蔣景龍，蔣 超，沈季雪，徐衛(wèi)平

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001）

五加科植物發(fā)狀根誘導(dǎo)研究進(jìn)展

蔣景龍，蔣 超，沈季雪，徐衛(wèi)平

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001）

五加科植物多為重要的中藥材，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科藥用植物產(chǎn)生發(fā)狀根，并從中獲取有用的次生代謝產(chǎn)物，是保護(hù)五加科珍稀藥用植物資源和實(shí)現(xiàn)有效次生代謝物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。該文在概述發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化藥用植物研究歷程和轉(zhuǎn)化機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，對(duì)近年來(lái)在發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物的種類(lèi)及誘導(dǎo)率、影響發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物的各種因素和利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物獲得再生植株等方面研究進(jìn)行了重點(diǎn)分析，并對(duì)今后亟需研究的幾個(gè)重點(diǎn)方向進(jìn)行了展望，以期為五加科藥用植物的良性開(kāi)發(fā)和合理利用提供參考。

五加科；發(fā)根農(nóng)桿菌；冠癭堿；乙酰丁香酮；誘導(dǎo)率

五加科（Araliaceae）植物約有80屬900余種，僅中國(guó)就有23屬160余種［1］。已知可供藥用的植物有114種（包括20個(gè)變種，1個(gè)變型），其中不乏多種名貴中藥材，如人參（Panax ginseng）、西洋參（P.quiquefolium）、三七（P.notoginseng）、細(xì)柱五加（Eleutherococcus nodiflorus）、東北刺人參（Oplopana elatus）、刺五加（Eleutherococcus senti－cosus）和龍牙楤木（Aralia mandshrica）等。近年研究表明，五加科植物大多具有抗腫瘤、抗衰老、降血脂、活血補(bǔ)氣和利脾補(bǔ)腎等醫(yī)藥作用［2］。五加科藥用植物多為多年生，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，野生資源遭受無(wú)計(jì)劃采挖，不少名貴藥材已瀕臨絕跡［3］。為保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用這些藥材，常利用人工栽培和組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行引種擴(kuò)繁，但組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)周期長(zhǎng)、藥用次生代謝物含量不穩(wěn)定以及再生苗成活率較低等因素都極大地限制了該技術(shù)的工業(yè)化發(fā)展。隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生毛狀根，并對(duì)毛狀根進(jìn)行離體培養(yǎng)，大量提取重要藥用成分，是藥用植物資源可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。

發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）屬于根瘤菌科（Rhizobitaceae）農(nóng)桿菌屬（Agrobactedum）革蘭氏陰性菌，能侵染絕大多數(shù)的雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子植物，使植物合成冠癭堿并產(chǎn)生許多不定根。這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分支成毛狀，故稱(chēng)之為發(fā)根或毛狀根。發(fā)狀根是由發(fā)根農(nóng)桿菌含有的Ri質(zhì)粒引起的［4］。發(fā)狀根具有生長(zhǎng)快速、自身合成植物激素、遺傳性狀和生化特性穩(wěn)定、合成次生代謝物質(zhì)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，更重要的是，發(fā)狀根的次生代謝物的含量不僅更高，而且還能產(chǎn)生某些植物愈傷組織所不能合成的有效成分。本文就發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化藥用植物研究進(jìn)程、發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)制、發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物種類(lèi)、誘導(dǎo)條件的優(yōu)化和五加科再生植株誘導(dǎo)方面的研究做了綜述，以期為五加科藥用植物的良性開(kāi)發(fā)和合理利用提供參考。

