酸、赤霉素、茉莉酸等植物激素及NO、CO等信號分子發(fā)揮相互作用，抵御生物和非生物脅迫［34］。Zhang等［35］研究發(fā)現(xiàn)，外源施加NaHS可緩解鉛脅迫引起的棉花根、莖、葉內(nèi)源H2S含量增加。本研究也發(fā)現(xiàn)，與對照相比，NO3－脅迫使L－半胱氨酸脫巰基酶的活性和H2S的產(chǎn)生量降低，施加外源NaHS使脅迫幼苗H2S的產(chǎn)生量和L－半胱氨酸脫巰基酶的活性增加。

綜上所述，本研究主要分析了外源施加NaHS對NO3－脅迫下番茄幼苗生理生化特性的影響，并且發(fā)現(xiàn)H2S可能主要通過增加幼苗體內(nèi)抗氧化物酶的活性和增加抗氧化物質(zhì)含量，以及調(diào)節(jié)氮代謝過程來緩解NO3－脅迫的傷害，維持植株光合特性和正常生長發(fā)育，最終增強(qiáng)番茄幼苗抵抗NO3－脅迫的能力。

［1］ LI J Y（李金耀），ZHANG F CH（張富春），MA J（馬 紀(jì)），et al.The mechanisms of salt resistance in plants in molecular levels［J］.Plant Physiology Communications（植物生理學(xué)通訊），2003，39（6）：715－719（in Chinese）.

［2］ LIU Q F（劉慶芳），LüJ L（呂家瓏），LI S L（李松玲），et al.The spatiotemporal variation of nitric nitrogen in protected vegetable soils in different years of cultivation［J］.Agricultural Research in the Arid Areas（干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究），2011，29（2）：159－163（in Chinese）.

［3］ YU H Y（余海英），LI T X（李廷軒），ZHOU J M（周健民），et al.Salt accumulation，translocation and ion composition in greenhouse soil profiles［J］.Plant Nutrition and Fertilizer Science（植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)），2007，13（4）：642－650（in Chinese）.

［4］ ASHARF M.Biotechnological approach of improving plant salt tolerance using antioxidants as markers［J］.Biotechnol.Advance，2009，27（1）：84－93.

［5］ WANG Y Q，LI L，CUI W T，et al.Hydrogen sulfide enhances alfalfa tolerance against salinity during seed germination by nitric oxide pathway［J］.Plant and Soil，2012，351：107－119.

［6］ LIU ZH Y（劉志媛），ZHU ZH J（朱祝軍），QIAN Y R（錢亞榮），et al.Effect of iso－osmotic Ca（NO3）2and NaCl on growth of tomato seeding［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），2001，28（1）：31－35（in Chinese）.

［7］ YAO J（姚 靜），SHI W M（施衛(wèi)明）.Effect of salt stress on structure and growth of tomato seeding roots［J］.Soils（土壤），2008，40（2）：279－282（in Chinese）.

［8］ WANG X J（王學(xué)軍）.The study on soil salinization of protected farmland［J］.Northern Horticulture（北方園藝），1998，（3／4）：12－13（in Chinese）.

［9］ LüJ ZH（呂炯璋），SANG P T（桑鵬圖），LI L ZH（李靈芝），et al.Effect of nutrient solution with different formulas and concentrations on the growth of tomato seedling［J］.Journal of Shanxi Agricultural University（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版），2010，30（2）：112－116（in Chinese）.

［10］ 張志良，瞿 偉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2002.

［11］ HAN Y，ZHANG J，CHEN X Y，et al.Carbon monoxide alleviates cadmium－induced oxidative damage by modulating glutathione metabolism in the roots of Medicago sativa［J］.New Phytol.，2008，177（1）：155－166.

［12］ LI ZH G（李忠光），SONG Y Q（宋玉泉），GONG M（龔 明），et al.Xylenol orange method used for the measurement of hydrogen peroxide in plant tissue［J］.Journal of Yunnan Normal University（云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)），2007，27（3）：50－54（in Chinese）.