1 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化藥用植物研究歷程

1987年，日本學(xué)者Yoshikawa等［5］首次通過(guò)人參愈傷組織成功誘導(dǎo)出了發(fā)根。2001年，王沖之等［6］以西洋參胚為材料，用含Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌及經(jīng)過(guò)胡蘿卜提取液處理的菌株感染的無(wú)菌苗切段，在含6mg／L萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得了發(fā)根。劉峻等［7］利用含Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌感染人參，首次從人參的帶葉幼莖部位誘導(dǎo)出發(fā)狀根，并利用PCR證實(shí)Ri質(zhì)粒攜帶的rolc序列已整合到人參轉(zhuǎn)化株的染色體中。2003年，Seo等［8］分別用刺五加的下胚軸和胚根均誘導(dǎo)出發(fā)狀根，且前者誘導(dǎo)率更高。2005年，于樹(shù)宏等［9］通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)虎杖進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)其成熟葉片的發(fā)狀根平均誘導(dǎo)率為55.66%。2008年，王偉等［10］發(fā)現(xiàn)用發(fā)根農(nóng)桿菌R15834誘導(dǎo)喜樹(shù)胚軸能獲得30.83%誘導(dǎo)率。2012年，蘆韋華等［11］以新疆紫草為材料，采用二階段液體培養(yǎng)法首次建立了新疆紫草發(fā)狀根培養(yǎng)技術(shù)體系。2013年Danijela等［12］用百金花屬植物也誘導(dǎo)出了發(fā)狀根。2014年Veremeichik等［13］建立了茜草的發(fā)根轉(zhuǎn)化體系。2015年Dmitrovic等［14］用綠藜誘導(dǎo)出發(fā)根且測(cè)得其總酚代謝量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型植株。到目前為止，國(guó)內(nèi)外己有30余科40個(gè)屬［15］的藥用植物如人參（Panax ginseng）、丹參（Salvia miltiorrhiza）、絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）、紅花亞麻（Linum grandiflora）、青蒿（Artemisia carvifolia）、新疆雪蓮（Saussurea involucrata）、王不留行（Vaccaria segetalis）、秦艽（Gentiana macrophylla）、積雪草（Centella asiatica）以及何首烏（Fallopia multiflorum）等的發(fā)狀根誘導(dǎo)獲得成功［16－18］。

2 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)理

Ri質(zhì)粒是位于發(fā)根農(nóng)桿菌染色體之外的獨(dú)立的雙鏈環(huán)狀DNA，一般在180～250kb之間［19］。Ri質(zhì)粒主要有復(fù)制起始區(qū)（Ori區(qū)）、接合轉(zhuǎn)移區(qū)、冠癭堿分解區(qū)和2個(gè)主要功能區(qū)［轉(zhuǎn)移區(qū)（T－DNA區(qū)）和致病區(qū)（Vir區(qū)）］等幾部分。其中T－DNA區(qū)是一段不連續(xù)的DNA，依次包括TL－DNA區(qū)、生長(zhǎng)素區(qū)、激動(dòng)素區(qū)、冠癭堿區(qū)和TR－DNA區(qū)（圖1，A），Vir區(qū)主要編碼T－DNA轉(zhuǎn)入并整合到植物基因組上的各種功能性蛋白（圖1，B）。

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物產(chǎn)生發(fā)狀根的過(guò)程可以概括為5個(gè)階段9個(gè)步驟（圖1，C）。第一階段為信號(hào)的產(chǎn)生和接收。植物受傷處的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一些糖類(lèi)或酚類(lèi)如乙酰丁香酮等物質(zhì)，農(nóng)桿菌識(shí)別和接收這些小分子信號(hào)物質(zhì)，然后產(chǎn)生纖維絲吸附在易感染的植物細(xì)胞上。同時(shí)，農(nóng)桿菌形態(tài)因誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用向線形轉(zhuǎn)變，線形的一端附著于植物細(xì)胞表面。第二為T(mén)－DNA復(fù)合體的初加工階段。信號(hào)分子進(jìn)入發(fā)根農(nóng)桿菌后，VirA和VirG2蛋白組成雙組分信號(hào)系統(tǒng)，激活靶向在T－DNA邊界序列的限制性?xún)?nèi)切酶VirD1和VirD2，T－DNA在二者的剪切下邊界序列脫落，同時(shí)釋放單鏈T－DNA（ssTDNA）。然后，VirD2以極性共價(jià)鍵的方式附著在ssT－DNA的5′端，形成不成熟的T－DNA前體。第三階段為T(mén)－DNA前體進(jìn)入植物細(xì)胞胞質(zhì)。VirB和VirD4等效應(yīng)蛋白將T－DNA前體包裹在VirF的效應(yīng)下通過(guò)IV型分泌系統(tǒng)以線性的方式穿過(guò)2層細(xì)胞膜“注射”到植物細(xì)胞胞質(zhì)中，隨后VirF、VirE2、VirE3和VirD5蛋白也以同樣的方式進(jìn)入植物細(xì)胞。第四階段為T(mén)－DNA由胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。單鏈的T－DNA前體與VirE2蛋白結(jié)合，高度螺旋化形成成熟的雙鏈T－DNA，在VirD2和VirE2蛋白核定位信號(hào)的作用下移向細(xì)胞核，VirE3發(fā)揮作用保護(hù)T－DNA免受核酸酶的降解，VirF和T－DNA復(fù)合體經(jīng)過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入到細(xì)胞核中。第五階段為T(mén)－DNA的整合與表達(dá)。在VirD2和VirE2等蛋白的定位下，T－DNA復(fù)合體靶向植物染色體特定區(qū)域并與之結(jié)合，同時(shí)Vir蛋白從T－DNA復(fù)合體上解離，而T－DNA整合到宿主基因組中。T－DNA上攜帶的外源基因表達(dá)并合成冠癭堿、生長(zhǎng)素和激動(dòng)素等物質(zhì)以促進(jìn)發(fā)狀根的形成［20－22］。

圖1 發(fā)根農(nóng)桿菌的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)根機(jī)制（根據(jù)Pacurar［21］圖示改進(jìn)）發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的9個(gè)步驟為：1.受傷的植物細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)分子；2.信號(hào)分子被發(fā)根農(nóng)桿菌識(shí)別、接受；3.發(fā)根農(nóng)桿菌吸附在細(xì)胞表面；4.激活Vir蛋白加工ssT－DNA。5.形成不成熟的T－DNA復(fù)合體；6.T－DNA進(jìn)入細(xì)胞；7.裝配成熟的T－DNA復(fù)合體和核輸入；8.T－DNA整合到植物基因組中；9.發(fā)根農(nóng)桿菌基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成Fig.1 Transformation mechanism of A.rhizogenes（modification based on the diagram described by Pacurar［21］）The 9transformation steps of A.rhizogenes：1.Wounded plant cell produces signal molecules；2.Signal molecules are recognized by the bacterial receptors；3.A.rhizogenes attaches to the plant cell；4.Activated Vir proteins process the ss T－DNA；5.Formation of the immature T－complex；6.T－DNA transfer；7.Assembly of the mature T－complex and nuclear import；8.Random T－DNA integration in the plant genome；9.Expression of the bacterial genes and synthesis of bacterial proteins

3 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物種類(lèi)及誘導(dǎo)率的研究

目前，已有近百種藥用植物成功誘導(dǎo)出發(fā)狀根，但五加科藥用植物誘導(dǎo)比例僅為2.7%［23］，其中人參、西洋參、竹節(jié)參、龍牙揔木和刺五加等已成功誘導(dǎo)出發(fā)狀根，且誘導(dǎo)率隨種類(lèi)、外植體和菌種的不同呈現(xiàn)一定的差異性（表1）。