［13］ GOSSETT D R，MILLHOLLON E P，LUCAS M C，et al.Antioxidant response to NaCl stress in salt tolerant an salt sensitive cultivars of cotton［J］.Crop Sci.，1994，34：706－714.

［14］ BEAUCHAMP C，F(xiàn)RIDOVICH I.Superoxide dismutase：improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］.Anal Biochem.，1971，44：276－287.

［15］ TATIANA Z，YAMASHITA K，MATSUMOTO H，et al.Iron deficiency induced changer in ascorbate content and enzyme activities related to ascorbate metabolism in cucumber roots［J］.Plant and Cell Physiology，1999，40：273－280.

［16］ AEBI H.Catalase in vitro［J］.Methods Enzymol，1984，105：121－126.

［17］ NAKANO Y，ASADA K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate－specific peroxidase in spinach chloroplasts［J］.Plant and Cell Physiology，1981，22（5）：867－880.

［18］ JIANG M Y，ZHANG J H.Effect of abscisic acid on active oxygen species，antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlngs［J］.Plant Cell Pyhsiol.，2001，42：1 265－1 273.

［19］ WANG Y F（王月福），YU ZH W（于振文），LI SH X（李尚霞），et al.Effect of nitrogen nutrition on the change of key enzyme activity during the nitrogen metabolism and kernel protein content in winter wheat［J］.Acta Agronomica Sinica（作物學(xué)報(bào)），2002，28（6）：743－748（in Chinese）.

［20］ CHEN J，WU F H，WANG W H，et al.Hydrogen sulfide enhances photosynthesis through promoting chloroplast biogenesis，photosynthetic enzyme expression，and thiol redox modification in Spinaciaoleraceaseedlings［J］.J.Exp.Bot.，2011，62：4 481－4 493.

［21］ WANG R.Physiological implications of hydrogen sulfide：a whiff exploration that blossomed［J］.Physiol.Rev.，2012，92：791－896.

［22］ ZHANG H，ZHU Q T，LAN Y H，et al.Hydrogen sulfide alleviates aluminum toxicity in germinating wheat seedlings［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2010，52（6）：556－567.

［23］ ZHANG H，JIAN H，JING CX，et al.Hydrogen sulfide protects soybean seedlings against drought－induced oxidative stress［J］.Acta Physiol.Plant，2010，32（5）：849－857.

［24］ ZHANG H，YE H K，WANG S H，et al.Hydrogen sulfide counteracts chlorophyll loss in sweetpotato seedling leaves and alleviates oxidative damage against osmotic stress［J］.Plant Growth Regulation，2009，58（3）：243－250.

［25］ ZHANG H，TANG J，et al.Hydrogen sulfide promotes root organogenesis in Ipompea batatas，Salix matsudanaand Glycine max［J］.J.Integr Plant Biol.，2009，51（12）：1 086－1 094.

［26］ WANG Y Q，LI L，CUI W T.Hydrogen sulfide enhances alfalfa（Medicago sativa）tolerance against salinity during seed germination by nitric oxide pathway［J］.Plant and Soil，2012，351（1－2）：107－119.

［27］ ZHANG H，ZHU Q T，LAN Y H，et al.Hydrogen sulfide alleviates aluminum toxicity in germinating wheat seedlings［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2010，52（6）：556－567.

［28］ SHAN C J，DAI H P，SUN Y F，et al.Hydrogen sulfide protects wheat seedlings against copper stress by regulating the ascorbate and glutathione metabolism in leaves［J］.Australian Journal of Crop Science，2012，6（2）：248－254.

［29］ BHNRWANA S A，ALI S，F(xiàn)AROOQ M A，et al.Hydrogen sulfide ameliorates lead－induced morphological，photosynthetic，oxidative damages and biochemical changes in cotton［J］.Environ Sci.Pollut Res.，2014，21（1）：717－731.