3.1 人參

Jeong等［24］利用農(nóng)桿菌KTCT2744轉(zhuǎn)化人參的參根片誘導(dǎo)出發(fā)狀根，在一定條件下培養(yǎng)，生命力旺盛，生長(zhǎng)良好。趙壽經(jīng)等［25］選取2年生人參的參根，用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株感染參根片，成功獲得了人參發(fā)根且誘導(dǎo)率為18.3%，而郜玉鋼等［26］選用3年生的人參根通過(guò)同樣方法也誘導(dǎo)出了發(fā)狀根，但未報(bào)道誘導(dǎo)率。據(jù)報(bào)道一些研究員［8］用發(fā)根農(nóng)桿菌R15834菌株處理帶葉和不帶葉的人參幼莖也能誘導(dǎo)出發(fā)狀根，誘導(dǎo)率為8.0%～28.0%，而用菌株R1610、LBA918、R1000、A4、R15834處理人參根的薄壁組織、子葉、真葉、無(wú)菌苗卻沒(méi)有獲得發(fā)狀根。在上述研究中，只有菌株KTCT2744、R15834和A4可轉(zhuǎn)化人參發(fā)狀根，且不同外植體誘導(dǎo)率高低依次為：帶葉幼莖＞參根片＞幼莖，說(shuō)明不同發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)人參的不同部位敏感性不同，可能KTCT2744、A4和R15834分別對(duì)人參的根片和幼莖的較為敏感。發(fā)狀根是在外植體的生理下端形成，所以參根片的誘導(dǎo)率高于幼莖，而葉片內(nèi)源性激素類(lèi)物質(zhì)的運(yùn)輸也有助于發(fā)狀根生成。

3.2 西洋參

趙壽經(jīng)等［27］和賈冬梅等［28］用A4菌液以西洋參的參根片、莖和葉作為外植體誘導(dǎo)發(fā)狀根，只有參根片上長(zhǎng)出白色發(fā)根，誘導(dǎo)率最大為15.9%，謝海云等［29］用R1601誘導(dǎo)葉片和幼莖，1塊外植體上長(zhǎng)出了1條或幾條的發(fā)狀根。王沖之等［30］用R15834誘導(dǎo)葉柄、葉片和子葉，發(fā)現(xiàn)子葉未誘導(dǎo)出發(fā)根，葉的誘導(dǎo)率僅為4.8%，而葉柄誘導(dǎo)率最高達(dá)到了33.3%。我們分別用A4菌液和GIM菌液感染2年生的西洋參參根、西洋參無(wú)菌苗的子葉、下胚軸和1.0mg／L 2，4－D誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，子葉次之，參根的誘導(dǎo)率最低，同時(shí)A4菌液誘導(dǎo)率比GIM菌液的要高（實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未發(fā)表）。上述研究表明：R1601、A4、R15834對(duì)西洋參不同外植體的誘導(dǎo)率高低依次為：葉柄＞參根片＞葉，這可能是因?yàn)槿~柄細(xì)胞再生能力強(qiáng)，有明顯的創(chuàng)傷反應(yīng)，傷口附近的細(xì)胞較易脫分化形成較多的感受態(tài)細(xì)胞和發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)根細(xì)胞較強(qiáng)的特異性以及根的創(chuàng)傷反應(yīng)等因素造成的。

3.3 其他種類(lèi)

除人參和西洋參外，廣大學(xué)者對(duì)五加科其他植物種類(lèi)發(fā)狀根的誘導(dǎo)也有研究。張來(lái)等［31］用改造的發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1處理竹節(jié)參的地上莖部分，發(fā)現(xiàn)傷口處長(zhǎng)出發(fā)狀根，其誘導(dǎo)率高達(dá)90.0%。Kang等［32］用R15834菌誘導(dǎo)龍牙揔木的根和葉柄，誘導(dǎo)率分別為26.7%和10.0%，而在無(wú)R15834感染的根和葉柄中均未發(fā)現(xiàn)發(fā)根的形成。羅麗等［33］用C58C1和R1601接種刺五加均未誘導(dǎo)出發(fā)狀根，但用R15834卻成功的誘導(dǎo)出發(fā)根，且誘導(dǎo)率為10.0%，再以R15834菌株作為試驗(yàn)菌株，對(duì)刺五加葉片、莖段、葉柄進(jìn)行感染，發(fā)現(xiàn)葉片的誘導(dǎo)率最高為16.0%，其次是葉柄為12.0%，莖段最低為10.0%。從以上研究可以看出：發(fā)根農(nóng)桿菌R15834和C58C1對(duì)五加科不同種類(lèi)的外植體敏感性明顯不同，其大小為：竹節(jié)參＞龍牙揔木＞刺五加，而與人參和西洋參不同的是：刺五加的葉片、龍牙揔木的根和竹節(jié)參的地上莖都表現(xiàn)出了較高的誘導(dǎo)率，而葉柄的誘導(dǎo)率并不太高，這可能與五加科植物的種間差異性有關(guān)。

表1 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物種類(lèi)及誘導(dǎo)率Table 1 Species and induction rate of Araliaceae plant induced by A.rhizogenes

4 影響發(fā)狀根誘導(dǎo)的因素

近年來(lái)，人們開(kāi)始關(guān)注發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)五加科發(fā)狀根誘導(dǎo)率的研究，以獲取優(yōu)質(zhì)品系和大量有用的次生代謝產(chǎn)物。眾所周知，在誘導(dǎo)五加科發(fā)狀根的過(guò)程中，不同菌株及菌液濃度、外植體取材部位、處理方式、預(yù)（共）培養(yǎng)時(shí)間、不同濃度的激素和乙酰丁香酮以及不同光照條件等因素都影響發(fā)狀根的誘導(dǎo)率，故優(yōu)化誘導(dǎo)條件對(duì)提高五加科誘導(dǎo)率至關(guān)重要。

4.1 不同菌株及菌液濃度

目前，誘導(dǎo)五加科藥用植物發(fā)狀根的常用菌株主要有A4、R15834、C58C1、R1601、KCTC 2744、LBA918和R1000等7種（表2）。在已誘導(dǎo)出的五加科植物發(fā)狀根中，33%使用的是A4菌株，22%使用的是發(fā)根農(nóng)桿菌R15834，14%使用的R1601，其余菌株的使用均在10%以?xún)?nèi)，眾多學(xué)者的研究表明：A4和R15834菌株對(duì)五加科發(fā)狀根誘導(dǎo)率更高，且穩(wěn)定性更好，但張來(lái)等［31］用改良的C58C1菌處理竹節(jié)參，發(fā)根誘導(dǎo)率高達(dá)90%。除了菌株種類(lèi)之外，其濃度也影響發(fā)狀根的誘導(dǎo)率，大多學(xué)者以菌液濃度OD600＝0.6來(lái)轉(zhuǎn)化外植體，羅麗等［33］發(fā)現(xiàn)：當(dāng)OD600＜0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化率隨著菌液OD600值的增加而急劇上升，當(dāng)OD600＝0.6左右轉(zhuǎn)化率最高；而菌液濃度OD600值達(dá)到0.8后，若再增大菌液濃度，此時(shí)轉(zhuǎn)化率又呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，也有關(guān)于以每毫升菌液107個(gè)、OD600＝0.01和OD600＝1.0等濃度轉(zhuǎn)化外植體，其誘導(dǎo)率較高的報(bào)道［8，25，32］。