［30］ SUN F F（孫菲菲），WANG D SH（王東升），CHEN H（陳 歡），et al.Effect of nitrogen metabolism in the leaves of pakchoi under NaCl stress［J］.Journal of Jiangsu Agricultural Sciences（江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)），2012，40（4）：160－162（in Chinese）.

［31］ ZHAO F G（趙福庚），LIU Y L（劉友良）.Advances in study on metabolism and regulation of proline in higher plants under stress［J］.Chinese Bulletin of Botany（植物學(xué)通報(bào)），1999，16（5）：540－546（in Chinese）.

［32］ LI F（李 飛），YANG T ZH（楊鐵釗），ZHANG X Q（張小全），et al.Flue－cured tobacco nitrogen metabolism differences and its influence on aroma precursors in different amount of nitrogen［J］.Acta Agricultural Boreali－Sinica（華北農(nóng)學(xué)報(bào)），2014，39（1）：170－177（in Chinese）.

［33］ 李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2002：221－222.

［34］ JIN ZH P，PEI Y X.Research progress on hydrogen sulfide signaling in plants［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2013，35（6）：20－29.

［35］ ZHANG H，DOU W，JIANG C X，et al.Hydrogen sulfide stimulatesβ－amylase activity during early stages of wheat grain germination［J］.Plant Signal Behav.，2010，5（8）：1 031－1 033.

（編輯：裴阿衛(wèi)）

Effect of Exogenous NaHS on the Physiological and Biochemical Characteristics of Tomato Seedlings under NO3－Stress

JING Juwei1，LI Shun1，ZHAO Yan2，BAI Xuegui1，CHEN Xuanqin1，LI Kunzhi1，XU Huini1＊
（1College of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2College of Basic Science and Information Engineering，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

The study investigated the effect of gas transmitter H2S（by adding H2S donor NaHS）on the physiological and biochemical characteristics of hydroponic growth tomato seedlings under nitrate stress.The result showed that：（1）with the increasing nitrate stress treatment time，the shoot height，root length，fresh weight and dry weight，chlorophyll a and b contents，net photosynthetic rate，gas conductance and transpiration rate decreased significantly，while the intracellular CO2concentration，the MDA and H2O2contents increased.The activities of superoxide dismutase，catalase，peroxidase，and ascorbate peroxidase and the antioxidant substances of ascorbate and GSH contents decreased after nitrate stress treatment.（2）When NaHS was added，the shoot height，root length，fresh weight and dry weight，chlorophyll a and b contents，net photosynthetic rate，gas conductance and transpiration rate increased significantly after NaHS added for 1，3，5days，while the intracellular CO2concentration decreased，compared with the nitrate stresstreatment alone.The MDA and H2O2contents decreased，while the antioxidant enzyme activities of superoxide dismutase，catalase，peroxidase，and ascorbate peroxidase increased，besides，the antioxidant substances of ascorbate and GSH contents increased after NaHS was added.The activities of nitrate reductase，glutathione synthetase，and glutamate synthase increased after NaHS was added.NaHS treatment stimulated the increase of L－desulfhydrase activity，which in turn induced accumulation of H2S content.These results indicate that the alleviation of the nitrate stress damage on tomato by H2S might be fulfilled through increasing the antioxidant enzyme activities and the antioxidant substances contents.

soil secondary salinization；hydrogen sulfide；photosynthetic characteristics；nitrogen metabolism；antioxidant enzyme

Q945.78

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1173

1000－4025（2015）06－1173－09

2015－01－25；修改稿收到日期：2015－06－02

國家自然科學(xué)基金（31101557，31460526）

景舉偉（1983－），男，在讀碩士研究生，主要從事植物營養(yǎng)與基因工程研究。E－mail：jingjuwei＠126.com

＊通信作者：徐慧妮，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜逆境生理及分子生物學(xué)研究。E－mail：hnxusun＠126.com