4.2 外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和感染時(shí)間

農(nóng)桿菌感染外植體后，傷口處的細(xì)胞因?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)而導(dǎo)致褐化，嚴(yán)重影響發(fā)根的形成及轉(zhuǎn)化率。將過(guò)夜培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌加入新鮮的YEB液體培養(yǎng)基中，置于（180±20）r／min的搖床上，（25± 2）℃，0～4d［27，29，30，33］的預(yù)培養(yǎng)，能夠較好地解決褐化問(wèn)題，并且能夠改變外植體的轉(zhuǎn)化率。共培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短與轉(zhuǎn)化頻率相關(guān)，這是因?yàn)榘l(fā)根農(nóng)桿菌的TDNA轉(zhuǎn)移與整合需要一定的時(shí)間，共培養(yǎng)時(shí)間不足，則不能完成T－DNA轉(zhuǎn)移與整合，發(fā)狀根的轉(zhuǎn)化不能實(shí)現(xiàn)，延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間能提高轉(zhuǎn)化頻率。張來(lái)等［31］用C58C1菌液浸染竹節(jié)參地上幼嫩莖段時(shí)發(fā)現(xiàn)，在0～5min，無(wú)法誘導(dǎo)出發(fā)狀根，5～35min，均能誘導(dǎo)出發(fā)狀根，但在5～25min，誘導(dǎo)率隨時(shí)間呈正相關(guān)，而在25～35min，誘導(dǎo)率卻逐漸降低，25 min為最佳，誘導(dǎo)率為90%。羅麗等［33］在研究刺五加的發(fā)狀根誘導(dǎo)條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時(shí)間處在0～4 d之間時(shí)，轉(zhuǎn)化率隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為4d時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高為14%。共培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)4d后，轉(zhuǎn)化率急劇下降。王沖之等［30］用R15834菌誘導(dǎo)西洋參發(fā)根時(shí)，發(fā)現(xiàn)3d是最佳的共培養(yǎng)時(shí)間，而且發(fā)狀根多分枝，且生長(zhǎng)十分旺盛。而劉峻等［34］采用共培養(yǎng)30d也誘導(dǎo)出了人參的發(fā)狀根。

4.3 外源植物激素、抗生素及乙酰丁香酮（As）

在共培養(yǎng)階段加入適量的外源植物激素對(duì)轉(zhuǎn)化有一定的影響。萘乙酸（NAA）、激動(dòng)素（KT）和油菜素類(lèi)脂（BL）對(duì)發(fā)狀根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，王沖之等［30］用添加1mg／L 2，4－D、0.1mg／L KT的MS培養(yǎng)基，未能誘導(dǎo)出發(fā)狀根，而使用添加6mg／L NAA的MS培養(yǎng)基進(jìn)行農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)，成功地獲得了發(fā)狀根。劉峻等［34］發(fā)現(xiàn)在含NAA、KT的條件下，外植體的愈傷化程度最高，分裂態(tài)細(xì)胞最多，轉(zhuǎn)化率也最高，達(dá)到58%。周倩耘等［35］發(fā)現(xiàn)BL單獨(dú)使用時(shí)，在低濃度下即表現(xiàn)出促進(jìn)生長(zhǎng)的活性。BL濃度為0.001mg／L時(shí)，誘導(dǎo)發(fā)根效果顯著，其與不同濃度的吲哚丁酸（IBA）也表現(xiàn)出協(xié)同作用。乙酰丁香酮（AS）是一種酚類(lèi)化合物，可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達(dá)。羅麗等［33］發(fā)現(xiàn)，As能有效地提高刺五加發(fā)狀根的轉(zhuǎn)化頻率，當(dāng)As濃度處在0～400μmol／L時(shí)，轉(zhuǎn)化率逐漸上升，當(dāng)As濃度達(dá)到400μmol／L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大達(dá)到24%，As濃度的進(jìn)一步加大，其轉(zhuǎn)化率呈急劇下降的趨勢(shì)。

4.4 其他

影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素還有很多，例如培養(yǎng)基的類(lèi)型、pH、培養(yǎng)溫度和光照等對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。王沖之等［30］研究表明西洋參發(fā)狀根在SJ－1和B5培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況較好，且發(fā)狀根在B5增長(zhǎng)速度較SJ－1高。孫彬賢等［36］發(fā)現(xiàn)人參發(fā)狀根以MS為培養(yǎng)基，培養(yǎng)6周后收獲較為合適。

表2 菌液濃度對(duì)發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響Table 2 Effect of different concentrations of A.rhizogenes on induction rate of hairy roots

5 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科再生植株的研究及展望

迄今，廣大學(xué)者對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)藥用植物發(fā)根的產(chǎn)生已進(jìn)行了大量研究，但通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物獲得再生植株的報(bào)道較少。2009年，王建華［37］以人參、西洋參發(fā)根為外植體通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑均獲得了再生植株，并證實(shí)了他們的體細(xì)胞胚途徑經(jīng)歷了類(lèi)似合子胚的過(guò)程，且在基因表達(dá)上存在明顯差異性。2011年，謝海云等［29］通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出西洋參的發(fā)狀根，由間接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)出不定芽，最終獲得了再生植株。以發(fā)狀根為外植體通過(guò)體細(xì)胞胚或者器官發(fā)生途徑獲得五加科再生植株目前還只是出于初級(jí)階段。

近年來(lái)，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)五加科藥用植物方面研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，尤其是在人參、西洋參的發(fā)狀根誘導(dǎo)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)方面進(jìn)行了大量研究，但距離大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還有一定差距。在今后的研究中，以下幾個(gè)方面應(yīng)該得到更多的關(guān)注：（1）發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的改進(jìn)與發(fā)掘。近年來(lái)，隨著農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞機(jī)制的研究不斷取得突破，可以設(shè)計(jì)新的方法和技術(shù)來(lái)控制DNA整合，發(fā)掘出適合不同植物并提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的遺傳轉(zhuǎn)化新工具［38］。例如，已發(fā)現(xiàn)的超毒農(nóng)桿菌菌株可以通過(guò)產(chǎn)生并向寄主細(xì)胞輸送某些蛋白而提高侵染力，這些蛋白是易轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞因子的衍生物，為那些難轉(zhuǎn)化植物帶來(lái)了曙光。（2）發(fā)狀根誘導(dǎo)條件方面研究。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)五加科植物的效率普遍不高，需要改變誘導(dǎo)條件、誘導(dǎo)方式，建立高效的轉(zhuǎn)化體系，最大限度地提高發(fā)狀根的誘導(dǎo)率。同時(shí)不斷篩選高產(chǎn)、生長(zhǎng)快速、耐剪切力的單克隆發(fā)狀根無(wú)性系為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。（3）目前，藥用植物發(fā)狀根前期誘導(dǎo)和培養(yǎng)的報(bào)道居多，進(jìn)行培養(yǎng)工藝優(yōu)化方面的研究較少，嚴(yán)重地制約了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。一些物理因素（如光強(qiáng)、溫度）和化學(xué)因素（如培養(yǎng)基、碳源、氮源、激素、前體、誘導(dǎo)子等）、生物反應(yīng)器的類(lèi)型等均會(huì)對(duì)發(fā)狀根的增殖和次生代謝物質(zhì)的合成產(chǎn)生影響。因此，應(yīng)該在發(fā)狀根發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化方面需要進(jìn)行重點(diǎn)研究。

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（編輯：宋亞珍）

Advances in Studies on Hairy Roots Induction of Araliaceae

JIANG Jinglong，JIANG Chao，SHEN Jixue，XU Weiping
（School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001，China）

Most of Araliaceae plants are important medicinal herbs.Agrobacterium rhizogenes have been used to induce plants of Araliaceae produced hair root，in which the important secondary metabolites are obtained.It is one of the effective ways to protect rare medicinal resources of Araliaceae plant and to achieve effective industrial production of secondary metabolites.In this paper，an overview of rhizogenes transformation history and transformation mechanism in medicinal plants is given as the basis.Meanwhile the present researches on species and induction rate，various factors and regeneration plants in Araliaceae plants induced by rhizogenes are analyzed.In addition，some suggestions on further research in several key fields are presented.All above will provide a reference for the exploiting and developing medicinal plant in Araliaceae.

Araliaceae；Agrobacterium rhizogenes；opine；acetosyringone；induction rate

Q813.1；Q949.763.2

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1276

1000－4025（2015）06－1276－07

2015－01－13；修改稿收到日期：2015－04－16

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（2014JQ3113）；陜西省教育廳自然科學(xué)研究（14JK1158）；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（SLGYCX1422）

蔣景龍（1980－），男，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事西洋參無(wú)性快速繁殖與發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究。E－mail：jiangjinglong511＠163.com